沉默信息調(diào)節(jié)因子2 對(duì)大腸癌細(xì)胞有氧糖酵解和生長(zhǎng)增殖的調(diào)控作用及其機(jī)制

岳金金, 龐一心, 張秀梅

（錦州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室,遼寧 錦州 121001）

代謝重編程是腫瘤細(xì)胞的一個(gè)主要代謝特征，能更好地協(xié)調(diào)腫瘤細(xì)胞對(duì)葡萄糖的利用過(guò)程，也能對(duì)腫瘤細(xì)胞生理機(jī)能進(jìn)行調(diào)節(jié)。越來(lái)越多的研究［1-2］表明：代謝重編程能夠維持腫瘤細(xì)胞惡性增殖的特征，目前針對(duì)腫瘤細(xì)胞的代謝研究已經(jīng)成為腫瘤治療新的靶點(diǎn)。腫瘤細(xì)胞快速增殖的重要機(jī)制之一是磷酸戊糖途徑（pentose phosphate pathway，PPP），而在生物大分子合成過(guò)程中PPP 的中間產(chǎn)物起重要作用。PPP 是糖酵解途徑的一個(gè)旁路，從糖酵解的中間產(chǎn)物葡糖6-磷酸開始進(jìn)入PPP，經(jīng)過(guò)一系列氧化和基團(tuán)轉(zhuǎn)移代謝轉(zhuǎn)變產(chǎn)生2 個(gè)重要的中間產(chǎn)物：還原當(dāng)量煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）和5-磷酸核糖。對(duì)于增殖速度較快的細(xì)胞，尤其是腫瘤細(xì)胞，充足的NADPH 和5-磷酸核糖的供應(yīng)是維持其生長(zhǎng)繁殖所必需的。研究［3-4］表明：與正常細(xì)胞比較，卵巢癌和胰腺癌腫瘤細(xì)胞中葡糖6-磷酸進(jìn)入磷酸戊糖途徑的流量有明顯升高，其主要機(jī)制是腫瘤細(xì)胞內(nèi)葡糖-6-磷酸脫氫酶（glucose-6-phosphate dehydrogenase，G6PD）的表達(dá)或活性增加。因此，G6PD 可能與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)聯(lián)，其活性和定位受p21 激活激酶4（p21-activated kinase 4，PAK4）、p53、B 細(xì)胞淋巴瘤2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）相關(guān)基因3（Bcl-2 associated athanogene 3，BAG3）、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（hepatocyte growth factor，HGF）和AMP 激 活 的蛋 白 激 酶［Adenosine 5′-monophosphate （AMP）-activated protein kinase，AMPK］等 直 接 調(diào) 控［5-7］。沉默信息調(diào)節(jié)因子（silent information regulator factor，SIRT）是一類由多個(gè)組蛋白去乙酰化酶成員組成的蛋白家族，SIRT 家族有7 個(gè)成員，包含SIRT1～SIRT7。SIRT 家族成員通過(guò)對(duì)組蛋白及多種非組蛋白進(jìn)行去乙酰化修飾調(diào)節(jié)體內(nèi)多種代謝途 徑［8-10］。SIRT2 是SIRT 家 族 的 一 員，研 究［11-13］表明：SIRT2 可有效抑制乳腺癌的發(fā)展，在惡性腫瘤的生長(zhǎng)和侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。但SIRT2在大腸癌中的作用目前還鮮有報(bào)道。本研究旨在探討SIRT2 對(duì)大腸癌細(xì)胞有氧糖酵解及生長(zhǎng)增殖的影響，闡明其調(diào)控機(jī)制，從而為結(jié)腸癌的臨床治療提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞、臨床樣本、主要試劑和儀器

