整合宏基因組學(xué)分析生豬養(yǎng)殖糞污發(fā)酵過程中耐藥基因的動態(tài)變化

趙素君,曹 冶,李江凌,張金靈,劉 銳,王秋實,于吉鋒

(1.四川省畜牧科學(xué)研究院,成都 610066;2.動物遺傳育種四川省重點實驗室,成都 610066)

【研究意義】抗生素是可以抑制或殺死細(xì)菌的小分子,這些小分子通常被用于治療細(xì)菌感染。由于抗生素使用不當(dāng),造成大量細(xì)菌產(chǎn)生抗生素抗性,這些抗性主要是通過耐藥基因形成。耐藥基因是編碼耐藥性狀的一段核苷酸序列(DNA片段)。與其他遺傳物質(zhì)一樣,耐藥基因在細(xì)菌分裂增殖過程中得到復(fù)制。耐藥基因可位于細(xì)菌的染色體上,也可位于染色體外的質(zhì)粒上,質(zhì)粒攜帶的耐藥基因可通過接合、轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)等方式在同種細(xì)菌甚至不同種細(xì)菌的菌株之間傳播。耐藥基因在環(huán)境中的大量存在和抗生素殘留已嚴(yán)重威脅到人類健康。據(jù)報道,世界上每年有多達70萬人因耐藥性問題死亡[1]。實際上,多個國家和全球公共衛(wèi)生組織把抗菌素耐藥性歸為迫在眉睫的危險,并一致認(rèn)為,追蹤其耐藥性和耐藥菌流行對最大限度地減少其對人類健康的威脅至關(guān)重要。堆肥是一種常用的養(yǎng)殖場固體廢棄物處理技術(shù),這種技術(shù)除了在降解有機廢棄物方面行之有效外,還能有效降解抗生素及消減耐藥基因,充分了解堆肥過程中抗生素及耐藥基因消減的規(guī)律、影響因素,不僅對養(yǎng)殖場固體廢棄物利用具有重要意義,也為最大限度減少抗生素及耐藥基因擴散風(fēng)險提供重要參考?！厩叭搜芯窟M展】由于抗生素的使用不當(dāng),導(dǎo)致養(yǎng)殖場固體廢棄物中微生物耐藥基因出現(xiàn)和高濃度殘留[2]。若未經(jīng)有效處理便直接將大量耐藥基因和耐藥菌輸入到環(huán)境中,將導(dǎo)致衛(wèi)生事件的發(fā)生。堆肥是一種有效的處理方式,可以大幅降低沼渣[3]和城市固體垃圾[4]以及大部分畜禽糞污[5-6]等有機固廢中的耐藥基因。但部分耐藥基因,特別是sul1在畜禽廢棄物[7]和城市污泥[8]等多種有機固廢堆肥中都很難清除,且堆肥腐熟期往往發(fā)生反彈[9],導(dǎo)致出現(xiàn)消減效率較低甚至在堆肥后不降反升等問題[10]。【本研究切入點】大多研究是對耐藥基因在具體試驗處理中的消減特征進行表述,但不同堆肥試驗中耐藥基因的消減效果往往差別較大,且耐藥基因種類單一,其具體分子機理尚不明確?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究采用四川大量存在的生豬養(yǎng)殖糞污為材料,用宏基因組學(xué)分析方法來探討堆肥對耐藥基因的消減規(guī)律,以期全面了解四川生豬養(yǎng)殖糞污中各種耐藥基因的消減規(guī)律,同時對其消減的機理進行探討,對生豬的安全生產(chǎn)和畜牧業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有重大意義。

1 材料與方法

1.1 菌種

有效微生物(EM)菌由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院肥料應(yīng)用工程技術(shù)研究中心提供,包括芽孢桿菌、納豆菌、放線菌、酵母菌和木霉菌等多種有益微生物及各種分泌性胞外酶類,有效活菌數(shù)>1×1010個/mL。

