含有苯環(huán)結(jié)構(gòu)的PBAT微塑料生物降解對(duì)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響

李成濤　吳婉晴　梁右才　崔倩　李振慧

摘要：為進(jìn)一步探明以對(duì)苯二甲酸（PTA）作為合成單體的聚對(duì)苯二甲酸-己二酸丁二醇酯（PBAT）在生物降解過程中，是否會(huì)產(chǎn)生類似于其它芳香類有機(jī)污染物的毒性效應(yīng)，本研究以PBAT微塑料為研究對(duì)象，同時(shí)以PTA為參照，通過高通量測序考察不同粒徑、不同添加量的PBAT微塑料的生物降解對(duì)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響，分析評(píng)價(jià)PBAT微塑料的毒性-劑量效應(yīng).結(jié)果表明，PBAT微塑料的降解率與其添加量、粒徑大小及填埋時(shí)間有關(guān)；PBAT微塑料的粒徑、添加量以及填埋時(shí)間的不同會(huì)導(dǎo)致土壤樣本中細(xì)菌群落相對(duì)豐度的動(dòng)態(tài)變化，進(jìn)而影響微生物群落結(jié)構(gòu)，且與PTA存在差異，可能與其苯環(huán)結(jié)構(gòu)有關(guān).PBAT微塑料的添加降低了土壤中變形菌門和放線菌門豐度，但提高了酸桿菌門豐度.本研究結(jié)果對(duì)評(píng)價(jià)土壤中PBAT微塑料的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)、開發(fā)可有效降解微塑料的微生物資源具有重要意義.

關(guān)鍵詞：微塑料； PBAT； 苯環(huán)； 生物降解； 土壤； 微生物群落

中圖分類號(hào)：X172文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

Effects of biodegradation of PBAT microplastics with benzene ring

structure on soil microbial community structure

LI Cheng-tao WU Wan-qing LIANG You-cai CUI Qian LI Zhen-hui

CHEN Chen LI LiKONG De-yi（1.School of Environmental Science and Engineering， Shaanxi University of Science & Technology， Xi′an 710021， China； 2.No.1 Oil Production Plant of PetroChina Changqing Oilfield Branch， Yan′an 717400， China）

Abstract：In order to further investigate whether poly （butylene terephthalate adipate） （PBAT） with terephthalic acid （PTA） as the synthetic monomer will produce toxic effects similar to other aromatic organic pollutants in the process of biodegradation，PBAT micro plastics were used as the research object and PTA as the reference.The effects of biodegradation of PBAT micro plastics with different particle sizes and different amounts on soil microbial community structure were investigated by high-throughput sequencing，and the toxicity-dose effect of PBAT micro plastics was analyzed and evaluated.The results showed that the degradation rate of PTA micro plastics was related to its addition amount，particle size and landfill time，and the difference of PBAT micro plastics particle size，particle size and landfill time would lead to the dynamic change of the relative abundance of bacterial community in soil samples，and then affect the microbial community structure，which was different from PBAT micro plastics，which may be related to its benzene ring structure.The addition of PBAT micro plastics decreased the abundance of Proteobacterium and Actinomycetes in soil，but increased the abundance of Acidobacteriota.The results of this study are of great significance for evaluating the ecological risk of PBAT micro plastics in soil and developing microbial resources that can effectively degrade micro plastics.

Key words：micro plastics； PBAT； benzene ring； biodegradation； soil； microbial communitysimulation

0引言

塑料因其成本低、延展性好和經(jīng)久耐用等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和日常生活中［1］，已和鋼鐵、木材、水泥并列成為當(dāng)今世界四大支柱材料，常見種類有聚乙烯、聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚酰胺、聚丙烯等.然而，大量的廢棄塑料在環(huán)境中長期殘留，難以回收且大多難降解，對(duì)環(huán)境造成了嚴(yán)重的“白色污染”［2］.面對(duì)當(dāng)前日益嚴(yán)重的環(huán)境危機(jī)和國家推行的“限塑令”政策，可生物降解塑料使用規(guī)模逐年增加［3］，其中以對(duì)苯二甲酸（p-phthalic acid，PTA）為單體合成的聚對(duì)苯二甲酸-己二酸丁二醇酯（butyleneadipate-co-terephthalate，PBAT）作為一種熱穩(wěn)定性、力學(xué)性能、生物降解性優(yōu)良的材料，在對(duì)抗“白色污染”問題中具有重要的使用價(jià)值［4］.