HCT116 和SW480 大腸癌細(xì)胞為本實(shí)驗(yàn)室自有。大腸癌組織病理切片取自錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科大腸癌患者手術(shù)切除的標(biāo)本，本研究已獲得錦州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者均對(duì)本研究?jī)?nèi)容充分知情，并簽署知情同意書，均取癌組織和癌旁正常組織（距離腫瘤邊緣>5 cm 處），所有病例均經(jīng)病理診斷證實(shí)且術(shù)前未經(jīng)放療和化療。細(xì)胞培養(yǎng)基和胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco 公司，SIRT2 干擾RNA 購(gòu)自蘇州吉瑪基因股份有限公司，葡萄糖氧化酶試劑盒購(gòu)自Solarbio 公司，SIRT2、β-actin 和G6PD 抗體均購(gòu)自英國(guó)Abcam 公司，CCK-8 試劑盒購(gòu)自安諾倫（北京）生物科技有限公司，乳酸測(cè)試盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所，Clon Express Ultra One Step Cloning Kit 試劑盒購(gòu)自日本 TaKaRa 公司，SIRT2 質(zhì)粒購(gòu)自武漢淼靈生物科技公司。凝膠成像儀和酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó) Bio-Rad 公司，CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱購(gòu)自美國(guó)Thermo 公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)、分組及轉(zhuǎn)染分別將HCT116 細(xì)胞和SW480 細(xì)胞接種在6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到約70% 時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。HCT116 細(xì)胞轉(zhuǎn)染SIRT2-siRNA 進(jìn)行干擾實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)分為陰性對(duì)照組、SIRT2-siRNA#1 組、SIRT2-siRNA#2 組、和SIRT2-siRNA#3 組；4 組小干擾RNA 序列分別為SIRT2-siRNA#1：5′-GGACGAGCUGACCUUGGAATTUUCCAAGGUCAGCUCGU C C T T-3′，SIRT2-siRNA#2：5′-CCACCGGCCUCUAUGACAATTUUGUCAUAGAGGCCGGUG G T T-3′，SIRT2-siRNA#3：5′-CCAUCUGUCACUACUUCAUTTAUGAAGUAGUGACAGAUG G T T-3′，陰 性 對(duì) 照 組：5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTTACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′。采用SW480 細(xì)胞進(jìn)行過(guò)表達(dá)實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)分為空白組、空載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組和SIRT2 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組。將SIRT2-siRNA#3 與G6PD 質(zhì)粒均減半后混勻共轉(zhuǎn)染進(jìn)行回復(fù)實(shí)驗(yàn)，回復(fù)實(shí)驗(yàn)對(duì)照組是將陰性對(duì)照與空載體質(zhì)粒均減半后混勻共轉(zhuǎn)染進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。在轉(zhuǎn)染后進(jìn)行計(jì)時(shí)，6 h 后換液，將6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中液體吸出，更換為完全培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)。

1.3 Western blotting 法檢測(cè)大腸癌細(xì)胞中SIRT2和G6PD 蛋白表達(dá)水平轉(zhuǎn)染48 h 后，分別收取SIRT2 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組和SIRT2-siRNA 干擾組的細(xì)胞。在6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)每孔加入細(xì)胞裂解液和蛋白酶抑制劑共100 μL，細(xì)胞刮刀直接刮取，提取細(xì)胞總蛋白。采用BCA 蛋白質(zhì)濃度檢測(cè)法檢測(cè)蛋白濃度，將蛋白樣品濃度定量至20 μg；恒壓90 V 進(jìn)行SDS-PAGE 電泳后，21 V、20 min 半干轉(zhuǎn)至PVDF膜，封閉液為5%脫脂奶粉，室溫封閉2 h，將膜洗滌后分別與SIRT2 抗體（稀釋濃度為1∶2 000）、G6PD 抗體（稀釋濃度為1∶1 000）和β-actin 抗體（稀釋濃度為1∶1 000）進(jìn)行4 ℃孵育過(guò)夜，第2 天將PVDF 膜經(jīng)洗滌后放進(jìn)HRP 標(biāo)記抗兔（稀釋濃度為1∶10 000）二抗溶液中，室溫進(jìn)行孵育1 h，利用ECL 發(fā)光儀進(jìn)行發(fā)光成像。目的蛋白表達(dá)水平=目的蛋白條帶灰度值/β-actin 蛋白條帶灰度值。

1.4 試劑盒檢測(cè)大腸癌細(xì)胞培養(yǎng)液中葡萄糖和乳酸水平轉(zhuǎn)染和分組過(guò)程同實(shí)驗(yàn)步驟“1.2”，分別收集SIRT2 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組和 SIRT2-siRNA 干擾組轉(zhuǎn)染后24 h 的培養(yǎng)液。按照葡萄糖檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書和乳酸檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書分別檢測(cè)培養(yǎng)液中的葡萄糖水平和乳酸水平。