1.2 主要試劑和儀器

糞便DNA提取試劑盒(Stool DNA Isolation Kit)、樣品均質(zhì)研磨儀(MP FastPrep-24)、Illumina Hiseq 4000測序儀(Illumina)、Qubit?3.0 Fluorometer(Invitrogen Qubit 3)、安捷倫2100生物分析儀(Agilent 2100)、全自動紫外凝膠成像系統(tǒng)(BIO-RAD Gel Doc XR+)。

1.3 方法

1.3.1 堆肥制備 在四川省畜牧科學(xué)研究院養(yǎng)豬所養(yǎng)豬基地,將同一豬圈的新鮮豬糞進行糞尿干濕分離,分離后的干豬糞混合均勻,再隨機分為添加EM菌的實驗組和不添加EM菌的對照組,兩組分別堆成圓錐形糞堆,糞堆高1.2 m,底部直徑2 m,并保持無其他污物混入。實驗組按照1 t糞便1 kg EM菌發(fā)酵的比例添加EM菌,添加時先根據(jù)糞便的干濕度,用水稀釋EM菌原液(稀釋比例1∶10～1∶20),灑施并均勻混合,最終糞便濕度控制在40%～50%。

1.3.2 樣品采集及總DNA提取 在堆肥第1、4、8、12、16、22、29天采樣。每次分別在堆肥上層(離頂部5 cm)、中層(離頂部35 cm)和底層(離底部5 cm)處按照多點采集原則采集樣品,然后將樣品全部混合,每次采集樣本的總混合量為500 g,采集后的樣品立即置于冰盒中運往實驗室,-20 ℃保存,按DNA提取試劑盒說明書操作步驟提取和純化樣品總DNA。提取DNA用于宏基因組高通量測序分析。

1.3.3 文庫構(gòu)建和上機測序 取1 μg DNA樣品,使用NEB Next?Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina (NEB, USA)進行文庫構(gòu)建,用Covaris超聲波破碎儀隨機打斷成長度約為350 bp的片段,依次將DNA片段的末端進行修復(fù)、添加Poly A尾、在片段兩端添加測序接頭、純化DNA片段、PCR擴增片段等來完成整個文庫制備。

文庫構(gòu)建完成后,須進行文庫質(zhì)量檢測。先使用Qubit 3.0對文庫進行初步定量,稀釋文庫至2 ng/μL,隨后使用Agilent 2100對文庫的insert size進行檢測,insert size符合預(yù)期后,使用Q-PCR方法對文庫的有效濃度進行準(zhǔn)確定量(文庫有效濃度>3 nmol/L),以保證文庫質(zhì)量。庫檢合格后,把不同文庫按照有效濃度及目標(biāo)下機數(shù)據(jù)量的需求pooling后用Illumina Hiseq 4000測序。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理 使用Readfq (V8, https://github.com/cjf!elds/readfq)對Illumina HiSeq測序平臺獲得的原始數(shù)據(jù)(Raw data)進行預(yù)處理,獲得有效數(shù)據(jù)(Clean data)。使用MEGAHIT軟件(v1.0.4-beta)對Clean data進行組裝分析,將組裝得到的Scaffolds從N連接處打斷,得到不含N的Scaftigs。使用MetaGeneMark (v2.10, http://topazatech.edu/GeneMark/)對各樣品的Scaftigs (≥500 bp)進行開放閱讀框(ORF)預(yù)測,并過濾掉預(yù)測結(jié)果中長度小于100 nt的信息。對ORF預(yù)測結(jié)果,采用CD-HIT軟件(v4.5.8, http://www.bioinformatics.org/cd-hit/)進行去冗余,獲得非冗余的初始gene catalogue。使用Bowtie2 (Bowtie2.2.4)將各樣品的Clean data比對至初始gene catalogue,計算得到基因在各樣品中比對上的reads數(shù)目,過濾掉各個樣品中reads數(shù)目≤2的基因,獲得最終用于后續(xù)分析的gene catalogue (Unigenes)。依據(jù)比對上的reads數(shù)目及基因長度,計算得到各基因在各樣品中的豐度信息,基于gene catalogue中各基因在各樣品中的豐度信息,進行基本信息統(tǒng)計等分析。

