煙草根結(jié)線蟲病對煙株根際土壤真菌群落結(jié)構(gòu)及多樣性的影響

黃飛燕,肜 磊,薛至勤,葉賢文,王志江,謝永輝,柯艷果,趙婭紅,吳治興,呂怡穎,余 磊,潘義宏

(1.昆明學(xué)院,昆明 650214;2.云南省煙草公司昆明市公司,昆明 650300;3.西南林業(yè)大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院,昆明 650224)

【研究意義】煙草根結(jié)線蟲(Meloidogynespp.)因危害煙株根部,多有瘤狀根結(jié),又稱為根瘤線蟲,部分地方稱之為“馬鹿根”和“雞爪根”[1]。根結(jié)線蟲生命力極強(qiáng)、生活周期短、傳播途徑多[2],且容易與煙草黑脛病、青枯病和根腐病等其他煙草根莖病害引起復(fù)合侵染,使危害程度加重。傳統(tǒng)化學(xué)防治方法,不僅防治效果不佳,且容易破壞土壤生態(tài)環(huán)境,造成土壤板結(jié)、土壤微生物結(jié)構(gòu)和土壤理化性質(zhì)改變等問題[3-4]。由此可見,探索根際微生物的功能、微生物群落及其環(huán)境因子之間的互作關(guān)系對土傳病害的防治具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】土壤微生物是土壤的活性部分和土壤生態(tài)系統(tǒng)最重要的組成部分,其數(shù)量和活性與植物病害發(fā)生密切相關(guān)[5]。植物感染病原菌,特別是土傳病害,根際土壤中的微生物群落結(jié)構(gòu)會發(fā)生改變[6-9],健康植株與患病植株根際土壤微生物數(shù)量、種類、多樣性和豐富度等均呈現(xiàn)顯著差異[10-15]。根際土壤中存在大量拮抗微生物類群,可以通過抑制病原微生物活性提高植物抗病性[16-17]。另外,植物根際土壤微生態(tài)環(huán)境中的生物因子和非生物因子共同作用,影響土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的塑造與土傳病害的發(fā)生與流行[18-20]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】植物根系、病原菌和根際微生物組成一個小型的生態(tài)系統(tǒng),三者相互影響,相互作用。煙草根結(jié)線蟲病是典型的土傳病害,其發(fā)生流行與土壤微生態(tài)環(huán)境有著密切關(guān)系。因此,進(jìn)一步探明影響煙草根結(jié)線蟲病發(fā)病的土壤微生態(tài)環(huán)境,尋找綠色生態(tài)、環(huán)境友好型煙草根結(jié)線蟲病防治方法迫在眉睫?！緮M解決的關(guān)鍵問題】采用Illumina MiSeq高通量測序技術(shù),比較烤煙根結(jié)線蟲病健康煙株與患病煙株根際土壤真菌群落結(jié)構(gòu)及土壤養(yǎng)分特征,明確煙草根結(jié)線蟲病發(fā)生的微生態(tài)機(jī)制,以期為相關(guān)病害的高效防控提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)烤煙品種為紅花大金元(以下簡稱紅大)。試驗(yàn)采用室內(nèi)盆栽方法,共計(jì)2個處理,每盆土壤質(zhì)量為50 kg,每個處理3盆,每盆定植3株煙,9株煙為1個小區(qū)重復(fù),共3次重復(fù)。按常規(guī)方法育苗,待煙苗4葉1心時,移栽至盆中。供試土壤為最近3年或3年以上均有根結(jié)線蟲病發(fā)生且發(fā)病率大于25%的紅壤土病土(南方根結(jié)線蟲,數(shù)量≥500 條/g),以同區(qū)域最近3年或3年以上沒有根結(jié)線蟲病發(fā)生的紅壤土作對照。

1.2 樣品采集

移栽后60 d隨機(jī)選取健康株和病株各3株,采用抖動法收集附著在根上0～4 mm 的根際土混合樣各1000 g,2個處理,3個重復(fù),共計(jì)6個樣品。去除土樣中的雜物、細(xì)根后用無菌密封塑料袋裝好并貼上標(biāo)簽,及時帶回實(shí)驗(yàn)室放-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 樣品測定項(xiàng)目及方法