1.5 CCK-8 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組大腸癌細(xì)胞增殖活性轉(zhuǎn)染和分組過(guò)程同實(shí)驗(yàn)步驟“1.2”，將轉(zhuǎn)染24 h 后的細(xì)胞消化并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，將各組細(xì)胞濃度調(diào)整至每毫升4×104個(gè)細(xì)胞，各組取細(xì)胞懸液100 μL 接種于96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，并設(shè)3 個(gè)復(fù)孔。將接種好的細(xì)胞放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)1、2 和3 d，每日定時(shí)每孔加入CCK-8 試劑10 μL，37 ℃恒溫培養(yǎng)2 h 后酶標(biāo)儀于450 nm 波長(zhǎng)處測(cè)量各組的吸光度（A）值，以A 值代表細(xì)胞增殖活性。

1.6 克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)大腸癌細(xì)胞克隆形成率轉(zhuǎn)染和分組過(guò)程同實(shí)驗(yàn)步驟“1.2”，將轉(zhuǎn)染24 h 后的細(xì)胞消化并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，各組分別取一定數(shù)量的細(xì)胞接種于6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，37 ℃恒溫進(jìn)行培養(yǎng)10～15 d，期間觀察細(xì)胞群落生長(zhǎng)狀態(tài)，當(dāng)單株細(xì)胞群落內(nèi)含有一定數(shù)量的細(xì)胞時(shí)可停止培養(yǎng)并進(jìn)行染色。細(xì)胞固定時(shí)，每孔加入4%多聚甲醛1 mL，1 h 后吸出多聚甲醛，加入結(jié)晶紫覆蓋住細(xì)胞染色1 h，去除染色液后進(jìn)行克隆計(jì)數(shù)，計(jì)算克隆形成率?？寺⌒纬陕?克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)×100%。

1.7 反轉(zhuǎn)錄PCR（reverse transcription-PCR，RT-PCR）法檢測(cè)轉(zhuǎn)染SIRT2 后大腸癌細(xì)胞中G6PD mRNA表達(dá)水平轉(zhuǎn)染和分組過(guò)程同實(shí)驗(yàn)步驟“1.2”，分別收取SIRT2 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組和SIRT2-siRNA 干擾組轉(zhuǎn)染48 h 后的細(xì)胞，采用Trizol 法提取各組細(xì)胞的總RNA，按照RT-PCR 試劑盒的說(shuō)明書進(jìn)行RT-PCR 一步法反應(yīng)，反應(yīng)體系：模板RNA 0.5 μg，上游引物和下游引物（10 μmol·L－1）各2 μL，One Step Enzyme Mix 2.5 μL，2×One Step Mix 25 μL，最后加入RNase free ddH2O 使得反應(yīng)總體系為50 μL。反應(yīng)程序：95 ℃、5 min；95 ℃、30 s，55 ℃、30 s，72 ℃、30 s，共25 次循環(huán)；72 ℃、10 min，4 ℃保存。取1 g瓊脂糖加TAE電泳緩沖液定容至100 mL 配制成1%的瓊脂糖凝膠，對(duì)PCR 產(chǎn)物行電泳檢測(cè)，于凝膠成像系統(tǒng)中成像。采用2－ΔΔCt法計(jì)算G6PD mRNA 表達(dá)水平。

