甲狀腺癌鐵死亡預(yù)后風險模型的構(gòu)建及其潛在機制的生物信息學分析

楊仁義, 彭書旺, 王永恒, 董宇軒, 段姍姍

（1.湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院胃腸甲狀腺血管外科，湖南 長沙 410007；2.湖南中醫(yī)藥大學研究生院，湖南 長沙 410208）

國家癌癥中心發(fā)布的《2022 年全國癌癥報告》［1］顯示：甲狀腺癌（thyroid cancer，TC）新發(fā)病例為20.3 萬人，其中女性新發(fā)病例（15.3 萬人）明顯高于男性（5.0 萬人），是發(fā)病率最高的內(nèi)分泌惡性腫瘤，也是發(fā)病率上升最快且位列第7 位的常見惡性腫瘤。95%的TC 為分化型TC，外科手術(shù)是目前首選的治療方式，同時放射性碘治療（radioactive iodine，RAI）和內(nèi)分泌輔助治療也是提高患者生存預(yù)后和生活質(zhì)量的有效手段［2-3］，但治療后遠期復(fù)發(fā)率仍較高，針對免疫檢查點或分子靶向治療藥物開發(fā)大多數(shù)僅停留在療效觀察階段［4-5］，尚未取得分子機制層面的突破。因此，研究TC 潛在的分子機制，尋找預(yù)后生存的生物標志物和治療靶點，構(gòu)建有價值的預(yù)后評估模型是亟待解決的問題。鐵死亡是一種主要依賴于鐵介導(dǎo)的氧化損傷和隨后的細胞膜損傷的調(diào)節(jié)性細胞死亡方式［6］，可通過外源性或轉(zhuǎn)運蛋白依賴，以及內(nèi)源性或酶調(diào)節(jié)2 條主要途徑啟動，同時受鐵積累增加、自由基產(chǎn)生、脂肪酸供應(yīng)和脂質(zhì)過氧化共同調(diào)控［7］，在一定程度上抑制TC細胞的增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移。研 究［8-10］顯 示：鐵 死 亡 相 關(guān) 基 因（ferroptosisrelated genes，F(xiàn)RGs）是TC 預(yù)后分子及潛在治療靶點，能精準預(yù)測TC 患者生存預(yù)后，有效指導(dǎo)TC 患者的個體化治療。WANG 等［11］鑒定出醛酮還原酶家族1 成員 C3 （Aldo-Keto reductase family 1 member C3，AKR1C3）、BH3 相互作用域死亡激動劑（BH3 interacting domain death agonist，BID）、F-Box和 WD-40結(jié)構(gòu)域蛋白7（F-Box and WD repeat domain containing 7，F(xiàn)BXW7）、谷胱甘肽過氧化物酶4 （glutathione peroxidase 4，GPX4）和絲裂原活化蛋白激酶激酶5（mitogen-activated protein kinase kinase kinase 5，MAP3K5）具有預(yù)后價值，同時敲低AKR1C3 可增強TC 細胞的增殖、侵襲和遷移能力，為TC 預(yù)后預(yù)測提供了新思路，但未對其相關(guān)分子機制進行深入探討。本研究采用生物信息學方法，提取GeneCards 和FerrDb 數(shù)據(jù)庫中FRGs，篩選TC 差異預(yù)后鐵死亡相關(guān)基因（prognosis and ferroptosis related genes，PFRGs），構(gòu)建風險評分及預(yù)后模型，評估TC患者生存預(yù)后，進行共表達及富集分析，研究TC的FRGs調(diào)控網(wǎng)絡(luò)及作用機制。