1.3.1 煙株根結(jié)線蟲病病害情況調(diào)查 采用糖水離心漂浮法收集根際土壤根結(jié)線蟲[21]。按照GB/T 23222—2008的方法調(diào)查病土和健康土煙株根結(jié)線蟲病發(fā)病情況,計(jì)算發(fā)病率和病情指數(shù)。

1.3.2 土壤養(yǎng)分測定 參照鮑士旦[22]的方法對土壤pH、有機(jī)質(zhì)、堿解氮、速效鉀和速效磷等土壤養(yǎng)分進(jìn)行檢測。

1.3.3 土壤基因組DNA提取 根際土壤樣品DNA采用Fast DNA?SPIN Kit (MP,USA)試劑盒提取。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的提取質(zhì)量,DNA濃度和純度采用NanoDrop 2000進(jìn)行檢測[23]。

1.3.4 18S rRNA基因的PCR擴(kuò)增及MiSeq測序 針對18S rRNA基因的ITS-1可變區(qū),使用引物ITS2 R(5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′)和ITS1 F(5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′)進(jìn)行PCR擴(kuò)增[24]。采用TransGen AP221-02DNA合成酶,在ABI GeneAmp?9700型PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增,PCR產(chǎn)物回收使用AXYGEN公司的凝膠回收試劑盒(AxyPrepDNA)切膠,Tris_HCl洗脫,2%瓊脂糖進(jìn)行電泳檢測。土壤樣品高通量測序委托上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成(利用Illumina MiSeq平臺)。

1.3.5 數(shù)據(jù)質(zhì)控及分析 Miseq測序得到的PE reads參照Caporaso等[25]和Edgar Robert等[26]的方法,通過FLASH、Trimmomatic、Usearch(Version 7.0)和Uparse等軟件對序列進(jìn)行拼接、質(zhì)控和過濾,得到有效序列,并在97%的相似性水平上劃分操作分類單元[23];參照Wang等[27]和Altschul等[28]的方法對代表序列進(jìn)行物種注釋。采用Mothur軟件(version v.1.30.1)制作稀釋度曲線,并計(jì)算文庫覆蓋率(Coverage)、Simpson、Chao1、Shannon及ACE等物種多樣性與豐富度指數(shù)。土壤樣品主坐標(biāo)分析(PcoA)運(yùn)用Bray-Curtis距離算法、Qiime軟件(Version 1.7.0)進(jìn)行。采用Vegan軟件進(jìn)行RDA冗余分析,分析樣本、菌群和環(huán)境因子三者之間的關(guān)系;不同環(huán)境因子與微生物物種組成的關(guān)系利用Spearman相關(guān)系數(shù)分析,微生物分類與環(huán)境因子之間的相關(guān)性利用heatmap圖評估。

2 結(jié)果與分析

2.1 煙株根結(jié)線蟲病發(fā)病情況

煙株根結(jié)線蟲病發(fā)病情況如表1所示:病土煙株發(fā)病率為100.00%,健康土煙株發(fā)病率為22.62%;病土煙株病情指數(shù)為82.93,健康土煙株病情指數(shù)為18.89。

表1 病土和健康土煙株根結(jié)線蟲病發(fā)病情況Table 1 Incidence of tobacco root-knot nematodes both in sick soil and healthy soil of different varieties

2.2 煙株根際土壤真菌OTU豐度和Alpha多樣性

隨著測序數(shù)據(jù)的上升,基于Shannon指數(shù)的稀釋度曲線斜率漸漸下降并趨向平坦,表明測序數(shù)量足夠(圖1)。2個處理覆蓋率(Coverage)分別為98.30%和98.12%,說明樣本測序結(jié)果能反應(yīng)土壤微生物的實(shí)際情況,可開展后續(xù)的數(shù)據(jù)分析。

圖1 煙株根際土壤中真菌 Shannon 指數(shù)稀釋度曲線Fig.1 Shannon index-based rarefaction curves of fungus in rhizosphere soils of root-knot nematodes of tobacco plants