使用CARD數(shù)據(jù)庫提供的Resistance Gene Identifier(RGI)軟件將Unigenes與CARD數(shù)據(jù)庫(https://card.mcmaster.ca/)進行比對(默認(rèn)evalue <1E-30),根據(jù)比對結(jié)果,結(jié)合Unigenes的豐度信息,統(tǒng)計出各抗生素耐藥性本體(ARO)的相對豐度。

2 結(jié)果與分析

2.1 測序數(shù)據(jù)質(zhì)控及基因組裝結(jié)果

樣品經(jīng)初檢合格后,進行文庫構(gòu)建、檢測并采用Illumina PE150進行測序。測序得到的原始數(shù)據(jù)(Raw data)進行質(zhì)控及宿主過濾,得到有效數(shù)據(jù)(Clean data)。由表1可知,檢測的Clean Q20[Clean data中測序錯誤率小于0.01(質(zhì)量值大于20)的堿基數(shù)目的百分比]達96.7%以上,Clean Q30[Clean data 中測序錯誤率小于0.001(質(zhì)量值大于30)的堿基數(shù)目的百分比]達91%以上,有效率[有效數(shù)據(jù)( Clean data)與原始數(shù)據(jù)( Raw data)的百分比]達99%以上,說明數(shù)據(jù)真實可靠。

表1 數(shù)據(jù)預(yù)處理統(tǒng)計Table 1 Data preprocessing statistics

采用Bowtie2軟件比對至各樣品組裝后的Scaftigs上,過濾掉500 bp以下的片段,并進行統(tǒng)計分析。由表2可知,樣品中Scaftigs數(shù)量達200 000以上,平均長度達1080 bp以上,N50長度達1100 bp以上,N90長度達560 bp以上。說明,組裝分析準(zhǔn)確可靠。

2.2 堆肥期間耐藥基因的變化

使用CARD數(shù)據(jù)庫提供的Resistance Gene Identifier (RGI)軟件[11-12]將Unigenes與CARD數(shù)據(jù)庫(https://card.mcmaster.ca/)進行比對,結(jié)合Unigenes的豐度信息,共發(fā)現(xiàn)613個耐藥基因,分別對32類抗生素產(chǎn)生耐藥(表3)。

表3 堆肥期間耐藥基因豐度變化Table 3 Changes of antibiotic resistance gene during composting

續(xù)表3 Continuedtable 3

對照組在第1、4、8、12、16、22、29天的耐藥基因總豐度比例分別為3.10E-03、1.13E-03、2.17E-03、2.54E-03、9.84E-04、8.79E-04、6.96E-04,耐藥基因豐度在第1天最高,第4天迅速下降,在第8天迅速反彈,在第12天達到第二個高峰,然后迅速下降,豐度回歸低值。實驗組在第1、4、8、12、16、22、29天的耐藥基因總豐度比例分別為3.93E-03、1.43E-03、3.11E-03、1.36E-03、1.14E-03、7.41E-04、6.94E-04,其變化趨勢與對照組類似,不過第二個峰值提前到第8天。

對照組在第1、4、8、12、16、22、29天的豐度較高的耐藥基因類型分別為:青霉烷類抗生素、頭孢菌素類抗生素、四環(huán)素類抗生素,磷霉素、頭孢菌素類抗生素、青霉烷類抗生素,青霉烷類抗生素、頭孢菌素類抗生素、四環(huán)素類抗生素,青霉烷類抗生素、頭孢菌素類抗生素、氨基糖苷類抗生素,頭孢菌素類抗生素、糖肽類抗生素、青霉烷類抗生素,頭孢菌素類抗生素、青霉烷類抗生素、糖肽類抗生素,磷霉素、頭孢菌素類抗生素、青霉烷類抗生素。而實驗組在第1、4、8、12、16、22、29天的豐度較高的耐藥基因類型分別為:青霉烷類抗生素、頭孢菌素類抗生素、氨基糖苷類抗生素,磷霉素、青霉烷類抗生素、頭孢菌素類抗生素,青霉烷類抗生素、頭孢菌素類抗生素、氨基糖苷類抗生素,青霉烷類抗生素、頭孢菌素類抗生素、磷霉素,青霉烷類抗生素、頭孢菌素類抗生素、氨基糖苷類抗生素,磷霉素、頭孢菌素類抗生素、糖肽類抗生素,磷霉素、頭孢菌素類抗生素、青霉烷類抗生素。

