基于環(huán)境DNA宏條形碼的鄱陽(yáng)湖真核浮游植物多樣性研究

郭婷　付智豪　周春花　陳金萍　歐陽(yáng)珊　吳小平

摘要：探索鄱陽(yáng)湖真核浮游植物多樣性，可為環(huán)境DNA監(jiān)測(cè)水生態(tài)系統(tǒng)的應(yīng)用及標(biāo)準(zhǔn)化提供基礎(chǔ)資料。于2019年4月在鄱陽(yáng)湖北部通江水道湖區(qū)、中部鄱陽(yáng)湖湖區(qū)和南部人工養(yǎng)殖湖泊區(qū)共設(shè)18個(gè)采樣點(diǎn)，采集鄱陽(yáng)湖環(huán)境水樣，針對(duì)真核浮游植物18S rDNA 基因的V9區(qū)域進(jìn)行PCR擴(kuò)增，高通量測(cè)序并結(jié)合生物信息學(xué)技術(shù)分析鄱陽(yáng)湖浮游植物的群落組成。結(jié)果表明，基于環(huán)境DNA宏條形碼技術(shù)鑒定到浮游植物10門24綱54目101科166屬，其中綠藻門和硅藻門種類較為豐富。中部區(qū)域的浮游植物群落多樣性和均勻度較高，且鄱陽(yáng)湖浮游植物整體豐富度較高。非度量多維尺度分析（NMDS）表明，中部與北部區(qū)域（P=0.004）、南部與北部區(qū)域（P=0.011）之間群落結(jié)構(gòu)差異顯著。冗余分析表明，葉綠素a、pH、流速對(duì)各區(qū)域的浮游植物群落影響較顯著。環(huán)境DNA宏條形碼作為一種新興的生物多樣性監(jiān)測(cè)手段，可快速檢測(cè)鄱陽(yáng)湖浮游植物生物多樣性及其空間分布，為鄱陽(yáng)湖生物多樣性監(jiān)測(cè)以及生態(tài)系統(tǒng)健康評(píng)估提供新的技術(shù)手段。

關(guān)鍵詞：環(huán)境DNA宏條形碼；浮游植物；多樣性；群落結(jié)構(gòu)；鄱陽(yáng)湖

中圖分類號(hào)：Q145? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A? ? ? ? 文章編號(hào)：1674-3075（2023）05-0067-09

浮游生物是水生生態(tài)系統(tǒng)的重要參與者之一，能夠維持水體環(huán)境中食物網(wǎng)的結(jié)構(gòu)和功能（Rubin & Leff， 2007），浮游植物是水生態(tài)系統(tǒng)的主要初級(jí)生產(chǎn)者（Reynolds， 1984），其群落和分布特征可以反映水體的環(huán)境變化和營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)（Reynolds et al， 1993；Chen et al， 2003；Wu et al， 2011）。目前，對(duì)于浮游植物的傳統(tǒng)定量調(diào)查研究都是通過(guò)采集水樣固定后沉淀，然后使用顯微鏡對(duì)其進(jìn)行形態(tài)分類并計(jì)數(shù)（胡鴻鈞和魏印心， 2006；Soares et al， 2011）。傳統(tǒng)的監(jiān)測(cè)方法在形態(tài)鑒定方面存在一定困難，需掌握專業(yè)的分類學(xué)知識(shí)。浮游生物種類繁多且個(gè)體微小，導(dǎo)致難以實(shí)現(xiàn)大量樣本鏡檢，容易產(chǎn)生人工誤差（Xiao et al，2014;Bucklin et al，2016）；此外，傳統(tǒng)方法較難估計(jì)浮游植物的生物多樣性，監(jiān)測(cè)通常僅限于某些群體（Eiler et al，2013;Visco et al， 2015）。