1.8 免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè)大腸癌組織中SIRT2和G6PD 蛋白表達(dá)水平60 ℃烘干箱對(duì)癌組織和癌旁組織的切片烤片2 h，烤片后將組織切片進(jìn)行常規(guī)脫蠟，然后加入枸櫞酸緩沖液或EDTA 修復(fù)液進(jìn)行修復(fù)，PBS 緩沖液（pH7.4）沖洗3 次；滴加3%過(guò)氧化氫后室溫孵育15 min，PBS 緩沖液沖洗3 次，5%血清室溫封閉30 min，滴加一抗（稀釋濃度為1∶200），于4 ℃濕盒中孵育16 h；次日復(fù)溫后PBS 緩沖液沖洗3 次，滴加二抗工作液，37 ℃孵育30 min，PBS 緩沖液沖洗3 次，滴加DAB 顯色液。鏡下觀察顯色反應(yīng)充分反應(yīng)后終止反應(yīng)，Harris 蘇木素進(jìn)行復(fù)染，1%的鹽酸乙醇進(jìn)行分化，再經(jīng)過(guò)脫水、透明、中性樹膠封片，顯微鏡下觀察，每張組織切片各選3 個(gè)視野采集圖像進(jìn)行保存，根據(jù)染色強(qiáng)度和染色陽(yáng)性率取均數(shù)進(jìn)行評(píng)分。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用GraphPad Prism 8.0 軟件繪圖。各組細(xì)胞中相關(guān)基因mRNA 和蛋白表達(dá)水平，培養(yǎng)液中葡萄糖和乳酸水平，細(xì)胞增殖活性和細(xì)胞克隆形成率均行正態(tài)分布和方差齊性檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以±s表示，2 組間樣本均數(shù)比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；采用χ2檢驗(yàn)分析癌組織與癌旁組織SIRT2 和G6PD 蛋白表達(dá)差異。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 過(guò)表達(dá)和沉默SIRT2 后各組細(xì)胞培養(yǎng)液中葡萄糖和乳酸的水平Western blotting 法檢測(cè)結(jié)果顯示：SW480 細(xì)胞中SIRT2 蛋白表達(dá)水平較低，HCT116 細(xì)胞中SIRT2 蛋白表達(dá)水平較高，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），因此選擇SIRT2 本體表達(dá)高的HCT116 細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)的RNA 干擾實(shí)驗(yàn)，選擇SIRT2 本體表達(dá)低的SW480細(xì)胞進(jìn)行過(guò)表達(dá)實(shí)驗(yàn)。SIRT2 的3 組不同siRNA 干擾序列通過(guò)Western blotting 法驗(yàn)證，結(jié)果顯示：與陰性對(duì)照組比較，SIRT2-siRNA#3 轉(zhuǎn)染組HCT116 細(xì)胞中SIRT2 蛋白表達(dá)水平明顯降低（P<0.05），故SIRT2-siRNA 干擾組處理均采用SIRT2-siRNA#3。Western blotting 法驗(yàn)證結(jié)果顯示：與空白組和空載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組比較，SIRT2 質(zhì)粒過(guò)表達(dá)組細(xì)胞中SIRT2 蛋白表達(dá)水平明顯升高（P<0.05）。見圖1。細(xì)胞培養(yǎng)液中葡萄糖水平的檢測(cè)結(jié)果顯示：與陰性對(duì)照組比較，SIRT2-siRNA 干擾組HCT116 細(xì)胞培養(yǎng)液中葡萄糖水平明顯升高（P<0.05）；與空載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組比較，SIRT2 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組SW480 細(xì)胞培養(yǎng)液中葡萄糖水平明顯降低（P<0.05）。培養(yǎng)液中乳酸水平的檢測(cè)結(jié)果顯示：與陰性對(duì)照組比較，SIRT2-siRNA干擾組HCT116 細(xì)胞培養(yǎng)液中乳酸水平明顯降低（P<0.05）；與空載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組比較，SIRT2 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組SW480 細(xì)胞培養(yǎng)液中乳酸水平明顯升高（P<0.05）。培養(yǎng)液中葡萄糖水平檢測(cè)結(jié)果顯示：在HCT116 細(xì)胞中，與陰性對(duì)照組（葡萄糖水平3.19 mmol·L－1）比 較，SIRT2-siRNA 干 擾 組（葡萄糖水平5.28 mmol·L－1）培養(yǎng)液中葡萄糖水平明顯升高（P<0.05）；在SW480 細(xì)胞中，與空載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組（葡萄糖水平5.02 mmol·L－1）比較，SIRT2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組（葡萄糖水平2.66 mmol·L－1）培養(yǎng)液中葡萄糖水平明顯降低（P<0.05）。培養(yǎng)液中乳酸水平檢測(cè)結(jié)果顯示：在HCT116 細(xì)胞中，與陰性對(duì)照組（乳酸水平14.68 mmol·L－1）比較，SIRT2-siRNA 干擾組（乳酸水平11.29 mmol·L－1）培養(yǎng)液中乳酸水平明顯降低（P<0.05）；在SW480 細(xì)胞中，與空載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組（乳酸水平13.76 mmol·L－1）比較，SIRT2 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組（乳酸水平20.32 mmol·L－1）培養(yǎng)液中乳酸水平明顯升高（P<0.05）。