2.3 堆肥期間青霉烷類抗生素(Penam)耐藥基因的變化

共發(fā)現(xiàn)133個對青霉烷類抗生素產(chǎn)生抗性的耐藥基因。按其耐藥產(chǎn)生原理,共有5個類型。分別為抗生素外排(Antibiotic efflux)、抗生素失活(Antibiotic inactivation)、降低抗生素滲透性(Reduced permeability to antibiotic)、改變抗生素靶位點(Antibiotic target alteration)、替換抗生素靶位點(Antibiotic target replacement)?？股赝馀蓬愋突蚬灿?6個,抗生素失活類型基因共有90個,降低抗生素滲透性類型基因共有7個,改變抗生素靶位點類型基因共有8個,替換抗生素靶位點類型基因共有7個。這些類型的基因豐度在第1天最高,在第4天豐度迅速下降,然后豐度再次升高,實驗組的各個類型耐藥基因和對照組降低抗生素滲透性類型基因、改變抗生素靶位點類型基因、替換抗生素靶位點類型基因在第8天達到第二個高峰,然后持續(xù)下降。對照組抗生素外排類型基因和抗生素失活類型基因,在第12天達到第二個高峰,然后持續(xù)下降(圖1)。

圖1 堆肥期間青霉烷類抗生素(Penam)耐藥基因變化Fig.1 Changes of Penam resistance genes during composting

2.4 堆肥期間頭孢菌素類抗生素(Cephalosporin)耐藥基因的變化

共發(fā)現(xiàn)141個對頭孢菌素類抗生素產(chǎn)生抗性的耐藥基因。按其耐藥產(chǎn)生原理,共有5個類型。分別為抗生素外排、抗生素失活、降低抗生素滲透性、改變抗生素靶位點、替換抗生素靶位點?？股赝馀蓬愋突蚬灿?5個,抗生素失活類型基因共有100個,降低抗生素滲透性類型基因共有7個,改變抗生素靶位點類型基因共有8個,替換抗生素靶位點類型基因共有7個。這些類型的基因豐度在第1天最高,在第4天豐度迅速下降,然后豐度再次升高,實驗組的各個類型耐藥基因和對照組降低抗生素滲透性類型基因、改變抗生素靶位點類型基因、替換抗生素靶位點類型基因在第8天達到第二個高峰,然后持續(xù)下降。對照組抗生素外排類型基因和抗生素失活類型基因,在第12天達到第二個高峰,然后持續(xù)下降(圖2)。

圖2 堆肥期間頭孢菌素類抗生素(Cephalosporin)耐藥基因變化Fig.2 Changes of Cephalosporin resistance genes during composting

2.5 堆肥期間氨基糖苷類抗生素(Aminoglycoside antibiotic)耐藥基因的變化

共發(fā)現(xiàn)102個對氨基糖苷類抗生素產(chǎn)生抗性的耐藥基因。按其耐藥產(chǎn)生原理,共有3個類型。分別為抗生素外排、抗生素失活、改變抗生素靶位點?？股赝馀蓬愋突蚬灿?2個,抗生素失活類型基因共有74個,改變抗生素靶位點類型基因共有6個。這些類型的基因豐度在第1天最高,在第4天豐度迅速下降,然后豐度再升高,實驗組的耐藥基因豐度在第8天達到第二個高峰,而對照組的耐藥基因豐度在第12天達到第二個高峰,然后持續(xù)下降(圖3)。

圖3 堆肥期間氨基糖苷類抗生素(Aminoglycoside antibiotic)耐藥基因的變化Fig.3 Changes of Aminoglycoside antibiotic resistance genes during composting