隨著可生物降解塑料的大量開發(fā)與使用，其對(duì)環(huán)境中塑料廢棄物的貢獻(xiàn)也相應(yīng)增加［5］，雖然可生物降解塑料在微生物的作用下會(huì)發(fā)生降解，但其降解受多種因素的影響，如溫度、濕度、pH值、降解時(shí)間、聚合物密度以及微生物種類等［6-8］，且隨著其降解時(shí)間的延長，塑料分子量逐漸降低，繼而會(huì)產(chǎn)生更小的塑料顆?；蛩槠?dāng)其粒徑小于5 mm時(shí)即被定義為可生物降解微塑料.

近年來關(guān)于微塑料的研究大多集中在水體，但已有研究證明土壤可能含有更豐富的微塑料儲(chǔ)層［9，10］，且土壤環(huán)境中的微塑料更有可能與微生物相互作用并改變生物地球化學(xué)循環(huán)，進(jìn)而引發(fā)環(huán)境毒性［11］.土壤中的不可降解微塑料會(huì)對(duì)土壤生態(tài)系統(tǒng)造成多種影響，如影響土壤結(jié)構(gòu)、微生物活性與活動(dòng)、養(yǎng)分循環(huán)等［12］，有少數(shù)研究證明可生物降解微塑料對(duì)土壤生態(tài)系統(tǒng)功能的影響與不可降解微塑料相似［5，13］，但在其生物降解過程中，聚合物和降解中間體對(duì)土壤微生物群落的影響在很大程度上是未知的，仍需進(jìn)一步探究.

劉娜等［14］研究苯酚對(duì)土壤中微生物數(shù)量及蛋白酶和脲酶活性的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，苯酚對(duì)土壤中細(xì)菌、放線菌及真菌等三大類群微生物均有顯著影響；劉蘋等［15］研究三種酚酸類化感物質(zhì)（肉桂酸、鄰苯二甲酸、對(duì)羥基苯甲酸）及其混合物對(duì)花生根際土壤微生物及產(chǎn)量的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，三種酚酸類物質(zhì)的累積與花生根際微生物群落結(jié)構(gòu)變化、微生態(tài)環(huán)境劣化相關(guān)，是花生連作障礙產(chǎn)生的可能因素之一.以PTA為單體的可生物降解脂肪-芳香族共聚酯PBAT同樣含有苯環(huán)結(jié)構(gòu)，在其使用過程中PBAT自身及其降解產(chǎn)物是否會(huì)產(chǎn)生類似的生態(tài)毒性問題，目前尚未明確.

本研究以PBAT微塑料為研究對(duì)象，同時(shí)以單體PTA為參照，通過高通量測序技術(shù)探究不同粒徑與添加量的PBAT微塑料降解過程對(duì)土壤微生物菌群結(jié)構(gòu)的影響，這對(duì)綜合分析評(píng)價(jià)PBAT微塑料對(duì)土壤生態(tài)系統(tǒng)的潛在影響具有重要意義，為開發(fā)能夠有效降解微塑料的微生物資源、維護(hù)土壤環(huán)境健康以及塑料加工行業(yè)的健康綠色發(fā)展提供了理論依據(jù)與技術(shù)支持.

1實(shí)驗(yàn)部分

1.1材料與樣品

將洗凈并干燥后的PBAT塑料母粒（廣東金發(fā)科技有限公司）經(jīng)粉碎機(jī)機(jī)械破碎后，通過篩分得到粒徑分別為<0.1 mm，0.1～0.2 mm，0.2～0.5 mm的微塑料顆粒.實(shí)驗(yàn)前，將微塑料置于無菌工作臺(tái)中滅菌20 min以最大程度減少微生物的污染［12］.實(shí)驗(yàn)所用土壤采自中國西安市郊的土地，去除土壤中石頭及其他大塊雜物后，使用10目（2 mm）篩網(wǎng)對(duì)土壤進(jìn)行篩分，并將其置于25 ℃的環(huán)境箱中溫育1周，以保持天然土壤微生物的活性［16］.

1.2PBAT與PTA污染土樣的制備

實(shí)驗(yàn)所使用PBAT母粒中PTA含量約為50%，因此設(shè)置PTA添加量為PBAT的50%.稱取250 g土壤放入每個(gè)花盆，分別按土壤干重的質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.02%、0.2%的PBAT微塑料、0.01%、0.1%的PTA（天津市天力化學(xué)試劑有限公司）添加到土壤中，并進(jìn)行編號(hào)（表1），添加量是根據(jù)土壤經(jīng)可生物降解地膜覆蓋的實(shí)際用量、累積量和已報(bào)道的高度污染的土壤中不可降解微塑料的最高濃度［17，18］確定的，將微塑料與土壤均勻混合，每組3個(gè)平行，同時(shí)對(duì)空白對(duì)照樣本進(jìn)行等效攪拌.將所有花盆放于室內(nèi)，加入適量水后于室溫下進(jìn)行降解，降解期間定期適量加水并分別于20 d、40 d后進(jìn)行取樣測定.