近年來(lái)，快速發(fā)展的環(huán)境DNA （eDNA）技術(shù)提供了新的解決方案，可以更容易評(píng)估生態(tài)系統(tǒng)的生物多樣性。從最簡(jiǎn)單的意義上講，環(huán)境 DNA 是從任何類型的環(huán)境樣本（土壤、水和空氣等）中提取DNA，無(wú)需分離特定生物體（Thomsen & Willerslev， 2015）。環(huán)境DNA宏條形碼（eDNA metabarcoding）技術(shù)通過(guò)對(duì)環(huán)境DNA序列分析即可檢測(cè)物種的存在，無(wú)需干擾或者觀察實(shí)際生物體（Bohmann et al，2014;Thomsen & Willerslev，2015），可用于描述具有高質(zhì)量參考庫(kù)的環(huán)境DNA的分類組成，提供了一種高效率、非侵入性的生物多樣性調(diào)查方法，同時(shí)也提供了克服基于形態(tài)分類法生物評(píng)估局限性的機(jī)會(huì)（Yang & Zhang，2019）。但該方法也存在豐度較低的物種被過(guò)濾、采樣流程等過(guò)程缺乏統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)等問(wèn)題（Bush et al， 2019）。Bombin等（2020）使用環(huán)境DNA宏條形碼技術(shù)，利用部分LSU rDNA和23S rDNA質(zhì)體分子標(biāo)記，闡述了墨西哥北部灣濱海的藻類多樣性。

鄱陽(yáng)湖是長(zhǎng)江流域最大的通江湖泊，對(duì)維持區(qū)域生態(tài)平衡具有重要意義（Li et al， 2019）。盡管人類活動(dòng)和非生物因素對(duì)鄱陽(yáng)湖的生態(tài)系統(tǒng)造成了較為嚴(yán)重的影響，但其作為中國(guó)最大的淡水湖泊，為本地經(jīng)濟(jì)發(fā)展提供了豐富的資源。因此，持續(xù)和長(zhǎng)期的水質(zhì)及生物監(jiān)測(cè)對(duì)于保護(hù)這一生態(tài)系統(tǒng)至關(guān)重要（Wu et al，2013）。鄱陽(yáng)湖浮游植物群落結(jié)構(gòu)的動(dòng)態(tài)變化及驅(qū)動(dòng)機(jī)制成已成為研究熱點(diǎn)（Chen et al，2013），但鮮見利用環(huán)境DNA宏條形技術(shù)的相關(guān)研究。本研究將環(huán)境DNA宏條形碼技術(shù)應(yīng)用于鄱陽(yáng)湖浮游植物群落調(diào)查，旨在揭示鄱陽(yáng)湖浮游植物的組成及空間分布，為鄱陽(yáng)湖水體環(huán)境變化監(jiān)測(cè)提供一種新的技術(shù)手段，這種方法可長(zhǎng)期穩(wěn)定監(jiān)測(cè)生態(tài)系統(tǒng)變化并有機(jī)會(huì)識(shí)別一些響應(yīng)外部干擾的早期信號(hào)。

1? ?材料與方法

1.1? ?樣品采集

根據(jù)各樣點(diǎn)的地理位置，將鄱陽(yáng)湖劃分為3個(gè)采樣區(qū)域，共設(shè)18個(gè)采樣點(diǎn)（圖1），即北部區(qū)域（1～6）主要是通江水道湖區(qū)，中部區(qū)域（7～12）為鄱陽(yáng)湖湖區(qū)，南部區(qū)域（13～18）為人工養(yǎng)殖湖泊，即青嵐湖和軍山湖2個(gè)湖汊。于2019年4月進(jìn)行水樣采集，每個(gè)采樣點(diǎn)使用容量為1 L的有機(jī)玻璃采水器采集樣品，每個(gè)樣點(diǎn)重復(fù)3次。樣品保存在已滅菌并可密封的廣口瓶中，置于冰盒上盡快送回實(shí)驗(yàn)室過(guò)濾。每個(gè)樣品使用0.45 μm的混合纖維素濾膜 （天津津騰）和真空蠕動(dòng)泵（Rocker400， 中國(guó)臺(tái)灣）進(jìn)行抽濾。為了防止在抽濾過(guò)程中的DNA污染，在每次抽濾樣品的同時(shí)，過(guò)濾同體積的超純水作為空白對(duì)照。在樣品抽濾完成之后，將富集DNA的濾膜分別裝入在2 mL離心管中，-20℃保存直至提取。