2.2 過(guò)表達(dá)和沉默SIRT2 后各組細(xì)胞增殖活性和克隆形成率CCK-8 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示：SIRT2-siRNA 干擾組細(xì)胞增殖活性較陰性對(duì)照組明顯降低P<0.05）（圖2A）；SIRT2 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組細(xì)胞增殖活性較空載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組和空白組明顯升高（圖2B）（P<0.05）。沉 默SIRT2 后，SIRT2-siRNA 干擾組HCT116 細(xì)胞克隆數(shù)明顯少于陰性 對(duì) 照 組 （圖3A～3C）；過(guò) 表 達(dá)SIRT2 后，SIRT2 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組SW480 細(xì)胞克隆數(shù)明顯多于空載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組和空白組（圖3D～3F）。沉默SIRT2 后，SIRT2-siRNA 干 擾 組HCT116 細(xì) 胞 克隆形成率明顯低于陰性對(duì)照組（P<0.05）（圖4A）；過(guò)表達(dá)SIRT2 后，SIRT2 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組SW480 細(xì)胞克隆形成率明顯高于空載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組和空白組（P<0.05）（圖4B）。

圖2 CCK-8 法檢測(cè)各組細(xì)胞增殖活性Fig.2 Proliferation activities of cells in various groups detected by CCK-8 method

圖3 克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞克隆形成情況（結(jié)晶紫）Fig.3 Colone formations of cells in various groups detected by colony formation assay（Crystal violet）

圖4 各組細(xì)胞克隆形成率Fig.4 Clone formation rates of cells in various groups

2.3 過(guò)表達(dá)和沉默SIRT2 后各組細(xì)胞中G6PD mRNA 和蛋白表達(dá)水平RT-PCR 法檢測(cè)結(jié)果顯示：與陰性對(duì)照組比較，SIRT2-siRNA 干擾組HCT116 細(xì)胞中G6PD mRNA 表達(dá)水平明顯降低；而SIRT2 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組SW480 細(xì)胞中G6PD mRNA表達(dá)水平較空載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組明顯升高。Western blotting 法檢測(cè)結(jié)果顯示：與陰性對(duì)照組比較，SIRT2-siRNA 干 擾 組 的HCT116 細(xì) 胞 中G6PD 蛋白表達(dá)水平降低（P<0.05）；而SIRT2 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組SW480 細(xì)胞中G6PD 蛋白表達(dá)水平較空載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組明顯升高（P<0.05），見圖5。

圖5 各組細(xì)胞中G6PD mRNA 和蛋白表達(dá)電泳圖和直條圖Fig.5 Electropherograms and histograms of expressions of G6PD mRNA and protein in cells in various groups

2.4 大腸癌組織和癌旁組織中SIRT2 和G6PD 蛋白的表達(dá)水平采用免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè)大腸癌臨床樣本中SIRT2 和G6PD 蛋白表達(dá)水平，結(jié)果顯示：癌旁組織中SIRT2［SIRT2 蛋白高水平表達(dá)：37.5%（15/40）］和G6PD 蛋白表達(dá)水平［G6PD蛋白高水平表達(dá)：27.5%（11/40）］低于癌組織［SIRT2蛋白高水平表達(dá)：67.5% （27/40），G6PD蛋白高水平表達(dá)：77.5%（31/40）］（P<0.05）。見圖6。

圖6 大腸癌和癌旁組織中SIRT2 和G6PD 的表達(dá)（免疫組織化學(xué)，×400）Fig.6 Expressions of SIRT2 and G6PD in colorectal cancer tissue and adjacent tissue (Immunohistochemistry,×400)