1.3土壤中PBAT微塑料的提取

參照Li等［19］的方法，具體步驟如下：通過磁力攪拌裝置將分離池中的浮選溶液（飽和NaBr）和樣品攪拌均勻，靜置后分離池中的樣品分層，然后儲(chǔ)液罐中的浮選液通過進(jìn)液管流入分離池中的上層，同時(shí)利用曝氣泵的曝氣頭處產(chǎn)生的氣泡帶動(dòng)含有MPs的上層溶液流入到抽濾裝置中進(jìn)行過濾，從而達(dá)到分離目的.該分離提取裝置對(duì)土壤中微塑料的回收率約為94%.

1.4PBAT微塑料降解性能分析

使用失重法測定PBAT微塑料的降解率，將填埋時(shí)間為20 d、40 d土壤中的PBAT微塑料進(jìn)行分離、提取，表面沖洗干凈并干燥至恒質(zhì)量后稱重，分別計(jì)算PBAT降解率.PBAT微塑料的降解率按照下列公式（1）進(jìn)行計(jì)算：

降解率（%）=W₀-W_t/W₀×100%（1）

式（1）中：W₀為微塑料初始添加量，W_t為微塑料實(shí)際回收量/回收率（94%）.

1.5土壤微生物群落結(jié)構(gòu)影響分析

使用高通量測序法對(duì)不同處理下的土壤樣本進(jìn)行分析，DNA抽提、16S rDNA特異引物 PCR擴(kuò)增與測序在美吉生物醫(yī)藥科技有限公司（中國上海）完成，根據(jù)測序結(jié)果對(duì)微生物群落進(jìn)行分析，在97%相似度的OTU或其他分類學(xué)水平下用QIIME計(jì)算，并利用R語言工具統(tǒng)計(jì)和作圖.

1.5.1DNA抽提

根據(jù)E.Z.N.A. soil試劑盒（Omega Bio-tek，Norcross，GA，U.S.）的說明書進(jìn)行土壤樣本中細(xì)菌群落總DNA的抽提，同時(shí)利用NanoDrop 2000檢測DNA的濃度和純度，制備1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳以檢測DNA的提取質(zhì)量.

1.5.2PCR擴(kuò)增

細(xì)菌16S rRNA基因的PCR擴(kuò)增是在DNA聚合酶的催化下，以母鏈DNA為模板，以338 F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′）和806R （5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）為特定引物對(duì)V3-V4可變區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增［20］，擴(kuò)增方案為：在95 ℃下預(yù)變性3 min，95 ℃變性30 s、55 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s的27個(gè)循環(huán)，以及最終在72 ℃下延伸10 min（PCR儀：ABI GeneAmp? 9700型），擴(kuò)增體系為20 μL：5×FastPfu緩沖液4 μL，2.5 mM dNTPs 2 μL，每種引物（5 μM）0.8 μL，F(xiàn)astPfu聚合酶0.4 μL；DNA模板10 ng.

1.5.3Illumina Miseq測序

從2%的瓊脂糖凝膠中回收所得的PCR產(chǎn)物，使用AxyPrep DNA凝膠提取試劑盒（Axygen Biosciences，Union City，CA，USA）進(jìn)一步純化，然后進(jìn)行Tris-HCl洗脫，2%瓊脂糖電泳檢測，并使用QuantiFluor^TM-ST（Promega，USA）進(jìn)行檢測定量.根據(jù)Illumina MiSeq平臺(tái)（Illumina，San Diego，USA）標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程將純化后的擴(kuò)增片段構(gòu)建PE2*300文庫，并利用Illumina公司的Miseq PE300平臺(tái)進(jìn)行測序.

1.6數(shù)據(jù)分析

每組數(shù)據(jù)重復(fù)測定3次取平均值，利用Microsoft 2010 Excel軟件計(jì)算均值和標(biāo)準(zhǔn)差，利用Origin 2018對(duì)不同組別的微塑料降解率進(jìn)行繪圖分析.原始測序序列由Trimmomatic軟件進(jìn)行質(zhì)控，并使用FLASH軟件進(jìn)行拼接.使用UPARSE軟件，根據(jù)97%的相似度對(duì)序列進(jìn)行OTU聚類，并在聚類的過程中去除單序列和嵌合體，利用RDP classifier對(duì)每條序列進(jìn)行物種分類注釋，然后與Silva數(shù)據(jù)庫（SSU123）進(jìn)行比對(duì)，且比對(duì)閾值設(shè)置為70%.