2.6 堆肥期間磷霉素類抗生素(Fosfomycin)耐藥基因的變化

共發(fā)現(xiàn)7個對磷霉素類抗生素產(chǎn)生抗性的耐藥基因。按其耐藥產(chǎn)生原理,共有3個類型,分別為抗生素外排、抗生素失活、改變抗生素靶位點?？股赝馀蓬愋突蚬灿?個,抗生素失活類型基因共有5個,改變抗生素靶位點類型基因共有1個?？股厥Щ铑愋突蜇S度在第4天最高,在第8天豐度迅速下降,實驗組的豐度在第16天達到第二個高峰,而對照組的耐藥基因豐度在第12天才達到第二個高峰,然后持續(xù)下降,維持在一個較高的水平上。其它2種類型基因豐度在第1天最高,在第4天豐度迅速下降,然后豐度再次升高,實驗組的耐藥基因豐度在第8天達到第二個高峰,而對照組的耐藥基因豐度在第12天達到第二個高峰,然后持續(xù)下降(圖4)。

圖4 堆肥期間磷霉素類抗生素(Fosfomycin)耐藥基因變化Fig.4 Changes of Fosfomycin resistance genes during composting

2.7 堆肥期間糖肽類抗生素(Glycopeptide antibiotic)耐藥基因的變化

共發(fā)現(xiàn)43個對糖肽類抗生素產(chǎn)生抗性的耐藥基因。按其耐藥產(chǎn)生原理,只有1個類型,為改變抗生素靶位點。該類型的基因豐度在第1天最高,在第4天豐度迅速下降,然后豐度再次升高,實驗組的耐藥基因豐度在第8天達到第二個高峰,對照組的耐藥基因豐度在第12天達到第二個高峰,然后持續(xù)下降(圖5)。

圖5 堆肥期間糖肽類抗生素(Glycopeptide antibiotic)耐藥基因變化Fig.5 Changes of Glycopeptide antibiotic resistance genes during composting

2.8 堆肥期間四環(huán)素類抗生素(Tetracycline antibiotic)耐藥基因的變化

共發(fā)現(xiàn)91個對四環(huán)素類抗生素產(chǎn)生抗性的耐藥基因。按其耐藥產(chǎn)生原理,共有5個類型,分別為抗生素外排、抗生素失活、降低抗生素滲透性、改變抗生素靶位點、抗生素靶位點保護。抗生素外排類型基因共有77個,抗生素失活類型基因共有2個,降低抗生素滲透性類型基因共有3個,改變抗生素靶位點類型基因共有7個,抗生素靶位點保護類型基因共有12個。這些類型的基因豐度在第1天最高,在第4天豐度迅速下降,然后豐度再次升高,實驗組的各個類型耐藥基因和對照組改變抗生素靶位點、降低抗生素滲透性、抗生素失活類型基因,在第8天達到第二個高峰,然后持續(xù)下降。對照組抗生素外排類型和降低抗生素滲透性類型基因,在第12天達到第二個高峰,然后持續(xù)下降(圖6)。

圖6 堆肥期間四環(huán)素類抗生素(Tetracycline antibiotic)耐藥基因變化Fig.6 Changes of Tetracycline antibiotic resistance genes during composting

3 討 論

傳統(tǒng)環(huán)境耐藥性基因檢測通過PCR反應(yīng)(Polymerase chain reaction)[13]、分子雜交[14]等方法來實現(xiàn)。但這些方法需要依賴目標(biāo)基因的保守區(qū)域設(shè)計引物或DNA探針來實現(xiàn),一次性檢測量較少,操作比較麻煩。而宏基因組學(xué)技術(shù),避免了這些麻煩,且可以用來鑒定新的耐藥基因,其通量高、速度快,具有傳統(tǒng)方法所不能具備的優(yōu)勢,因此在本次研究中采用了該方法來進行研究。

本次研究中發(fā)現(xiàn)養(yǎng)殖廢棄物經(jīng)堆肥處理后,耐藥基因的豐度下降到低值。說明,堆肥可有效降低糞污中的耐藥基因,避免耐藥性的廣泛傳播。這與一些研究[6,15]發(fā)現(xiàn)在糞污堆肥發(fā)酵過程中,大部分耐藥基因的相對豐度有所降低的結(jié)果相似。