2.5 回復(fù)實(shí)驗(yàn)中各組細(xì)胞培養(yǎng)液中葡萄糖和乳酸水平、細(xì)胞增殖活性和克隆形成率與對(duì)照組比較，SIRT2-siRNA#3 和G6PD 質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染組細(xì)胞培養(yǎng)液中葡萄糖和乳酸水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；與 SIRT2-siRNA#3 組 比 較，SIRT2-siRNA#3 和G6PD 共轉(zhuǎn)染組細(xì)胞培養(yǎng)液中葡萄糖水平降低（P<0.05），乳酸水平升高（P<0.05）（圖7）。CCK-8 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示：與對(duì)照組比較，SIRT2-siRNA#3 和G6PD 質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染組細(xì)胞增殖活性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；與SIRT2-siRNA#3 組 比 較，SIRT2-siRNA#3 和G6PD 共轉(zhuǎn)染組細(xì)胞增殖活性升高（P<0.05）（圖8）?？寺⌒纬蓪?shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與對(duì)照組比較，SIRT2-siRNA#3 和G6PD 質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染組細(xì)胞克隆形成數(shù)量和克隆形成率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；與 SIRT2-siRNA#3 組 比 較，SIRT2-siRNA#3 和G6PD 共轉(zhuǎn)染組細(xì)胞克隆數(shù)增加（P<0.05），克隆形成率升高（P<0.05）。見圖9和10。

圖7 各組細(xì)胞培養(yǎng)基中葡萄糖和乳酸水平Fig.7 Levels of glucose(A) and lactic acid(B) in culture medium of cells in various groups

圖8 CCK-8 法檢測(cè)3 組不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞增殖活性Fig.8 Proliferation activities of cells in various groups at different time proteins detected by CCK-8 method

圖9 克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞克隆形成情況（結(jié)晶紫）Fig.9 Colone formations of cells in various groups detected by colony formation assay（Crystal violet）

3 討 論

圖10 回復(fù)實(shí)驗(yàn)中各組細(xì)胞克隆形成率Fig.10 Clone formation rates of cells in various groups in recovery experiment

SIRT2 作為SIRT 家族的一員，主要定位于細(xì)胞質(zhì)，參與調(diào)控氧化應(yīng)激和細(xì)胞程序性死亡等生物過(guò)程。研究［14］顯示：SIRT2 促進(jìn)宮頸癌的發(fā)生發(fā)展，其表達(dá)水平與宮頸癌的惡性程度有關(guān)；在裸鼠原位肝癌肺轉(zhuǎn)移模型中，敲低SIRT2 基因可以激活蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）進(jìn)而影響糖原 合 成 酶 激 酶 3β （glycogen synthase kinase3β，GSK3β）/β-連環(huán)蛋白（β-catenin）信號(hào)通路，抑制人肝癌細(xì)胞的增殖和肺轉(zhuǎn)移［15］。SIRT2 在大腸癌細(xì)胞糖代謝和增殖中的作用目前尚不明確。本研究選擇大腸癌HCT116 細(xì)胞和SW480 細(xì)胞，Western blotting 法檢測(cè)SIRT2 蛋白在HCT116 細(xì)胞中呈高表達(dá)，在SW480 細(xì)胞中呈低表達(dá)，因此選擇HCT116 細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)RNA 干擾實(shí)驗(yàn)，選擇SW480 細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)的過(guò)表達(dá)實(shí)驗(yàn)。合成si-RNA小鏈，構(gòu)建重組質(zhì)粒pcDNA3.1-HA-SIRT2，采用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染法將si-RNA 小鏈和質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染至HCT116 和SW480 細(xì)胞。細(xì)胞培養(yǎng)液中葡萄糖和乳酸水平檢測(cè)結(jié)果顯示：si-SIRT2 轉(zhuǎn)染組培養(yǎng)液中葡萄糖水平明顯高于陰性對(duì)照組，乳酸水平明顯低于對(duì)照組；而SIRT2 轉(zhuǎn)染組培養(yǎng)液中葡萄糖水平明顯低于對(duì)照組，乳酸水平高于對(duì)照組。20 世紀(jì)30 年代 WARBURG 首次提出腫瘤細(xì)胞中存在“Warburg 效應(yīng)”，即有氧糖酵解，是指腫瘤細(xì)胞即使在氧氣充足的情況下也會(huì)利用糖酵解供能產(chǎn)生乳酸。因此本研究證實(shí)了SIRT2 促進(jìn)大腸癌細(xì)胞葡萄糖的攝取和乳酸的生成，即促進(jìn)大腸癌細(xì)胞有氧糖酵解。有氧糖酵解可以為腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)提供以下優(yōu)勢(shì)：一是迅速產(chǎn)生能量；二是為腫瘤細(xì)胞生物大分子的合成提供原料，滿足腫瘤細(xì)胞快速增殖的需求［16］。本文作者推測(cè)SIRT2 可能通過(guò)提高糖酵解進(jìn)而促進(jìn)大腸癌細(xì)胞的增殖，CCK-8 實(shí)驗(yàn)和克隆形成實(shí)驗(yàn)均證實(shí)SIRT2 促進(jìn)大腸癌細(xì)胞的增殖。CHEN 等［17］研究證實(shí)：SIRT2 調(diào)節(jié)Akt 的去乙?；突罨?，隨后影響GSK3β/β-catenin 信號(hào)通路以調(diào)節(jié)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化 （epithelial-mesenchymal transition，EMT）。牛虹等［18］研究證實(shí)：在胃癌細(xì)胞中SIRT2 存在明顯的表達(dá)上調(diào)，沉默SIRT2可 能 通 過(guò) 調(diào) 節(jié) 磷 脂 酰 肌 醇 -3- 激 酶（phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）/Akt 通 路，從而抑制胃癌細(xì)胞遷移、增殖和侵襲；GUO 等［19］研究也證實(shí)敲低 SIRT2 使子宮內(nèi)膜癌（endometrial carcinoma，EC）細(xì)胞增殖降低，其機(jī)制與SIRT2 對(duì) EC 細(xì)胞大鼠肉瘤病毒/細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（rat sarcoma virus/extracellular signalregulated kinase，RAS/ERK）通路的調(diào)節(jié)有關(guān)，與本研究結(jié)果一致。