1.2? ?DNA提取

獲取的樣本采用DNeasy Blood & Tissue Kit試劑盒（DNeasy plant kit， QIAGEN， 德國(guó)）進(jìn)行濾膜DNA的提取，最后用60 [μ]L Elution Buffer洗脫DNA，保存于-20℃冰箱。為確保操作過(guò)程無(wú)污染，提取1張未使用的濾膜作為空白對(duì)照。使用Qubit （Thermo Fisher Scientific，中國(guó)）測(cè)量DNA濃度。

1.3? ?PCR擴(kuò)增

利用通用引物針對(duì)真核浮游植物18S rDNA 基因的 V9 區(qū)域（長(zhǎng)度約130 bp）進(jìn)行PCR擴(kuò)增（Amral-Zettler et al， 2009），并設(shè)置陰性對(duì)照，確保測(cè)定過(guò)程中未受到DNA污染。引物前帶有8個(gè)堿基的barcode。25 μL反應(yīng)體系包括正反向引物（10 μM）各1 μL，5×reaction buffer 5 μL， 5×GC buffer 5 μL， dNTP（2.5 mM） 2 μL， DNA 模板2 μL， ddH2O 8.75 μL， Q5 DNA Polymerase 0.25 μL。反應(yīng)條件如下：98℃預(yù)變性2 min，30個(gè)循環(huán)包括98℃變性15 s、55℃退火30 s、72℃延伸30 s，72℃最后延伸5 min。

每個(gè)樣品重復(fù)擴(kuò)增3份，將同一樣品的PCR產(chǎn)物混合通過(guò)2%的凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，PCR陰性對(duì)照和空白對(duì)照的樣本均未出現(xiàn)擴(kuò)增條帶，表明在采樣及實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程中均未受污染。

1.4? ?高通量測(cè)序

將上述獲取的DNA樣本送至上海派森諾生物科技有限公司進(jìn)行高通量測(cè)序，采用Illumina Miseq平臺(tái)對(duì)樣本DNA片段進(jìn)行雙端（Paired-end）測(cè)序。通過(guò)QIIME軟件（Quantitative Insights Into Microbial Ecology， v1.8.0，http：//qiime.org/）調(diào)用USEARCH（v5.2.236， http：//www.drive5.com/usearch/）檢查并剔除嵌合體序列；之后調(diào)用UCLUST序列比對(duì)工具（Edgar， 2010）對(duì)前述獲得的序列按97%的序列相似度進(jìn)行歸并和OTU劃分，并選取每個(gè)OTU中豐度最高的序列作為該OTU的代表；最后，利用QIIME軟件獲取每個(gè)OTU所對(duì)應(yīng)的分類學(xué)信息。18S rRDA的參考數(shù)據(jù)庫(kù)為 Protist Ribosomal Reference （PR2） （Guillou et al， 2013）。

1.5? ?數(shù)據(jù)分析

物種分類信息使用NCBI中的taxonomy數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行校對(duì)。

測(cè)定每個(gè)取樣點(diǎn)的水深（WD），使用校準(zhǔn)后的多參數(shù)水質(zhì)檢測(cè)儀（YSI，美國(guó)）分別測(cè)量并記錄濁度（Turb）、水溫（WT）、鹽度（Sal）、溶解氧（DO）和pH，使用葉綠素計(jì)（HL-168C06，中國(guó)）測(cè)量葉綠素濃度（Chl-a），使用流速儀（FP111， Global Water，精度為0.1 m/s）測(cè)量流速（V）。每個(gè)樣點(diǎn)另外再采集500 mL水樣保存在樣品瓶中帶回實(shí)驗(yàn)室，紫外分光光度法分析測(cè)定總氮（TN）和總磷（TP）含量。將每個(gè)采樣點(diǎn)的水體理化因子求平均得到每個(gè)區(qū)域的水體理化因子值。