根際土壤真菌OUT豐度病株與健康煙株分別為1170和2120個,健康煙株土壤真菌OUT豐度是病株的1.81倍(表2)。健康煙株與病株根際土壤真菌OTUs分布韋恩圖(圖2)表明,2個處理根際土壤中OTUs一共有3290個,其中共有的OTUs為723個,占總數(shù)的21.98%。健康煙株與病株根際土壤特有的真菌OTUs數(shù)分別為1397和447個,健康煙株根際土壤特有的真菌OTUs數(shù)是病株的3.13倍,說明病害的發(fā)生明顯降低了真菌OUT豐度。土壤樣本Simpson多樣性指數(shù)值越小,Shannon多樣性指數(shù)值越大,表明土壤樣本中群落多樣性越高。本試驗(yàn)中根際土壤Shannon多樣性指數(shù)病株相比健康煙株降低12.16%,Simpson指數(shù)相比健康煙株增加33.33%,表明根結(jié)線蟲病發(fā)生降低了根際土壤真菌微生物群落多樣性水平。另外,根結(jié)線蟲病患病煙株根際土壤中真菌群落豐富度指數(shù)ACE較健康煙株降低52.96%(P<0.05),Chao1指數(shù)較健康煙株降低50.40%(P<0.05),這說明煙株感染根結(jié)線蟲病后,會影響根際土壤中土壤真菌微生物群落的豐富度。

圖2 煙株根際土壤中真菌OTUs數(shù)韋恩圖Fig.2 Venn graph of fungus OTUs distribution in rhizosphere soils between root-knot nematodes of tobacco plants

表2 煙株根際土壤真菌OTU豐度和Alpha多樣性Table 2 Fungus OTU abundance and alpha diversity index in rhizosphere soils of root-knot nematodesof tobacco plants

2.3 患病煙株與健康煙株根際土壤真菌的群落組成及相對豐度

根際土壤真菌區(qū)系在門分類水平上,根結(jié)線蟲病患病煙株與健康煙株主要由子囊菌門(Ascomycota)、被孢霉門(Mortierellomycota)、未分類真菌門(unclassified_k__Fungi)、擔(dān)子菌門(Basidiomycota)、壺菌門(Chytridiomycota)和其它菌門組成(圖3)。根結(jié)線蟲病患病煙株根際土壤中子囊菌門的相對豐度較健康煙株減少29.30%(P<0.05),被孢霉門、未分類真菌門、擔(dān)子菌門、壺菌門和其它菌門的相對豐度較健康煙株分別增加了94.71%(P<0.05)、203.37%(P<0.05)、58.88%(P<0.05)、18.66%和79.3%。

圖3 煙株根際土壤門水平上的真菌豐度Fig.3 Community abundance of fungus on phylum level in rhizosphere soils at root-knot nematodes of tobacco plants

健康煙株根際土壤真菌區(qū)系在屬水平上主要由被孢霉屬(Mortierella,11.27%)、鐮刀菌屬(Fusarium,11.80%)、莖點(diǎn)霉屬(Phoma,6.31%)、未分類叢赤殼科(unclassified_f__Nectriaceae,5.67%)、籃狀菌屬(Talaromyces,5.58%)、未分類毛殼科(unclassified_f__Chaetomiaceae,5.04%)、未分類真菌界(unclassified_k__Fungi,3.39%)、青霉屬(Penicillium,2.33%)等組成(圖4),7個屬約占總量的51.34%。在屬水平上病株根際土壤真菌區(qū)系主要由被孢霉屬(Mortierella,21.93%)、鐮刀菌屬(Fusarium,10.86%)、未分類真菌界(unclassified_k__Fungi,10.29%)、青霉屬(Penicillium,8.45%)和未分類毛殼科(unclassified_f__Chaetomiaceae,5.63%)組成,5個屬約占總量的57.16%。病株根際土壤中被孢霉屬、unclassified_k__Fungi屬、青霉屬的相對豐度分別較健康煙株增加94.59%、203.27%和262.79%,且差異均達(dá)到顯著水平(P<0.05)。這說明根結(jié)線蟲病影響烤煙根際土壤真菌群落的分布和相對豐度,易造成某些優(yōu)勢菌群的大量繁殖,導(dǎo)致部分真菌屬水平上的比例失衡。