2結(jié)果與討論

2.1PBAT微塑料降解性能

圖1為不同粒徑、不同添加量的PBAT微塑料在不同降解周期下的降解率.由圖可知，不同粒徑、不同添加量的PBAT微塑料降解率均隨著填埋時(shí)間的延長而升高；粒徑與填埋時(shí)間相同時(shí)，0.2%添加量的降解率比0.02%添加量的降解率略高；添加量與填埋時(shí)間相同時(shí)，粒徑<0.1 mm的PBAT微塑料降解率略高.這些結(jié)果表明，PBAT微塑料的添加量與粒徑大小會(huì)影響其降解率，添加量越大、粒徑越小，PBAT微塑料的降解率越高.考慮到PBAT降解方式主要為生物降解，產(chǎn)生該結(jié)果的原因可能是土壤中PBAT微塑料含量的增大，對(duì)土壤中可降解PBAT的微生物的活性激活作用更強(qiáng)，從而加快PBAT的降解過程，且粒徑越小比表面積越大，越有利于微生物在微塑料表面的附著，進(jìn)而加快降解.

2.2添加PBAT微塑料、PTA的土壤微生物群落變化2.2.1微生物OTU分類學(xué)分析

由各土壤樣本微生物OTU分類學(xué)結(jié)果（表2）可以看出，填埋時(shí)間20 d與40 d的PBAT微塑料土壤樣本各水平群落物種的數(shù)目相對(duì)于對(duì)照土樣均有所增長，而添加PTA土壤樣本的群落物種數(shù)目變化與之相反.填埋時(shí)間為20 d時(shí)，對(duì)于粒徑< 0.1 mm和0.1～0.2 mm的PBAT微塑料土壤樣本，0.2%添加量的各水平群落物種數(shù)目大多高于0.02%，而粒徑為0.2～0.5 mm的PBAT微塑料土壤樣本，0.2%添加量各水平群落物種的數(shù)目低于0.02%；填埋時(shí)間為40 d時(shí)，0.2%添加量的PBAT微塑料土壤樣本各水平群落物種的數(shù)目高于0.02%.粒徑、添加量相同時(shí)，相比于20 d，填埋時(shí)間為40 d時(shí)土壤微生物群落豐富度更大，這可能是因?yàn)殡S著降解時(shí)間延長，PBAT的降解率升高，表明形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，更有利于不同種類的微生物在其表面進(jìn)行富集.

PTA在填埋時(shí)間20 d、40 d時(shí)均表現(xiàn)出相反的作用，PTA的添加降低了土壤微生物群落的豐富度，這可能是由于PTA分子中所含的苯環(huán)產(chǎn)生了毒性，且不能為土壤中微生物提供營養(yǎng)供給，從而降低土壤微生物群落豐富度，而以PTA為單體合成的聚合物PBAT，無毒性或毒性較小，且可被土壤微生物所利用，因此可以提高土壤微生物群落的豐富度.以上結(jié)果表明，PBAT微塑料的添加提高了土壤微生物群落的豐富度，且豐富度受其添加量、粒徑及填埋時(shí)間的影響，呈現(xiàn)一定的劑量-毒性效應(yīng)，例如短（20 d）填埋時(shí)間下的小粒徑（<0.2 mm）PBAT，相比低添加量，高添加量會(huì)顯著（p<0.05）增加土壤細(xì)菌群落的豐富度，但大粒徑則與之相反；另外，填埋時(shí)間越長，對(duì)土壤微生物群落的豐富度影響越大.

2.2.2微生物群落Alpha多樣性指數(shù)

以chao、ace、simpson、shannon、coverage指數(shù)為主，對(duì)20 d和40 d各土壤樣本進(jìn)行Alpha多樣性分析（表3）.chao、ace指數(shù)越大，土壤細(xì)菌群落豐富度越高；simpson指數(shù)越大、shannon指數(shù)越小，土壤細(xì)菌群落多樣性越低；coverage指數(shù)越大，土壤細(xì)菌群落覆蓋度越高［21］.由表3可以看出，對(duì)于填埋時(shí)間為20 d和40 d的土壤樣本，添加PBAT微塑料土壤樣本的ace、chao指數(shù)大部分高于空白土樣，且40 d相比于20 d更高，而添加PTA的土壤樣本低于空白土樣；添加PBAT微塑料土壤樣本的shannon、simpson指數(shù)與空白土樣相差不大，而添加PTA的土壤樣本與空白土樣間存在顯著差異.上述結(jié)果表明，PBAT微塑料的添加可以提高土壤中微生物群落的豐富度與多樣性，而PTA的添加降低了土壤微生物群落的豐富度與多樣性，且隨著降解時(shí)間的延長，PBAT降解產(chǎn)物可能被更多的微生物所利用，使得土壤群落豐富度與多樣性進(jìn)一步升高.