1 資料與方法

1.1 TC 差 異 預(yù) 后 基 因（TC-differentiallyprognostic gene，TC-DPGs）獲取數(shù)據(jù)來源：從TCGA 數(shù)據(jù)庫（https：//portal.gdc.cancer.gov/）下載TCGA-THCA 隊列中TC 轉(zhuǎn)錄組及臨床數(shù)據(jù)。差異分析：采用R 軟件DESeq2 包［12］，對TCGATHCA 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行差異分析，以|log2FC|>1且校正P<0.05 為篩選條件，篩選TC 差異表達基因 （thyroid cancer differentially expressed genes，TC-DEGs）。預(yù) 后 分 析：采 用R 軟件survminer 包和survival 包［13］，對TCGA-THCA 臨 床 數(shù) 據(jù) 進 行預(yù)后分析，以TC 患者總生存（overall survival，OS）時間為預(yù)后參數(shù)，以Cox 回歸P<0.05 為篩選條件進行單因素Cox 回歸分析，篩選TC 預(yù)后基因（TC prognosis gene，TC-PGs）。通過韋恩圖在線取交集工具（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）取“TC-DEGs”與“TCPGs”兩者的交集，獲取TC-DPGs。

1.2 TC 差異PFRGs 篩選數(shù) 據(jù) 來 源：通 過GeneCards 數(shù) 據(jù) 庫 （https：//www.genecards.org/）［14］，以“Ferroptosis”為 檢 索 詞，同 時 從FerrDb 數(shù) 據(jù) 庫 （http：//www.zhounan.org/ferrdb）［15］下載FRGs，整合2 個數(shù)據(jù)庫基因，最終獲取FRGs。通過韋恩圖在線取交集工具，取“TC-DPGs”與“FRGs”交 集，獲 取TC 差 異PFRGs。

1.3 TC 差異PFRGs 表達分析數(shù)據(jù)來源：從TCGA 數(shù)據(jù)庫下載TCGA-THCA 隊列中TC 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，從GTEx 數(shù)據(jù)庫（https：//gtexportal.org/home/）下載正常甲狀腺組織表達數(shù)據(jù)。將TCGA 數(shù)據(jù)庫中癌旁組織樣本與GTEx 數(shù)據(jù)庫中正常甲狀腺組織樣本作為對照組，將TCGA 數(shù)據(jù)庫中TC 組織樣本作為腫瘤組，進行非配對樣本秩和檢驗；對包含腫瘤組織與癌旁組織的患者樣本進行配對樣本秩和檢驗，比較腫瘤組與對照組TC 差異PFRGs ［CD44、膜 聯(lián) 蛋 白A1 （Annexin A1，ANXA1）和 核 受 體 亞 家 族4A 類 成 員1 （nuclear receptor sub family 4 group A mumber 1，NR4A1）］表達的差異。為進一步分析TC 差異PFRGs（CD44、ANXA1 和NR4A1）蛋白在組織中表達情況，通過人類蛋白圖譜（The Human Protein Atlas，HPA）數(shù) 據(jù) 庫［16］（https：//www.proteinatlas.org/），檢索CD44、ANXA1 和NR4A1蛋白的免疫組織化學切片圖像，比較腫瘤組織與正常組織蛋白表達差異。

1.4 TC 差異PFRGs 生存預(yù)后分析采用R 軟件timeROC 包，繪制時間依賴性受試者工作特征（time-receiver operating characteristic，time-ROC）曲線，分別評估TC 差異PFRGs CD44、ANXA1和NR4A1 對TC 患者的1、3 和5 年生存預(yù)測效能。當ROC 曲線下面積（area under curve，AUC）>0.5 時，AUC 越 接 近1，對TC 患 者 的1、3 和5 年生存預(yù)測效能越好，分子的表達促進死亡發(fā)生；當AUC<0.5時，AUC越接近0，對TC患者的1、3 和5年生存預(yù)測效能越好，分子的表達促進生存發(fā)生。采用R 軟件survival 包和survminer 包，繪制Kaplan-Meier 曲線，根據(jù)基因表達的中位數(shù)分為高表達和低表達2 組，分別評估TC 差異PFRGs CD44、ANXA1 和NR4A1 對TC 患者生存狀況的影響。

1.6 TC 差異PFRGs Nomogram 圖構(gòu)建及驗證采用R 軟件rms 包，使用多因素Cox 回歸分析方法建立Nomogram 預(yù)后模型，以評估和預(yù)測TC患者OS 的概率［17］。綜合分析“1.5”中單因素Cox 回歸分析結(jié)果，納入多因素Cox 回歸分析中P<0.05 的臨床特征作為因子，構(gòu)建預(yù)測TC 患者1、3 和5 年OS 概率的Nomogram 預(yù)后模型。采用R 軟件rms 包和survival 包，對Nomogram 預(yù)后模型進行Calibration 分析驗證，以評估Nomogram 預(yù)后模型的預(yù)測能力。