圖4 煙株根際土壤屬水平上的真菌豐度Fig.4 Community abundance of fungus on genus level in rhizosphere soils at root-knot nematodes of tobacco plants

由圖5可知,被孢霉屬真菌主要分布于M.sarnyensis和unclassified_g__Mortierella,unclassified_k__Fungi屬主要分布于unclassified_k__Fungi,青霉屬真菌主要分布于unclassified_g__Penicillium。病株根際土壤中unclassified_g__Fusarium(10.44%)、unclassified_g__Mortierella(14.36%)和unclassified_k__Fungi(10.29%)相對豐度之和為35.09%,而健康煙株根際土壤中三者之和為20.70%。同時,病株根際土壤中M.sarnyensis、unclassified_g__Mortierella和unclassified_k__Fungi的相對豐度較健康煙株分別增加139.01%、134.83%和203.27%,且均達(dá)到顯著水平(P<0.05)。unclassified_g__Penicillium在根結(jié)線蟲病病株根際土壤中有明顯積累,相對豐度較健康煙株增加361.94%(P<0.05)?？傮w上根結(jié)線蟲病對煙株根際土壤真菌群落的組成及相對豐度均有明顯影響。

圖5 煙株根際土壤種水平上的真菌豐度Fig.5 Community abundance of fungus on species level in rhizosphere soils at root-knot nematodes of tobacco plants

2.4 真菌群落組成的PCoA聚類分析

由圖6可知,對根際土壤樣品差異性的解釋度主成分1(PC1)為69.42%,主成分2(PC2)為10.09%,兩者可解釋全部土壤樣品79.51%的差異。根結(jié)線蟲病患病煙株的根際土壤真菌群落主要分布在PC1的正值區(qū)域,健康煙株的根際土壤真菌群落主要分布在PC1的負(fù)值區(qū)域,以上結(jié)果表明健康煙株和根結(jié)線蟲病患病煙株的根際土壤真菌物種組成有著明顯差異。

圖6 煙株根際土壤真菌群落組成的PCoA分析Fig.6 PCoA cluster analysis of fungus community in rhizosphere soils of root-knot nematodes of tobacco plants

2.5 根際土壤真菌群落結(jié)構(gòu)與土壤養(yǎng)分的關(guān)聯(lián)分析

2.5.1 根際土壤養(yǎng)分特征 由表3可知,根結(jié)線蟲病病株根際土壤pH較健康煙株降低9.47%。有機(jī)質(zhì)含量在二者之間無顯著差異。病株水解氮、有效磷和速效氮含量分別較健康煙株增加36.77%(P<0.05)、45.97%(P<0.05)和31.07%(P<0.05)。以上結(jié)果說明,健康煙株與病株根系對土壤養(yǎng)分吸收差異明顯,病株根際土壤pH較低,水解氮、有效磷和速效氮等含量高于健康煙株。

表3 健康煙株與病株根際土壤養(yǎng)分特征Table 3 Soil nutrient characteristics of rhizosphere soils between health plants and root-knot nematodes infected tobacco plants

2.5.2 關(guān)聯(lián)分析 為分析根際土壤真菌群落結(jié)構(gòu)與土壤養(yǎng)分的關(guān)系,以真菌群落在屬水平上的豐度數(shù)據(jù),健康煙株和發(fā)病煙株根際土壤養(yǎng)分?jǐn)?shù)據(jù)為土壤環(huán)境變量,進(jìn)行RDA分析即冗余分析(圖7)。RDA分析可直觀地反映出樣品、菌群、環(huán)境因子三者之間的關(guān)系或者兩兩之間的關(guān)系,樣本間距離越近,表示2個樣品的微生物群落差異越小。綠色箭頭代表不同的物種,物種與環(huán)境因子之間的夾角代表二者之間的相關(guān)性;紅色箭頭代表不同的環(huán)境因子,箭頭越長,表明該環(huán)境因子的影響程度越大,環(huán)境因子箭頭間的夾角代表正、負(fù)相關(guān)性(銳角:正相關(guān);鈍角:負(fù)相關(guān);直角:無相關(guān)性)。