本文采用物種分類關(guān)系圖表示部分浮游植物的物種組成。利用Chao 1指數(shù)（Chao1 index）反映群落豐富度，香農(nóng)指數(shù)（Shannon index， H[']）、辛普森指數(shù)（Gini-Simpson index， GS）反映群落多樣性程度，Pielou均勻度指數(shù)（Pielou evenness index， J[']）度量群落中相對(duì)物種豐富度?；贐ray-Curtis距離矩陣進(jìn)行非度量多維尺度分析（NMDS），通過(guò)相似性分析（ANOSIM）判別樣本組間差異。采用降趨對(duì)應(yīng)分析（DCA）完成對(duì)模型的選擇，對(duì)浮游植物群落和環(huán)境因子的關(guān)系進(jìn)行RDA分析。利用相關(guān)性Heatmap圖直觀觀察各個(gè)群落與環(huán)境因子之間正負(fù)相關(guān)性程度。采用物種優(yōu)勢(shì)度（Y）表示浮游植物類群某一OTU所占的優(yōu)勢(shì)程度。各指數(shù)計(jì)算公式如下：

式中：ni為第i種OTU的個(gè)數(shù)，N為所有OTU總個(gè)數(shù)，fi為第i種OTU在各采樣點(diǎn)出現(xiàn)的頻率。本文將優(yōu)勢(shì)度Y ≥ 0.02的OTU確定為優(yōu)勢(shì)種（白海鋒等，2021）。

以上數(shù)據(jù)在R語(yǔ)言、軟件SPSS 26.0.0.0、軟件Canoco 5 （賴江山， 2013）、圖圖云平臺(tái)（https：//www.cloudtutu.com）、生科云平臺(tái)（https：//www.bioincloud.tech）以及基因云平臺(tái)完成（https：//www.genescloud.cn）完成。

2? ?結(jié)果

2.1? ?水環(huán)境因子

鄱陽(yáng)湖水體理化因子的空間分布見表1。3個(gè)區(qū)域的水溫、溶解氧、總氮和總磷差異不明顯。水溫在20.17～22.12℃，溶解氧在7.26～8.66 mg/L，總氮在1.46～1.90 mg/L，總磷在0.12～0.16 mg/L。各區(qū)域的水深、濁度、鹽度、流速、pH和葉綠素a的差異較大，北部平均水深達(dá)到了9.17 m，流速達(dá)到了0.45 m/s，pH、總氮、總磷也比其他2個(gè)區(qū)域更高，中部的平均濁度最大（31.95），南部最?。?.82）。葉綠素a含量中部最高（12.89 [μ]g/L）。中部和南部的水體pH呈弱堿性，北部水體呈弱酸性。

2.2? ?藻類物種組成及空間分布

根據(jù)區(qū)域?qū)h(huán)境DNA宏條形碼測(cè)序得到的OTU進(jìn)行注釋并分類，共檢測(cè)到2 135個(gè)OTU，隸屬于10門24綱54目101科166屬188種（種未顯示） （表2）。其中，硅藻門（345個(gè)OTU）和綠藻門（679個(gè)OTU）的種類最豐富，而定鞭藻門（8個(gè)OTU）未注釋到屬，褐藻門（12個(gè)OTU）僅注釋到科。因此物種分類關(guān)系圖只顯示這4個(gè)門，且因未注釋到屬的OTU相對(duì)較多，均以未注釋到顯示。硅藻門中的圓篩藻綱相對(duì)豐度最高，綠藻門中共球藻綱溪菜目的溪菜科相對(duì)豐度最高，同時(shí)也存在一些OTU未能準(zhǔn)確鑒定到目或其他分類單元（圖2）。從OTU的分布區(qū)域來(lái)看，南部的OTU數(shù)目比中部和北部的多。硅藻門的OTU主要分布在北部，綠藻門的OTU主要分布在南部，甲藻門、裸藻門的OTU主要分布在中部，金藻門、隱藻門的OTU則主要分布在南部。