1.7 TC 差異PFRGs 與蛋白共表達相關(guān)性分析

采 用R 軟 件limma 包［18］，對TC 差 異PFRGs CD44、ANXA1 和NR4A1 進 行Spearman 相 關(guān) 性 分析，以相關(guān)系數(shù)R>0.7 且P<0.05 為篩選條件，篩選TC 差異PFRGs 的共表達基因，繪制共表達熱圖。整合CD44、ANXA1 和NR4A1 的共表達基因，通過STRING（https：//cn.string-db.org/）［19］數(shù)據(jù)庫進行蛋白互作分析，采用Cytoscape 3.9.0 繪制蛋白-蛋白互作（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)圖，利用cytoHubba 插件［20］進行度中心性（degree）、接近中心性（closeness）和中介中心性（betweenness）拓撲分析，探尋TC 鐵死亡核心網(wǎng)絡(luò)。

1.8 TC 差 異 PFRGs 基 因 本 體 論（Gene Ontology，GO）和京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）富集分析采 用R 軟 件clusterProfiler［21］、org.Hs.eg.db 包，對TC 差 異PFRGs CD44、ANXA1 和NR4A1 的共表達基因進行GO 和KEGG富集分析，以校正P<0.05 且q-value 的值<0.2 為篩選條件，聚焦TC 鐵死亡相關(guān)的生物進程（biological process，BP）、細 胞 組 分 （cell component，CC）、分子功能（molecular function，MF）和KEGG 通路，并構(gòu)建“KEGG-靶點”網(wǎng)絡(luò)圖。

1.9 統(tǒng)計學分析采用R 軟件（3.6.3）中的Bioconductor 軟件包進行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計學分析。TCGA 數(shù)據(jù)庫中轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布，采用Wilcoxon檢驗評估腫瘤組和對照組之間PFRGs表達的差異，采用單因素和多因素Cox 回歸分析評估PFRGs 表達和臨床數(shù)據(jù)等與TC 患者OS 之間的相關(guān)性。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 TC 差異預(yù)后基因獲取結(jié)果以|log2FC|>1 且校正P<0.05 為篩選條件，鑒 定 出TC-DEGs 共6 773 個，其中3 317個在TC中表達上調(diào)，3 456個在TC 中表達下調(diào)，繪制火山圖（圖1A）及差異排序圖（圖1B）。以P.cox<0.05 為篩選條件，鑒定出TC-PGs 共1 444 個，其 中HR>1 的 危 險 基 因755 個，HR<1 的保護基因有689 個。取“TCDEGs”與“TC-PGs”兩者的交集，韋恩圖可視化，獲取TC-DPGs 共343 個（圖1 C）。

圖1 TC 差異預(yù)后基因篩選結(jié)果Fig.1 Screening results of TC differential prognosis genes

2.2 TC 差異PFRGs 篩選結(jié)果從GeneCards 數(shù)據(jù)庫中獲得FRGs 442 個，從FerrDb 數(shù)據(jù)庫中獲得FRGs 384 個，2 個 數(shù) 據(jù) 庫 存 在167 個 相 同F(xiàn)RGs，保留唯一值后，共獲取659 個FRGs。取“TCDPGs”與“FRGs”兩者的交集，韋恩圖可視化，獲 取PFRGs 共3 個（圖2），分 別 為CD44、ANXA1 和NR4A1，差異分析及預(yù)后分析結(jié)果見表1。TC 中CD44 和ANXA1 差異表達上調(diào)（|log2FC|>1）是保護性因素（HR<1），NR4A1 差異表達 下 調(diào) （|log2FC| <－1）是 危 險 性 因 素（HR>1）。

表1 TC 差異PFRGs 差異和預(yù)后分析Tab.1 Differences and prognostic analysis on TC differential PFRGs