但本研究發(fā)現(xiàn)養(yǎng)殖廢棄物中的耐藥基因的消減出現(xiàn)兩個峰值,第一個耐藥基因豐度峰值出現(xiàn)在試驗起始時,在第4天迅速下降。這可能是由于耐藥基因大部分由樣品原始菌群中的耐藥菌提供,而這些原始菌群經(jīng)4 d發(fā)酵,大量自然凋亡,在菌群中的比例下降,新的耐藥菌還未大量產(chǎn)生,從而導(dǎo)致樣品中耐藥基因的豐度下降到低值。隨著發(fā)酵的繼續(xù)進行,樣品中細(xì)菌數(shù)量進一步增加,新的耐藥菌也大量出現(xiàn),所以對照組第12天、實驗組第8天的耐藥基因豐度又達到第二個峰值,然后這一批細(xì)菌又大量自然凋亡,樣品中耐藥基因的豐度又下降到低值。這說明,養(yǎng)殖廢棄物中的耐藥基因的消減可能隨著廢棄物中的細(xì)菌凋亡規(guī)律而出現(xiàn)波狀起伏,耐藥基因的豐度一波比一波低,最終消減下去。研究發(fā)現(xiàn)耐藥基因的消減是通過改變堆肥過程中的微生物菌群來實現(xiàn)[7,16-18],這與本研究的結(jié)果一致。但是可能是由于這些研究的采樣周期設(shè)計較長,從而忽略了耐藥基因消減的波狀起伏規(guī)律。

研究發(fā)現(xiàn)在養(yǎng)殖廢棄物中有大量的抗生素耐藥基因存在,如四環(huán)素類抗生素(Tetracycline antibiotic)、磺胺類抗生素(Sulfonamide antibiotic)、氟喹諾酮類抗生素(Fluoroquinolone antibiotic)、內(nèi)酰胺類抗生素(Monobactam)、大環(huán)內(nèi)酯類抗生素(Macrolide antibiotic)等,各個樣品中耐藥基因的種類及豐度并不相同,這可能與當(dāng)?shù)厥褂玫目股胤N類及劑量有關(guān)[19-25]。在四川,青霉烷類抗生素(Penam)、頭孢菌素類抗生素(Cephalosporin)、氨基糖苷類抗生素(Aminoglycoside antibiotic)、糖肽類抗生素(Glycopeptide antibiotic)、四環(huán)素類抗生素(Tetracycline antibiotic)、磷霉素類抗生素(Fosfomycin)是現(xiàn)實中最常用的抗生素種類,使用范圍廣、使用量大。長期使用的結(jié)果導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性的廣泛產(chǎn)生,從而使這些抗生素耐藥菌在環(huán)境中占比較高。在本次研究中,發(fā)現(xiàn)這幾種抗生素耐藥基因是豐度較高的耐藥基因,本研究的分析結(jié)果與上面推斷一致。

磷霉素類抗生素(Fosfomycin)是一種小分子廣譜抗菌藥物,對多種革蘭陰性、革蘭陽性菌均有良好抗菌作用,于1969年被首次報道。目前有3種磷霉素制劑,即口服制劑磷霉素鈣、磷霉素氨丁三醇和靜脈制劑磷霉素鈉,主要用于治療腸道感染和尿路感染等。細(xì)菌暴露于中、低劑量磷霉素中極易發(fā)生誘導(dǎo)耐藥[26]。在本研究中發(fā)現(xiàn)磷霉素類抗生素耐藥基因豐度一直維持在較高的水平,主要通過靶位點失活來產(chǎn)生耐藥性。這可能是由于樣品中存在低劑量的磷霉素,而這些磷霉素在堆肥過程中不易降解,導(dǎo)致細(xì)菌持續(xù)暴露在低劑量磷霉素中,從而導(dǎo)致耐藥。

4 結(jié) 論

養(yǎng)殖廢棄物經(jīng)堆肥處理后,耐藥基因的豐度呈現(xiàn)波動式消減,最終下降到低值,堆肥可有效避免耐藥性的廣泛傳播。