2.2.3微生物群落組成分析

將各組平行樣本合并，按所有物種相對(duì)豐度進(jìn)行計(jì)算并按物種豐度降序排列，豐度小于0.01的合并為others，在門水平、屬水平構(gòu)建群落組成圖（圖2、圖3）.由圖2可以看出，16種土壤樣本的群落共鑒定出10個(gè)門，分別為變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteriota）、酸桿菌門（Acidobacteriota）、綠彎菌門（Chloroflexi）、擬桿菌門（Bacteroidota）、芽單胞菌門（Gemmatimonadota）、粘球菌門（Myxococcota）、厚壁菌門（Firmicutes）、疣微菌門（Verrucomicrobia）和浮霉菌門（Planctomycetota）.其中，變形桿菌門（Proteobacteria）和放線菌門（Actinobacteriota）在16種土壤樣本中豐度均相對(duì)較高，為主要的優(yōu)勢細(xì)菌門，這與其他土壤中微生物群落結(jié)構(gòu)的研究結(jié)果一致：Zhang等［22］發(fā)現(xiàn)地膜覆蓋的新疆棉田土壤樣本及大型塑料、微塑料、植物凋落物樣本中最主要的細(xì)菌門是放線菌門和變形菌門；Chen等［23］研究高碳或低碳條件下可生物降解的聚乳酸微塑料對(duì)土壤微生物和相關(guān)生態(tài)過程的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，土壤樣本中大部分序列屬于變形桿菌和放線菌門.

變形菌門和放線菌門在各土壤樣本中占比分別在23.51%～43.14%和23.80%～31.52%之間，隨著填埋時(shí)間的延長，空白土樣與添加PBAT微塑料土壤樣本中的變形菌門豐度逐漸減小，而添加PTA土壤樣本中的變形菌門豐度逐漸增大，由29.97%增加至43.14%.填埋時(shí)間20 d時(shí)，與空白土樣（31.52%）相比，添加PBAT微塑料與PTA的土壤樣本中放線菌門占比均有所下降，且PTA土壤樣本下降較明顯（25.51%）；填埋時(shí)間為40 d時(shí)，比與空白土樣（28.25%）相比，添加PBAT微塑料土壤樣本中放線菌門占比大部分都有所下降，而PTA土壤樣本有所升高，這說明PBAT微塑料的添加降低了土壤中變形菌門、放線菌門的豐度，而PTA的添加提高了變形菌門、放線菌門的豐度（40 d）.變形菌門、放線菌門存在多種可降解多環(huán)芳烴類［24］和高分子類化合物［25］的微生物，但由于PBAT降解中間產(chǎn)物的積累，可能對(duì)微生物有一定的抑制作用，導(dǎo)致變形菌門和放線菌門豐度的下降；隨著時(shí)間的延長，變形菌門和放線菌門在添加PTA的土壤中豐度逐漸上升，可能是因?yàn)槠淠軌蚶肞TA降解產(chǎn)物中的有機(jī)物成分作為生長基質(zhì)生長繁殖.

各土壤樣本中酸桿菌門占比在4.66%～22.74%之間，填埋時(shí)間20 d與40 d時(shí)添加PBAT微塑料土壤樣本中酸桿菌門占比均高于同時(shí)間段的空白土樣，且豐度隨填埋時(shí)間的延長在升高，添加PTA土壤樣本中酸桿菌門的豐度隨填埋時(shí)間的延長在降低.這可能是因?yàn)镻BAT在土壤中降解的過程可以產(chǎn)生對(duì)苯二甲酸［26］等中間物質(zhì)，降低土壤的pH值，使得酸桿菌門［27］的豐度明顯提高；而添加PTA的土壤起初降低土壤pH，酸桿菌門的豐度較高，但隨著PTA的降解，土壤pH得以升高，使得酸桿菌門的豐度逐漸降低.正如張敏等［28］在研究PLA/PBAT對(duì)土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，使用PLA/PBAT地膜后，土壤中酸桿菌門、芽單胞菌門的相對(duì)豐度上升，變形菌門、放線菌門的相對(duì)豐度下降.

圖3為各土壤樣本在屬水平上的群落組成柱形圖.由圖3可以看出，16種土壤樣本中的群落共鑒定出44個(gè)屬，隨著填埋時(shí)間的延長，大部分添加PBAT微塑料的土壤樣本中節(jié)桿菌屬（Arthrobacter）、鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）的豐度均在減??；空白土樣與PBAT微塑料土壤樣本中諾卡氏菌屬（Nocardioides）豐度隨填埋時(shí)間延長在減小，而PTA土壤樣本與之相反，說明添加PBAT的土壤環(huán)境不利于這些微生物的生長，其可能為添加PBAT的土壤樣本的敏感菌.這可能是因?yàn)镻BAT在降解過程中，塑料添加劑（例如鄰苯二甲酸酯）會(huì)從微塑料基質(zhì)中釋放，而釋放的這些化合物可能對(duì)這些細(xì)菌有害［29］；也可能是因?yàn)橐恍﹥?yōu)勢菌屬和相對(duì)豐度升高的菌屬的生長繁殖會(huì)抑制這些細(xì)菌的生長繁殖，使其豐度降低.