圖2 TC 差異PFRGs 韋恩圖Fig.2 Venn diagram of TC differential PFRGs

2.3 TC 差異PFRGs 表達情況配對或非配對樣本t檢驗結(jié)果（圖3A 和3B）顯示：與正常組織比較，TC 差 異PFRGs CD44 和ANXA1 在TC 中 表達上調(diào)，NR4A1 在TC 中表達下調(diào)。同時HPA 數(shù)據(jù)庫免疫組織化學圖片結(jié)果（圖4）顯示：TC 組織樣本中CD44 和ANXA1 蛋白過表達，NR4A1 蛋白低表達，此結(jié)果與TCGA 數(shù)據(jù)庫結(jié)果相互驗證。

圖3 TC 差異PFRGs 的表達Fig.3 Expressions of TC differential PFRGs

圖4 免疫組織化學法檢測TC差異PFRGs蛋白表達（×400）Fig.4 Protein expressions of TC differential PFRGs genes detected by immunohistochemistry(×400)

2.4 TC 差異PFRGs 生存預(yù)后情況time-ROC 生存預(yù)測結(jié)果（圖5A～5C）顯示：TC 患者1、3 和5 年生存預(yù)測中，ANXA1 均表現(xiàn)出相對最佳的預(yù)測效能，其中5 年的預(yù)測效價（AUC=0.200、0.221 和0.198）最佳；CD44 預(yù)測5 年生存預(yù)后具有最好效能，基因表達在TC 患者早期（1 年）促進死亡發(fā)生，在中后期（3 和5 年）促進生存發(fā)生；ANXA1 表 達 在TC 患 者1、3 和5 年 中 均 促 進 生 存發(fā)生；NR4A1 表達在TC 患者1、3 和5 年中均促進死亡發(fā)生。

Kaplan-Meier 曲線生存狀況結(jié)果（圖5D～5F）顯示：TC 差異PFRGs CD44、ANXA1 和NR4A1的表達與生存預(yù)后相關(guān)（P=0.048、0.005 和0.036），其中CD44 和ANXA1 的表達是保護性因素，NR4A1 的表達是危險因素，即低表達CD44 和ANXA1 與高表達NR4A1 具有較差的生存結(jié)局。

圖5 TC 差 異PFRGs 的time-ROC 和Kaplan-Meier 曲 線Fig.5 Time-ROC and Kaplan-Meier curves of TC differential PFRGs

2.5 TC 差異PFRGs 獨立預(yù)后分析結(jié)果對TC差異PFRGsCD44、ANXA1 和NR4A1 的表達進行多因素Cox 回歸分析，計算出3 個基因比例風險回歸模型的Coef 相關(guān)系數(shù)，即ANXA1（coef）=－0.361，NR4A1（coef）=0.316，CD44（coef）=0.008。將Coef 相關(guān)系數(shù)與3 個基因的表達值納入風險評分計算公式，計算TC 患者的風險評分。根據(jù)患者風險評分中位數(shù)（－0.049），將TCGA-THCA 甲狀腺患者分為高風險組255 例和低風險組255 例。

高和低風險組生存差異比較（圖6），Log-rank檢 驗 結(jié) 果 顯 示：HR=6.87，95%CI：2.58～18.30，P=0.003；Cox 回歸分析結(jié)果顯示：HR=6.88，95%CI：1.56～30.28，P=0.011，高風險組和低風險組患者生存預(yù)后比較差異有統(tǒng)計學意義，同時高風險組較低風險組具有更差的生存預(yù)后。time-ROC 顯示出風險評分能良好地預(yù)測TC患者1、3 和5 年的生存預(yù)后，1、3 和5 年的AUC值分別為0.761、0.767 和0.722，其中預(yù)測3 年的生存預(yù)后效價最優(yōu)。

圖6 低風險組和高風險組TC 患者Kaplan-Meier 曲線（A)及time-ROC 曲線（B）Fig.6 Kaplan-Meier curve(A) and time-ROC curve(B) of TC patients in low risk group and high risk group

為進一步評估風險評分與其他臨床特征的預(yù)后關(guān)系，采用單因素和多因素Cox 回歸分析，以單因素Cox 回歸分析的P<0.1 作為納入多因素Cox 回歸分析的條件，對臨床特征進行獨立預(yù)后分析（圖7）：風險評分是TC 患者生存預(yù)后的獨立因素（HR=8.882，95%CI：1.561～50.547，P=0.014），可獨立于其他臨床特征評估TC 患者生存預(yù)后。年齡（HR=1.078，95%CI：1.016～1.145，P=0.013）與TC 患者生存預(yù)后相關(guān)。