在鄱陽(yáng)湖檢測(cè)到的浮游植物群落組成序列相對(duì)豐度見圖3。北部硅藻門的相對(duì)豐度最高，其次是綠藻門，均為優(yōu)勢(shì)類群；與北部不同的是，中部和南部區(qū)域綠藻門的相對(duì)豐對(duì)最高，其次是隱藻門，也均為優(yōu)勢(shì)類群。在整個(gè)調(diào)查區(qū)域內(nèi)，褐藻門和定鞭藻門的相對(duì)豐度均較低。

2.3? ?優(yōu)勢(shì)OTU的確定及其空間分布

在2 135個(gè)OTU中，共有6個(gè)被確定為優(yōu)勢(shì)OTU （表3）。其中，隱藻門2個(gè)，綠藻門2個(gè)，硅藻門1個(gè)，裸藻門1個(gè)。中部和南部OTU2的優(yōu)勢(shì)度最大（0.05和0.11），屬于隱藻門隱藻綱隱藻目，在南部和中部占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)；北部OTU8的優(yōu)勢(shì)度最大（0.05），屬于硅藻門圓篩藻綱海鏈藻目。OTU4的優(yōu)勢(shì)度為0.08，對(duì)應(yīng)綠藻門共球藻綱溪菜目，但僅在南部出現(xiàn)；OTU48的優(yōu)勢(shì)度為0.02，對(duì)應(yīng)裸藻門裸藻綱裸藻目，是北部特有的優(yōu)勢(shì)OTU，也是裸藻門唯一的優(yōu)勢(shì)OTU。

2.4? ?多樣性指數(shù)

通過(guò)計(jì)算香農(nóng)指數(shù)（H[']）、辛普森指數(shù)（GS）、Pielou均勻度（J[']）和Chao 1指數(shù)，對(duì)鄱陽(yáng)湖浮游植物的群落進(jìn)行多樣性分析，并繪制多樣性指數(shù)差異檢驗(yàn)箱線圖（圖4）。在3個(gè)分組的樣本間，H[']、GS和J[']的變化趨勢(shì)大致相似。H[']均值為3.18（1.27～4.01），GS均值為0.87（0.59～0.96），J[']均值為0.50，最大值是0.62；中部的H[']、GS和J[']均較南部和北部的高，說(shuō)明中部的浮游植物群落的多樣性和均勻度較高。Chao 1指數(shù)的平均值為726.31（385.22～1129.51），其值較大，說(shuō)明鄱陽(yáng)湖浮游植物群落豐富度較高。但3組樣本的各多樣性指數(shù)之間沒(méi)有顯著差異性（P>0.05）。

2.5? ?NMDS分析

對(duì)北部、中部和南部3組樣本的群落結(jié)構(gòu)組成進(jìn)行了NMDS分析。Stress值為0.0922，表明結(jié)果較好；R值大于0，說(shuō)明各組之間的距離大于組內(nèi)距離；整體P值小于0.01，說(shuō)明分組樣本間的浮游植物群落結(jié)構(gòu)組成具有極顯著性差異（圖5）。南部和北部的部分樣點(diǎn)距離較近，但大部分樣點(diǎn)之間的距離較遠(yuǎn)，因此南、北部之間的群落結(jié)構(gòu)組成具有一定的差異；進(jìn)一步的ANOSIM分析表明，南部與中部之間的群落結(jié)構(gòu)組成無(wú)顯著差異（R=0.263， P=0.06）；中部與北部的群落結(jié)構(gòu)組成具有極顯著差異（R=0.343， P=0.004）；南部與北部的浮游植物群落結(jié)構(gòu)組成具有顯著差異（R=0.444， P=0.011）。