綜上，PBAT微塑料的粒徑、添加量以及填埋時(shí)間的不同會(huì)導(dǎo)致土壤樣本中細(xì)菌群落相對(duì)豐度的動(dòng)態(tài)變化，進(jìn)而影響細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，且與PTA存在差異，正如Qi等［30，31］研究地膜殘留對(duì)小麥根際及土壤性質(zhì)的影響時(shí)，在宏觀和微觀尺寸的可生物降解塑料碎片上均觀察到微生物群落的變化，添加可生物降解塑料PLA會(huì)導(dǎo)致土壤pH值降低，從而間接改變根際土壤的微生物群落.有些細(xì)菌適宜在添加有PBAT的土壤環(huán)境下生長，為添加PBAT微塑料的土壤的耐受菌，這些耐受菌能夠利用PBAT降解中間產(chǎn)物作為碳源進(jìn)行生長繁殖［32］，同時(shí)也實(shí)現(xiàn)了PBAT的降解；而有些細(xì)菌不適合在含PBAT的土壤環(huán)境下生長［33］，可能為添加PBAT微塑料土壤的敏感菌門，也可能是因?yàn)橐恍﹥?yōu)勢菌屬和相對(duì)豐度升高的菌屬的生長繁殖會(huì)抑制這些細(xì)菌的生長繁殖，使其豐度降低.

2.2.4微生物群落Venn圖分析

在屬水平，利用Venn圖統(tǒng)計(jì)多組樣本中所共有和獨(dú)有的OTU數(shù)目，根據(jù)填埋時(shí)間將添加PBAT微塑料的土壤樣本分為20 d、40 d兩組，圖4為填埋20 d、40 d的PBAT微塑料土壤樣本在屬水平下的Venn圖.由圖可直觀地看出，20 d和40 d的土壤樣本的物種組成相似性及重疊情況，兩組樣本共有屬的物種數(shù)目為802個(gè)，填埋時(shí)間20 d的土壤樣本特有屬的物種數(shù)目為36個(gè)，填埋時(shí)間40 d的土壤樣本特有屬的物種數(shù)目為51個(gè)，這表明PBAT微塑料的添加會(huì)增加土壤中微生物群落的多樣性，且隨著填埋時(shí)間的增長其屬的物種數(shù)目在增加.

圖5為所有土壤樣本在屬水平下共有和特有的細(xì)菌數(shù).由圖可以看出，16個(gè)土壤樣本中微生物群落共有屬的物種數(shù)目為404個(gè)，柱形部分代表各土壤樣本中屬水平下的總物種數(shù)目，各PBAT微塑料土壤樣本的總物種數(shù)目高于空白土樣，而PTA土壤樣本低于空白土樣.這表明PBAT微塑料的添加會(huì)增加土壤中微生物群落的多樣性，且隨著填埋時(shí)間的增長其屬的物種數(shù)目是增加的，而PTA的添加會(huì)降低土壤中微生物群落的多樣性.

圖6為所有土壤樣本在種水平下共有和特有的細(xì)菌數(shù).由圖可以看出，16個(gè)土壤樣本中微生物群落共有屬的物種數(shù)目有717個(gè)，填埋時(shí)間20 d與40 d添加PBAT微塑料土壤樣本的特有物種數(shù)目與總物種數(shù)目均高于同時(shí)間段的空白土樣，且40 d高于20 d，而添加PTA的土壤樣本總物種數(shù)目均低于空白土樣，各土壤樣本的特有物種數(shù)目隨填埋時(shí)間的延長在增加.這表明，PBAT微塑料的添加使得土壤樣本的微生物多樣性升高，隨著降解時(shí)間的延長，這種促進(jìn)作用更顯著.

2.2.5微生物群落PCoA圖分析

圖7為門水平下添加PBAT微塑料的土壤系統(tǒng)的細(xì)菌主成分的PCoA圖，橫、縱坐標(biāo)表示兩個(gè)占比最大的主成分，百分比表示主成分對(duì)樣本組成差異的貢獻(xiàn)值，樣本點(diǎn)越接近物種組成越相似.由圖可知，填埋時(shí)間20 d（圖7（a））的樣本中細(xì)菌物種組成差異貢獻(xiàn)值百分比分別為60.27%和30.16%，通過PC2（30.16%）將添加PBAT微塑料的土壤樣本分離在圖的下側(cè)，與PTA土壤樣本存在顯著差異；填埋時(shí)間40 d（圖7（b））的樣本中細(xì)菌物種組成差異貢獻(xiàn)值百分比分別為77%和14.9%，通過PC1（77%）將添加PBAT微塑料的土壤樣本分離在圖的右側(cè)，且與PTA土壤樣本存在相對(duì)較遠(yuǎn)的距離.