圖7 TC 患者臨床特征單因素和多因素Cox 回歸分析森林圖Fig.7 Forest plot of univariate and multivariate Cox regression analysis on clinical characteristics of TC patients

2.6 TC 差異PFRGs Nomogram 圖構(gòu)建及驗證結(jié)果根據(jù)多因素Cox 回歸分析結(jié)果，以年齡和風險評分作為因子構(gòu)建Nomogram 圖，預(yù)測TC 患者1、3 和5 年的OS 的概率。綜合Nomogram 圖中年齡及風險評分的總體得分，預(yù)測TC 患者的生存概率（圖 8A），該 Nomogram 圖 的 C-index=0.938（0.923～0.952），具 有 較 好 的 預(yù) 測 能 力。Calibration 分析結(jié)果顯示：Nomogram 圖預(yù)測TC 患者1、3 和5 年生存概率與實際觀察結(jié)果吻合良好，見圖8 B～D。

圖8 TC 差異PFRGs 的Nomogram 圖 和Calibration 圖Fig.8 Nomogram and Calibration charts of TC differential PFRGs

2.7 TC 差異PFRGs 與蛋白共表達相關(guān)性分析結(jié)果Spearman 相關(guān)性分析基因共表達結(jié)果顯示：有9 個編碼基因與CD44 表達呈正相關(guān)關(guān)系（P<0.001），有95 個編碼基因與ANXA1 表達呈正相關(guān)關(guān)系（P<0.001），有17 個編碼基因與NR4A1 表達呈正相關(guān)關(guān)系（P<0.001）。分別繪制CD44、ANXA1 和NR4A1 相關(guān)系數(shù)前5 位的共表達熱圖（圖9）：與CD44 最相關(guān)的前5 位基因依次是SFTA3 （cor=0.773）、SSBP2 （cor=0.770）、RNF146 （cor=0.755）、IKZF2 （cor=0.732）和ESYT3（cor=0.718）；與ANXA1 最相關(guān)的前5 位基因依次是DUSP6（cor=0.815）、SDC4（cor=0.812）、TMEM43 （cor=0.803）、BID （cor=0.793）和RAD23B （cor=0.783）；與NR4A1 最相關(guān)的前5 位基因依次是FOSB （cor=0.889）、NR4A3 （cor=0.845）、NR4A2 （cor=0.840）、CSRNP1（cor=0.837）和ZFP36（cor=0.826）。

圖9 TC 差異PFRGs 共表達熱圖Fig.9 Heat maps of co-expression of TC differential PFRGs

PPI 結(jié)果顯示（圖10A）：PPI 網(wǎng)絡(luò)中共有71 個節(jié)點，132 條邊，即71 種蛋白質(zhì)之間相互作用，共有132 組對應(yīng)關(guān)系。拓撲分析結(jié)果顯示：JUN、FOS 和ATF3 等 關(guān) 鍵 蛋 白 與CD44、ANXA1 和NR4A1 調(diào)控TC 鐵死亡有關(guān)（圖10B～D 和表2）。

表2 TC 差異PFRGs 關(guān)鍵蛋白拓撲分析Tab.2 Topological analysis on TC differential PFRGs key proteins

圖10 TC 差異PFRGs PPI 網(wǎng)絡(luò)圖及拓撲分析圖Fig.10 PPI network and topology analysis diagrams of TC differential PFRGs

2.8 TC 差異PFRGs GO 和KEGG 富集分析結(jié)果GO 和KEGG 富集分析結(jié)果顯示：在滿足AdjustedP<0.05 且q<0.2 條件下，TC 鐵死亡主要富集于58 個BP、4 個MF 和5 個KEGG，主要與細胞周期的調(diào)控有關(guān)。聚焦于細胞周期BP、MF和KEGG（圖11A）結(jié)果顯示：TC 鐵死亡主要富集于MAPK 活性失活、內(nèi)肽酶活性的正向調(diào)節(jié)、凋亡通路的正向調(diào)節(jié)、ERK1 和ERK2 級聯(lián)等生物進程；富集于MAPK 活性、p-MAPK 活性、生長因子結(jié)合和轉(zhuǎn)化生長因子β 結(jié)合分子功能；主要富集于MAPK信號通路、Th17細胞分化和細胞凋亡等信號通路。