圖7 煙株根際土壤真菌組成與土壤養(yǎng)分的RDA冗余分析Fig.7 Redundancy analysis of fungus community and soil nutrient in rhizosphere soils of health and root-knot nematodes infected tobacco plants

RDA 1和RDA 2兩軸對樣品的解釋度分別為69.08%和1.17%,兩軸累計(jì)解釋度為70.25%,占主導(dǎo)地位。根際土壤pH、有機(jī)質(zhì)(OM)和水解氮(HN)對菌群的影響程度大于有效磷(EP)和速效鉀(AP)。不同養(yǎng)分因子之間均呈不同程度的相關(guān)性。

對根際土壤真菌群落(屬水平)與土壤養(yǎng)分進(jìn)行Spearman相關(guān)性分析(表4),屬水平上相對豐度排名前20的物種中,根際土壤pH與籃狀菌屬(Talaromyces)、沙蜥屬(Saitozyma)等屬呈顯著正相關(guān),與鐮刀菌屬(Fusarium)、未分類真菌界(unclassified_k__Fungi)、未分類假球殼目(unclassified_o__Pleosporales)、未分類被孢霉門(unclassified_p__Mortierellomycota)和未分類樓梯孢科(unclassified_f__Stephanosporaceae)等屬呈顯著負(fù)相關(guān)。根際土壤有機(jī)質(zhì)(OM)與索諾萊氏菌屬(Sonoraphlyctis)呈顯著負(fù)相關(guān);水解氮(HN)、有效磷(EP)和速效鉀(AP)均與被孢霉屬(Mortierella)呈極顯著正相關(guān),與未分類真菌界(unclassified_k_Fungi)呈顯著正相關(guān),與未分類赤殼科(unclassified_f_Nectriaceae)、枝孢霉屬(Cladosporium)和小不整球殼屬(Plectosphaerella)等屬呈顯著負(fù)相關(guān)。

表4 根際土壤真菌群落(屬水平)與土壤養(yǎng)分的Spearman相關(guān)性分析Table 4 Spearman correlation analysis of rhizosphere soil fungus community(Genus)with soil nutrient factor

續(xù)表4 Continuedtable 4

3 討 論

土壤微生物結(jié)構(gòu)和功能的多樣性對維持土壤健康和改善土壤的生態(tài)環(huán)境極其重要[29-30]。土壤中病原菌常常和其他微生物類群爭奪有限的營養(yǎng)物質(zhì)或生態(tài)位資源,容易引起微生物群落結(jié)構(gòu)失調(diào)[31],反而加重土傳病害發(fā)生和傳播[32]。土壤微生物多樣性和豐富度越高,越能促進(jìn)植物生長,還能增強(qiáng)植物自身抗性,進(jìn)而抑制土傳病原微生物生長,降低土傳病害侵染風(fēng)險(xiǎn)[33]。本研究健康煙株根際土壤特有的真菌OTUs數(shù)是病株的3.13倍,說明根結(jié)線蟲病害的發(fā)生明顯降低了真菌OUT豐度。根結(jié)線蟲病患病煙株的Shannon指數(shù)相比健康煙株降低12.16%,土壤真菌群落Chao1指數(shù)和豐富度指數(shù)ACE相比健康煙株分別顯著降低50.40%和52.96%,說明根結(jié)線蟲病發(fā)生顯著降低烤煙根際土壤真菌群落的多樣性和豐富度,這與鄭元仙等[23]和陸寧海[13]的研究結(jié)果相似。