添加PBAT微塑料的土壤微生物群落組成與PTA存在顯著差異，降解時(shí)間20 d和40 d間也存在一定差異，這可能是由于微塑料表面繁衍的細(xì)菌類群受微塑料本身的理化特性的影響［34］，因此對(duì)于不同種類的聚合物PBAT和PTA，以及不同降解時(shí)期，其表面及土壤中繁衍的細(xì)菌類群也不同，進(jìn)而使得土壤生物群落組成也產(chǎn)生差異.Meng等［35］研究可生物降解育苗盤對(duì)稻田土壤微生物群落的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，黑鈣土和潮土中較高施用量的樣品與空白對(duì)照及較低施用量的樣本顯著分離.

3結(jié)論

PBAT微塑料在土壤中的降解率與其添加量、粒徑大小有關(guān)，添加量越大、粒徑越小，降解率越高.

PBAT微塑料、PTA對(duì)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)均產(chǎn)生影響，并且可能與其苯環(huán)結(jié)構(gòu)有關(guān).PBAT微塑料的添加可以提高土壤中微生物群落的豐富度與多樣性，而PTA則與其相反，且與粒徑、添加量及填埋時(shí)間有關(guān)，PBAT微塑料對(duì)土壤微生物群落豐富度的影響呈現(xiàn)一定的劑量-毒性效應(yīng).

參考文獻(xiàn)

［1］ 侯軍華，檀文炳，余紅，等.土壤環(huán)境中微塑料的污染現(xiàn)狀及其影響研究進(jìn)展［J］.環(huán)境工程，2020，38（2）：16-27，15.

［2］ 劉沙沙.微塑料的環(huán)境行為及其生態(tài)毒性研究進(jìn)展［J］.農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)，2019，38（5）：957-969.

［3］ 刁曉倩，翁云宣，宋鑫宇，等.國內(nèi)外生物降解塑料產(chǎn)業(yè)發(fā)展現(xiàn)狀［J］.中國塑料，2020，34（5）：123-135.

［4］ 劉佳茜，侯麗君，劉婷婷，等.PBAT地膜降解菌的篩選及其降解特性研究［J］.農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)，2021，40（1）：129-136.

［5］ Shruti V C，Kutralam Muniasamy G.Bioplastics：Missing link in the era of microplastics［J］.Science of the Total Environment，2019，697：134-139.

［6］ Jiao Jian，Zeng Xiangbin，Huang Xianbo.An overview on synthesis，properties and applications of poly（butyleneadipate-co-terephthalate）PBAT［J］.Advanced Industrial and Engineering Polymer Research，2020，3（1）：19-26.

［7］ Zheng Yang，Chen Jinchun，Ma Yiming，et al.Engineering biosynthesis of polyhydroxyalkanoates （PHA） for diversity and cost reduction［J］.Metabolic Engineering，2020，58：82-93.

［8］ Hosni A，Pittman J K，Robson G D.Microbial degradation of four biodegradable polymers in soil and compost demonstrating polycaprolactone as an ideal compostable plastic［J］.Waste Management，2019，97：105-114.

［9］ Blsing M，Amelung W.Plastics in soil：Analytical methods and possible sources［J］.Science of the Total Environment，2018，612：422-435.

［10］ Nizzetto L，F(xiàn)utter M，Langaas S.Are agricultural soils dumps for microplastics of urban origin？［J］.Environmental Science & Technology，2016，50（20）：10 777-10 779.

［11］ De A A，Kloas W，Zarfl C，et al.Microplastics as an emerging threat to terrestrial ecosystems［J］.Global Change Biology，2018，24（4）：1 405-1 416.

［12］ 胡曉婧，劉俊杰，王浩，等.微塑料污染對(duì)土壤環(huán)境質(zhì)量和微生物生態(tài)學(xué)特性的影響研究進(jìn)展［J］.土壤通報(bào)，2021，52（6）：1 479-1 485.

［13］ M González Pleiter，Belda M T，Pulido Reyes G，et al.Secondary nanoplastics released from a biodegradable microplastic severely impact freshwater environments［J］.Environmental Science：Nano，2019，6（5）：1 382-1 392.