構(gòu)建KEGG-靶點網(wǎng)絡(luò)圖（圖11 B）：TC 鐵死亡主要與MAPK 信號通路中雙特異性磷酸酶（dual specificity phosphatase，DUSP1）1、DUSP5、DUSP6、Fos 原 癌 基 因 （Fos proto-oncogene，F(xiàn)OS）、白細胞介素1 受體輔助蛋白（interleukin 1 receptor accessory protein，IL1RAP）、Jun 原癌基因（Jun proto-oncogene，JUN）、MET 原癌基因（MET proto-oncogene，MET）、Ras 蛋白特異性鳥嘌呤核苷酸釋放因子 1 （Ras protein specific guanine nucleotide releasing factor 1，RASGRF1）、轉(zhuǎn)化生長因子α（transforming growth factor alpha，TGFA）、轉(zhuǎn) 化 生 長 因 子β 受 體1 （transforming growth factor beta receptor 1，TGFBR1）和TNF受體超家族成員 1A （TNF receptor superfamily member 1A，TNFRSF1A）分子靶點的調(diào)控有關(guān)。

圖11 TC 鐵死亡GO 和KEGG 氣泡圖（A）及KEGG-靶點網(wǎng)絡(luò)圖（B）Fig.11 TC ferroptosis GO and KEGG bubble diagram（A）and KEGG-target network diagram（B）

3 討 論

TC 是好發(fā)于中老年人，以高發(fā)病率和低死亡率為特點的內(nèi)分泌惡性腫瘤［22］。目前，TC 根治術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)和不可切除患者缺乏有效全身治療手段是TC 患者生存預(yù)后不良的主要原因［23］。為進一步提升TC 患者生存獲益，突破臨床治療瓶頸，在腫瘤分子生物學研究的基礎(chǔ)上，本研究結(jié)果顯示：分子靶向藥物可為碘難治性TC、不可切除性TC 和手術(shù)切除后復(fù)發(fā)TC 患者帶來生存獲益。隨著腫瘤分子生物學研究及分子靶向藥物研發(fā)的不斷深入，索拉非尼、樂伐替尼和侖伐替尼相繼問世，在新輔助治療、靶向聯(lián)合免疫治療及姑息治療方面極大地提高了TC 患者的生存獲益［24］。鐵死亡是由鐵代謝、脂質(zhì)代謝和氨基酸代謝共同介導(dǎo)的細胞程序性死亡模式，貫穿TC 發(fā)生發(fā)展的始終。研究［25］顯示：針對腫瘤細胞鐵死亡的分子靶向藥物（索拉非尼）可明顯延長肝癌、腎癌和食管癌等多種惡性腫瘤患者的生存期。本研究篩選出TC 差異PFRGs，分析其與TC 患者生存預(yù)后的關(guān)系，并構(gòu)建預(yù)后風險評估系統(tǒng)及預(yù)測模型。