根際土壤微生物與植物抗病性密切相關(guān),根際土壤中病原微生物和拮抗微生物相互作用,共同影響植物病害發(fā)生[34]。本研究中unclassified_g__Fusarium、unclassified_g__Mortierella和unclassified_k__Fungi是病株根際土壤真菌群落中的優(yōu)勢菌群,且病株根際土壤中M.sarnyensis、unclassified_g__Mortierella和unclassified_k__Fungi的相對豐度較健康煙株分別增加139.01%、134.83%和203.27%。鐮刀菌屬(Fusarium)是一類土壤中常見的病原菌,引起的煙株鐮刀菌根腐病常與根結(jié)線蟲病形成復(fù)合侵染[35]。被孢霉屬(Mortierella)是根際微生物中常見的有益微生物,在促進(jìn)植物生長和提高植物抵抗力水平等方面具有顯著效果[36]。青霉屬(Penicillium)真菌能參與到有機(jī)物的分解中,有利于土壤多種養(yǎng)分元素的循環(huán)并產(chǎn)生活性代謝產(chǎn)物,降解土壤中部分有害物[37],該類真菌對部分鐮刀菌屬(Fusarium)具有明顯抑制作用[38]。本研究中unclassified_g__Penicillium在根結(jié)線蟲病病株根際土壤中積累明顯,約為健康煙株的4.62倍,這可能是煙株抵抗根結(jié)線蟲病侵染產(chǎn)生的自身抗性反應(yīng),或是由于根際微生態(tài)系統(tǒng)抗性響應(yīng)的結(jié)果[39]。鐮刀菌屬(Fusarium)成為根結(jié)線蟲病患病煙株根際土壤真菌群落中的優(yōu)勢菌群,是否與根結(jié)線蟲病發(fā)生復(fù)合侵染,另外被孢霉屬(Mortierella)和青霉屬(Penicillium)是否與根結(jié)線蟲和鐮刀菌屬(Fusarium)產(chǎn)生拮抗作用,還有待進(jìn)一步研究。

健康煙株與病株根系對土壤養(yǎng)分吸收差異明顯,感染根結(jié)線蟲病煙株根系受損,對土壤養(yǎng)分吸收能力減弱,造成根際土壤養(yǎng)分殘留累積。根際土壤真菌群落結(jié)構(gòu)與土壤養(yǎng)分的關(guān)聯(lián)分析結(jié)果表明,土壤養(yǎng)分與土壤微生態(tài)密切相關(guān),根際土壤pH、有機(jī)質(zhì)和水解氮對根際土壤真菌群落有較大影響。研究表明,煙株土傳病害發(fā)病率與根際土壤pH呈一定負(fù)相關(guān)[18]。本研究中根際土壤pH與土壤常見病原菌鐮刀菌屬(Fusarium)呈顯著負(fù)相關(guān),發(fā)病煙株根際土壤pH呈酸性,顯著低于健康煙株,且鐮刀菌屬(Fusarium)是發(fā)病煙株根際土壤中的優(yōu)勢菌群,這說明土壤酸化促進(jìn)了根際土壤中與根結(jié)線蟲病復(fù)合侵染病原真菌的富集,是引起根結(jié)線蟲病發(fā)生的重要原因。因此調(diào)節(jié)土壤酸性是控制煙株根結(jié)線蟲病發(fā)生的重要措施。水解氮、有效磷和速效鉀等土壤養(yǎng)分與土壤有益微生物被孢霉屬(Mortierella)呈極顯著正相關(guān)。根際土壤真菌群落與土壤養(yǎng)分互作共同影響根結(jié)線蟲病的發(fā)生和流行,二者互作關(guān)系和作用機(jī)制需要進(jìn)一步深入研究,從而為根結(jié)線蟲病防治提供新思路。

4 結(jié) 論

本研究表明,煙草根結(jié)線蟲病發(fā)生明顯降低了真菌OUT豐度和根際土壤真菌群落的多樣性和豐富度。unclassified_g__Fusarium、unclassified_g__Mortierella和unclassified_k__Fungi是根結(jié)線蟲患病煙株根際土壤真菌群落中的優(yōu)勢菌群,且病株根際土壤中M.sarnyensis、unclassified_g__Mortierella和unclassified_k__Fungi的相對豐度較健康煙株高。土壤養(yǎng)分與土壤微生態(tài)密切相關(guān),根際土壤pH、有機(jī)質(zhì)和水解氮對根際土壤真菌群落有較大影響。煙株根際微生態(tài)結(jié)構(gòu)失調(diào)可能是促進(jìn)根結(jié)線蟲病加重并與其他病原菌發(fā)生復(fù)合侵染的主要原因。因此通過有效措施增加根際微生物群落結(jié)構(gòu)的多樣性和穩(wěn)定性、提升煙株根際拮抗微生物活性或降低復(fù)合侵染病原微生物活性來預(yù)防或減輕土傳病害發(fā)生可作為烤煙根結(jié)線蟲病的防控途徑。