磷酸戊糖途徑是糖酵解支路，該途徑與細(xì)胞增殖密切相關(guān)，其中間產(chǎn)物最終進(jìn)入糖酵解途徑。G6PD 是磷酸戊糖途徑的限速酶，研究［20-22］證實(shí)：G6PD 在多種腫瘤組織或細(xì)胞系中均表現(xiàn)出高表達(dá)和高活性，降低G6PD 的表達(dá)將抑制癌細(xì)胞的增殖［23］。本研究結(jié)果顯示：沉默SIRT2 后細(xì)胞中G6PD mRNA 和蛋白表達(dá)水平均降低，而過(guò)表達(dá)SIRT2 后細(xì)胞中G6PD mRNA 和蛋白表達(dá)水平均升高，SIRT2 對(duì)G6PD 有明顯的正向調(diào)控作用。作為去乙?；福琒IRT2 通過(guò)何種機(jī)制調(diào)控G6PD 的基因表達(dá)需進(jìn)一步研究。為了證實(shí) G6PD 參與SIRT2 對(duì)大腸癌細(xì)胞的有氧糖酵解和細(xì)胞增殖的調(diào)控作用，本研究在 HCT116 細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染SIRT2-siRNA 和G6PD 質(zhì)粒，結(jié)果顯示：與 si-SIRT2 單獨(dú)轉(zhuǎn)染組比較，si-SIRT2&G6PD 質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的有氧糖酵解和增殖能力均得以恢復(fù)。由此推斷 G6PD 參與 SIRT2 調(diào)控大腸癌細(xì)胞葡萄糖的消耗、乳酸的生成和細(xì)胞增殖。已有研究［24-25］證實(shí)：SIRT2 能夠激活G6PD 進(jìn)而促進(jìn)白血病細(xì)胞的克隆形成和增殖，沉默SIRT2 抑制G6PD 活性，導(dǎo)致白血病細(xì)胞的增殖降低，與本研究結(jié)果一致。本研究中免疫組織化學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示：SIRT2 和G6PD 在大腸癌組織中均為高表達(dá)。

綜上所述，SIRT2 促進(jìn)大腸癌細(xì)胞的有氧糖酵解和增殖，其機(jī)制可能與SIRT2 調(diào)控G6PD 的基因表達(dá)有關(guān)。