2.6? ?環(huán)境因子關(guān)聯(lián)性

基于各門的序列數(shù)進(jìn)行DCA分析，Lengths of gradient的最大值小于3，因此選擇RDA分析環(huán)境因子的關(guān)聯(lián)性。各環(huán)境因子在排序結(jié)果中的相關(guān)性指數(shù)（r）以及顯著性檢驗(yàn)值（P）見表4。

由表4可見，環(huán)境因子中Chl-a和pH極顯著影響排序結(jié)果（P<0.01）。流速（V）顯著影響排序結(jié)果（P<0.05）。因此，在進(jìn)行RDA分析前，去除對(duì)浮游植物群落影響不顯著的環(huán)境因子，僅使用顯著影響因子進(jìn)行RDA分析。RDA分析中（圖6），Permutation test的P<0.01，即環(huán)境因子對(duì)浮游植物群落結(jié)構(gòu)影響顯著，可以看出北部、中部和南部3組樣本間表現(xiàn)出了較高的離散性，北部區(qū)域樣本之間的離散性較南部和中部的低。大部分北部樣本與流速之間的射線夾角為銳角，說(shuō)明北部區(qū)域的大部分樣本與流速為正相關(guān)關(guān)系；南部區(qū)域的大部分樣本與pH為正相關(guān)關(guān)系。從RDA圖6還可以看出，Chl-a與pH也為正相關(guān)關(guān)系，而Chl-a和pH與V為負(fù)相關(guān)關(guān)系。

浮游植物各門與環(huán)境因子之間的相關(guān)性Heatmap分析見圖7。可以看出，黃藻門、褐藻門和紅藻門與Chl-a為極顯著正相關(guān)關(guān)系（P<0.01），硅藻門和裸藻門與pH為極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系（P<0.01），硅藻門與流速為極顯著正相關(guān)關(guān)系（P<0.01）。

3? ?討論

3.1? ?基于環(huán)境DNA的鄱陽(yáng)湖浮游植物多樣性

本次調(diào)查表明，基于環(huán)境DNA宏條形技術(shù)的鄱陽(yáng)湖區(qū)域春季浮游植物共有10門24綱54目101科166屬188種，Jia等（2020）利用傳統(tǒng)方法檢測(cè)到8門77屬133種。比較發(fā)現(xiàn)，利用環(huán)境DNA技術(shù)可以檢測(cè)到更多的物種。本研究中，硅藻門和綠藻門在群落組成中占優(yōu)勢(shì)，這與以往利用傳統(tǒng)方法監(jiān)測(cè)鄱陽(yáng)湖浮游植物的情況一致（Liu et al， 2015;Cao et al，2016;Liu et al， 2020）。

物種多樣性被用來(lái)評(píng)價(jià)群落中種類組成的穩(wěn)定程度及其數(shù)量分布均勻程度和群落組織結(jié)構(gòu)特征，也是衡量一定區(qū)域內(nèi)浮游植物資源豐富程度的客觀指標(biāo)之一（陳家長(zhǎng)等， 2009）；根據(jù)香農(nóng)多樣性指數(shù)大小的等級(jí)劃分見表5（孟順龍等，2016）。本研究中，北部湖區(qū)多樣性豐富（2.6～3.5）的樣點(diǎn)有5個(gè)，占北部湖區(qū)所有樣點(diǎn)的83.3%，說(shuō)明北部湖區(qū)浮游植物的多樣性處于Ⅳ級(jí)，多樣性豐富；中部湖區(qū)多樣性非常豐富（>3.5）的樣點(diǎn)有4個(gè)，占中部湖區(qū)所有樣點(diǎn)的66.7%，說(shuō)明中部湖區(qū)浮游植物的多樣性處于Ⅴ級(jí)，多樣性非常豐富;南部區(qū)域多樣性豐富（2.6～3.5）的點(diǎn)只有2個(gè)，而多樣性較好（1.6～2.5）的點(diǎn)有2個(gè)，均占調(diào)查樣點(diǎn)的33.3%，說(shuō)明南部區(qū)域浮游植物的多樣性處于Ⅲ～Ⅳ級(jí)，多樣性較好或豐富。由各區(qū)域多樣性等級(jí)可以看出，北部和南部區(qū)域的多樣性比中部豐富，推測(cè)是南部區(qū)域（青嵐湖和軍山湖）人工養(yǎng)殖大量經(jīng)濟(jì)魚類，并且以浮游植物為餌料的魚類較多，對(duì)浮游植物的消耗較大所致；而中部區(qū)域水動(dòng)力學(xué)較為平穩(wěn)，較為適合浮游植物的繁殖和生長(zhǎng)。