本研究通過TCGA、FerrDb 和GeneCards 數(shù)據(jù)庫，差異分析鑒定出3 317 個在TC 中上調(diào)基因和3 456 個在TC 中下調(diào)基因，單因素Cox 回歸分析鑒定出343 個差異基因與TC 患者的生存預(yù)后相關(guān)，其中包括3 個FRGs（CD44、ANXA1 和NR4A1）。結(jié)合基因表達譜及臨床病理驗證了CD44、ANXA1在TC 組織中明顯上調(diào)，NR4A1 在TC 組織中明顯下調(diào)，與差異分析結(jié)果相互佐證。CD44 是一種細胞黏附糖蛋白，在腫瘤進展和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮作用，被廣泛用于TC 和其他惡性腫瘤的腫瘤干細胞標志物［26-27］，LI 等［28］采用雙熒光素酶報告基因及免疫共沉淀實驗證實miR-205-5p 能靶向GGCT，介導(dǎo)TC 細胞中CD44 的表達下調(diào)，抑制TC 細胞增殖、遷移和侵襲。ANXA1 是一種磷脂結(jié)合的膜定位蛋白，在TC 組織和細胞（SW579 細胞）中表達上調(diào)，可通過外泌體介導(dǎo)TC 和甲狀腺濾泡上皮細胞（Nthy-ori3-1 細胞）之間的細胞通訊，促進TC 細胞及甲狀腺濾泡上皮細胞的增殖、侵襲、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和腫瘤生長［29］。NR4A1 是核受體亞家族4A1組成員轉(zhuǎn)錄因子，入核調(diào)控下游靶基因轉(zhuǎn)錄，參與腫瘤細胞增殖、細胞凋亡和鐵死亡等多個進程。JIANG 等［30］發(fā) 現(xiàn)：NR4A1 直 接 與 LEF1 的 啟 動子區(qū)域結(jié)合，并導(dǎo)致與組蛋白乙?；?DNA 去甲基化的串擾，從而在轉(zhuǎn)錄上上調(diào)LEF1 表達，促進PTC 中下游生長相關(guān)基因的表達和腫瘤細胞增殖。

本研究采用Kaplan-Meier 曲線和time-ROC 曲線分析結(jié)果顯示：CD44、ANXA1 和NR4A1 的表達與生存預(yù)后相關(guān)（P=0.048、0.005 和0.036），對TC 患者均具有良好的1、3 和5 年生存預(yù)測作用；采用單因素和多因素Cox 回歸分析構(gòu)建3 基因風險評分系統(tǒng)，計算TC 患者風險評分，結(jié)果顯示：風險評分是獨立于TC 其他臨床特征的預(yù)后因子（HR=8.882，95%CI：1.561～50.547，P=0.014），風險評分越高，TC 患者1、3 和5 年生存預(yù)后越差（AUC=0.761、0.767 和0.722）；聯(lián)合TC 患者臨床特征構(gòu)建預(yù)測TC 患者1、3 和5 年的生存概率的Nomogram 圖（C-index=0.938），對TC 患者的生存獲益具有較好的預(yù)測作用。

本研究中Spearman 相關(guān)性分析結(jié)果顯示：CD44 與SFTA3、SSBP2、RNF146、IKZF2 和ESYT3 最 相 關(guān)；ANXA1 與 DUSP6、SDC4、TMEM43、BID 和RAD23B 最 相 關(guān)；NR4A1 與FOSB、NR4A3、NR4A2、CSRNP1 和ZFP36 最相關(guān)。聯(lián)合3 個TC PFRGs 進行PPI 及拓撲分析結(jié)果顯示：TC 鐵死亡與JUN、FOS 和ATF3 等關(guān)鍵蛋白的相互作用有關(guān)。為研究TC 鐵死亡介導(dǎo)的下游作用機制，本研究進行GO 和KEGG 富集分析，發(fā)現(xiàn)TC 細胞鐵死亡主要與其共表達基因（DUSP1、DUSP5、DUSP6、FOS、IL1RAP、JUN、MET、RASGRF1、TGFA、TGFBR1 和TNFRSF1A）介導(dǎo)MAPK 信號通路，影響MAPK活性和p-MAPK 活性等分子功能，調(diào)控MAPK 失活有關(guān)。MAPK 信號通路與活性氧（reactive oxygen species，ROS）誘導(dǎo)的細胞鐵死亡有關(guān)，細胞內(nèi)過量的ROS 以脂質(zhì)過氧化的形式介導(dǎo)鐵死亡［31］，參與多種腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲過程［32-33］。

綜上所述，本研究篩選得到的差異PFRGs（CD44、ANXA1 和NR4A1）與TC 發(fā)生發(fā)展和預(yù)后相關(guān)；成功構(gòu)建了3 個基因聯(lián)合的風險評分系統(tǒng)及預(yù)測模型，結(jié)合TC 患者臨床特征能有效預(yù)測TC 患者1、3 和5 年生存期，TC 鐵死亡的作用機制可能與介導(dǎo)共表達基因、激活MAPK 信號通路和調(diào)控相關(guān)分子功能有關(guān)。