［14］ 劉娜，胡元森，王丹，等.苯酚對(duì)土壤中微生物數(shù)量及酶活性的影響［J］.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，43（1）：88-91.

［15］ 劉蘋，趙海軍，李慶凱，等.三種酚酸類化感物質(zhì)對(duì)花生根際土壤微生物及產(chǎn)量的影響［J］.中國油料作物學(xué)報(bào)，2018，40（1）：101-109.

［16］ Barragán D.H.，Pelacho A.M.，Martin Closas L.Degradation of agricultural biodegradable plastics in the soil under laboratory conditions＼[J＼].Soil Research，2016，54（2）：216-224.

［17］ Anderson，Abel，Souza，et al.Impacts of microplastics on the soil biophysical environment［J］.Environmental Science & Technology，2018，52（17）：9 656-9 665.

［18］ Stephen，F(xiàn)uller，Anil，et al.A procedure for measuring microplastics using pressurized fluid extraction［J］.Environmental Science & Technology，2016，50（11）：5 774-5 780.

［19］ Li C T，Cui Q，Zhang M，et al.A commonly available and easily assembled device for extraction of bio/non-degradable microplastics from soil by flotation in NaBr solution［J］.Science of the Total Environment，2020，759（5）：143 482.

［20］ Nan X，Tan G，Wang H，et al.Effect of biochar additions to soil on nitrogen leaching，microbial biomass and bacterial community structure［J］.European Journal of Soil Biology，2016，74：1-8.

［21］ Chen H.，Wan J.，Chen K.，et al.Biogas production from hydrothermal liquefaction wastewater （HTLWW）：Focusing on the microbial communities as revealed by high-throughput sequencing of full-length 16S rRNA genes［J］.Water Research，2016，106：98-107.

［22］ Zhang M J，Zhao Y R，Qin X，et al.Microplastics from mulching film is a distinct habitat for bacteria in farmland soil［J］.Science of the Total Environment，2019，688：470-478.

［23］ Chen H，Wang Y，X Sun，et al.Mixing effect of polylactic acid microplastic and straw residue on soil property and ecological function［J］.Chemosphere，2020，243：125 271.

［24］ 張穎，吳雪峰，董士嘉，等.DEHP對(duì)黑土微生物數(shù)量及酶活性的影響［J］.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2015，46（1）：47-54.

［25］ Kanokratana P，Mhuantong W，Laothanachareon T，et al.Phylogenetic analysis and metabolic potential of microbial communities in an industrial bagasse collection site［J］.Microbial Ecology，2013，66（2）：322-334.

［26］ 李佳喜，顧繼東.對(duì)苯二甲酸二甲酯及其異構(gòu)體的好氧微生物降解［J］.應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào)，2004（6）：103-106.

［27］ 王光華，劉俊杰，于鎮(zhèn)華，等.土壤酸桿菌門細(xì)菌生態(tài)學(xué)研究進(jìn)展［J］.生物技術(shù)通報(bào)，2016，32（2）：14-20.

［28］ 張敏，賈昊，翁云宣，等.聚乳酸/聚己二酸-對(duì)苯二甲酸丁二酯對(duì)土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響及其降解菌的篩選［J］.微生物學(xué)通報(bào)，2020，47（2）：420-430.

［29］ Li C，Y Gan，Dong J，et al.Impact of microplastics on microbial community in sediments of the Huangjinxia reservoir-water source of a water diversion project in western China［J］.Chemosphere，2020，253：126 740.

［30］ Qi Y，Beriot N，Gort G，et al.Impact of plastic mulch film debris on soil physicochemical and hydrological properties［J］.Environmental Pollution，2020，266（Pt 3）：115 097.

［31］ Qi Y L，Ossowicki A，Yang X M，et al.Effects of plastic mulch film residues on wheat rhizosphere and soil properties［J］.Journal of Hazardous Materials，2019，387：121 711.

［32］ Helmberger M S，Tiemann L K，Grieshop M J.Towards an ecology of soil microplastics［J］.Functional Ecology，2020，34：550-560.

［33］ Kleinteich J.，Seidensticker S.，Marggrander N.，et al.Microplastics reduce short-term effects of environmental contaminants （Part II）：Polyethylene particles decrease the effect of polycyclic aromatic hydrocarbons on microorganisms＼[J＼].International Journal of Envirormental Research and Public Health，2018，15（2）：287.

［34］ Gong M，Yang G，Zhuang L，et al.Microbial biofilm formation and community structure on low-density polyethylene microparticles in lake water microcosms［J］.Environmental Pollution，2019，252：94-102.

［35］ Meng K，Ren W，Teng Y，et al.Application of biodegradable seedling trays in paddy fields：Impacts on the microbial community［J］.The Science of the Total Environment，2019，656：750-759.

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