3.2? ?環(huán)境因子對(duì)浮游植物群落結(jié)構(gòu)的影響

通過(guò)環(huán)境DNA宏條形碼技術(shù)對(duì)鄱陽(yáng)湖真核浮游植物的研究發(fā)現(xiàn)，硅藻門、綠藻門和隱藻門的相對(duì)豐度均較高，OTU數(shù)目也較多。硅藻對(duì)水環(huán)境變化極為敏感，水溫、流速等都會(huì)引起硅藻及其含量的變化（黃學(xué)輝等， 2018），硅藻門的相對(duì)豐度較高，硅藻門OTU數(shù)目也較多（圖3，表2），本研究結(jié)果與黃蘭貴等（2021）的結(jié)果一致。這是由于硅藻適宜生長(zhǎng)溫度在10～25℃，春季溫度適宜硅藻生長(zhǎng)（Admiraal， 1976）。硅藻門主要與流速呈極顯著正相關(guān)關(guān)系（圖7）。北部區(qū)域是鄱陽(yáng)湖的通江口，流速較大（表1），對(duì)硅藻生長(zhǎng)較為有利，這是硅藻門在北部相對(duì)豐度最高的原因；此外，常溫條件下一些單細(xì)胞綠藻生長(zhǎng)速度也較快，導(dǎo)致綠藻門的相對(duì)豐度較高（彭寧彥等， 2018）；隱藻綱是隱藻門僅有的1綱，其分布廣泛，常在水體中形成優(yōu)勢(shì)類群（胡鴻鈞和魏印心， 2006）。

相關(guān)性熱圖中并未出現(xiàn)綠藻門和隱藻門（圖7），這是因?yàn)榫G藻門與水溫關(guān)系為正相關(guān)（夏爽等， 2013），隱藻門的繁殖與生長(zhǎng)主要受磷、鐵和光照影響（黃學(xué)輝等， 2018）;而在RDA分析中，水溫和總磷與鄱陽(yáng)湖整體浮游植物之間的關(guān)系并不顯著。營(yíng)養(yǎng)鹽的富集有利于藻類的繁殖與生長(zhǎng)（戴星照， 2016），但本研究中的營(yíng)養(yǎng)鹽對(duì)鄱陽(yáng)湖整體浮游植物之間的關(guān)系并不顯著，可能是春季鄱陽(yáng)湖水位上漲稀釋了營(yíng)養(yǎng)鹽濃度（吳召仕等， 2014）。

此外，本研究利用環(huán)境DNA宏條形技術(shù)檢測(cè)到了紅藻門在鄱陽(yáng)湖的分布（表2），而在以往傳統(tǒng)的研究中均未出現(xiàn)紅藻門，這可能是紅藻個(gè)體較大，利用傳統(tǒng)方法定性采樣時(shí)較難涉及所致（張軍毅等，2021）；同時(shí)，在本研究還檢測(cè)到褐藻門，但其OTU較少且僅能注釋到科水平，一方面可能是褐藻在淡水中種類極少（胡鴻鈞和魏印心， 2006）；另一方面也可能是數(shù)據(jù)庫(kù)缺少序列的相關(guān)信息所致。

3.3? ?環(huán)境DNA技術(shù)用于浮游植物監(jiān)測(cè)的優(yōu)缺點(diǎn)

與傳統(tǒng)調(diào)查方法相比，環(huán)境DNA宏條形技術(shù)可以檢測(cè)到更多的物種，對(duì)傳統(tǒng)調(diào)查方法得到的物種名錄是一個(gè)補(bǔ)充，也可以用于評(píng)估浮游植物的生物多樣性，還能減少對(duì)分類學(xué)專家的依賴（Bombin et al， 2020）。本研究也發(fā)現(xiàn)環(huán)境DNA宏條形技術(shù)存在有些OTU不能鑒定到種水平的問(wèn)題，這是由于參考數(shù)據(jù)庫(kù)中浮游植物序列信息不全所致。研究表明，數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)環(huán)境DNA技術(shù)注釋物種這一環(huán)節(jié)尤為重要，目前數(shù)據(jù)庫(kù)都在不斷更新和補(bǔ)充缺失物種。因此，在物種注釋時(shí)更應(yīng)選擇對(duì)應(yīng)關(guān)系較強(qiáng)、更新較頻繁的數(shù)據(jù)庫(kù)。

志謝：感謝南昌大學(xué)孫威威、王維開和劉雄軍博士在樣品采集方面提供的幫助。

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（責(zé)任編輯? ?萬(wàn)月華）

Diversity of Eukaryotic Phytoplankton in Poyang Lake based

on Environmental DNA Metabarcoding

GUO Ting1， FU Zhi‐hao1， ZHOU Chun‐hua1， CHEN Jin‐ping1， OUYANG Shan1，2， WU Xiao‐ping1，2

（1. College of Life Science， Nanchang University， Nanchang? ?330031， P.R. China;

2. Ministry of Education， Key Laboratory of Environment and Resource Utilization of Poyang Lake，

Nanchang University， Nanchang? ?330031， P.R. China）

Abstract：In this study， the new technology of environmental DNA （eDNA） metabarcoding was used to explore the phytoplankton community in Poyang Lake， focusing on species composition， spatial distribution， and community diversity. We aimed to provide basic data for the application and standardization of eDNA for monitoring aquatic ecosystems. Poyang Lake was divided into three regions and a total of 18 sampling sites were selected， including the channel connecting north Poyang Lake to the Yangtze River （Site 1-6）， central Poyang Lake （Site 7-12） and the aquaculture area of south Poyang Lake （Site 13-18）. Water samples were collected in triplicate at each sampling site during April of 2019. The V9 region of the 18S rDNA gene in eukaryotic phytoplankton was amplified and high-throughput sequencing and bioinformatics were used to analyze the community composition of phytoplankton in Poyang Lake. A total of 2 135 Operational Taxonomic Units （OTUs） of phytoplankton were obtained， consisting of 188 phytoplankton species from 166 genera， 101 families， 54 orders， 24 classes and 10 phyla. Chlorophyta and Bacillariophyta had high species richness. The phytoplankton community richness in Poyang Lake was generally high， and community diversity and evenness were higher in the central area of Poyang Lake. Non-metric multidimensional scale （NMDS） analysis shows that there were significant differences in the phytoplankton community structure between central and northern Poyang Lake （P=0.004）， and between the southern and northern areas （P=0.011）. Redundancy analysis （RDA） shows that chlorophyll-a， pH， and flow velocity greatly effected on the phytoplankton community in all areas of the lake. In conclusion， eDNA metabarcoding was used to rapidly assess phytoplankton biodiversity and spatial distribution in Poyang Lake and it provides a new and effective tool for monitoring the biodiversity and ecosystem health of Poyang Lake.

Key words：environmental DNA metabarcoding; phytoplankton; diversity; community structure; Poyang Lake

收稿日期：2021-12-11? ? ? 修回日期：2023-04-11

基金項(xiàng)目：江西省大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目（202210403062）；國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃“藍(lán)色糧倉(cāng)”重點(diǎn)專項(xiàng)（2018YFD0900801）。

作者簡(jiǎn)介：郭婷，1995年，女，碩士研究生，研究方向?yàn)樯锒鄻有?。E-mail： Guotingsx@163.com

通信作者：周春花，1979年生，女，博士，副教授，主要從事生物多樣性研究。E-mail： zhouchunhuajx@hotmail.com