啟動子低甲基化介導(dǎo)NOL9過表達(dá)促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖

陳希瑤?許鎮(zhèn)?鄔喆斌?張博翔?彭亮?謝嬋

【摘要】目的 探討核仁蛋白9（NOL9）在肝癌中的表達(dá)和對肝癌細(xì)胞增殖的影響，進(jìn)一步闡明NOL9在肝癌中表達(dá)上調(diào)的分子機(jī)制。方法 選擇7例肝癌患者的手術(shù)標(biāo)本（癌組織和癌旁組織），通過蛋白免疫印跡法和反轉(zhuǎn)錄-實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）檢測NOL9在癌組織和癌旁組織中的表達(dá)水平；分別轉(zhuǎn)染小干擾RNA（si-RNA）到肝癌Huh7和HCCLM3細(xì)胞，采用RT-qPCR、蛋白免疫印跡法、細(xì)胞集落形成實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8（CCK-8）分析差異；利用TCGA數(shù)據(jù)庫肝癌數(shù)據(jù)評估NOL9 mRNA表達(dá)水平和啟動子的甲基化水平，同時(shí)評估NOL9和DNA甲基異位擦除蛋白家族（TET1、TET2和TET3）轉(zhuǎn)錄水平的相關(guān)性；采用RT-qPCR和蛋白免疫印跡法檢測DNA去甲基化試劑5-Aza-Dc處理后Huh7和HCCLM3細(xì)胞中NOL9表達(dá)水平的變化；5-Aza-Dc預(yù)處理后再轉(zhuǎn)染si-RNA，采用細(xì)胞集落形成實(shí)驗(yàn)和CCK-8分析細(xì)胞增殖的差異。結(jié)果 NOL9在肝癌組織中表達(dá)上調(diào)；敲低NOL9能抑制肝癌Huh7和HCCLM3細(xì)胞增殖以及細(xì)胞集落形成（P均 < 0.01）；肝癌中NOL9啟動子甲基化與其mRNA水平呈負(fù)相關(guān)，NOL9 mRNA水平和一個(gè)CpG區(qū)域（cg07997941）呈負(fù)相關(guān)；在肝癌中，NOL9與TET1、TET2和TET3的轉(zhuǎn)錄水平均呈正相關(guān)；在給予5-Aza-Dc處理后，NOL9的表達(dá)上調(diào)；5-Aza-Dc的處理能逆轉(zhuǎn)敲低NOL9對肝癌細(xì)胞增殖以及克隆形成的抑制作用。結(jié)論 NOL9在肝癌組織中高表達(dá)，敲低NOL9抑制了肝癌細(xì)胞的增殖和克隆形成，其上調(diào)機(jī)制可能與啟動子低甲基化相關(guān)。

【關(guān)鍵詞】肝細(xì)胞癌；核仁蛋白9；增殖；甲基化

Promoter hypomethylation promotes proliferation of hepatocellular carcinoma cells by mediating NOL9 overexpression

Chen Xiyao， Xu Zhen， Wu Zhebin， Zhang Boxiang， Peng Liang， Xie Chan. Department of Infectious Disease，the Third Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University，510630 Guangzhou，China

Corresponding author，Xie Chan，E-mail： xchan@mail.sysu.edu.cn

【Abstract】Objective To evaluate the expression of nucleolar protein 9 （NOL9） in hepatocellular carcinoma and the effect of NOL9 on the proliferation of hepatocellular carcinoma cells， aiming to elucidate the molecular mechanism of NOL9 overexpression in hepatocellular carcinoma. Methods Surgical specimens （cancerous and para-cancerous tissues） were obtained from 7 patients with hepatocellular carcinoma. The expression levels of NOL9 in the cancerous and para-cancerous tissues were determined by Western blot and RT-qPCR. Huh7 and HCCLM3 cell were transferred with NOL9 si-RNA. The differences between two groups were analyzed by RT-qPCR， Western blot， colony formation assay and CCK-8 assay. Hepatocellular carcinoma data from TCGA database were used to evaluate the expression level of NOL9 mRNA and promoter methylation level. The correlation between NOL9 and transcription levels of Ten-eleven-translocation enzymes （TET1， TET2 and TET3） was analyzed. After administration of 5-Aza-Dc， the expression level of NOL9 in Huh7 and HCCLM3 cells was detected by RT-qPCR and Western blot. The cells were pretreated with 5-Aza-Dc and transfected with si-RNA， and then colony formation assay and CCK-8 assay were used to analyze the difference of cell proliferation. Results The expression of NOL9 was up-regulated in hepatocellular carcinoma tissues compared with para-cancerous tissues. Knockdown of NOL9 could significantly inhibit cell proliferation and cell colony formation in Huh7 and HCCLM3 cells （all P < 0.01）. The methylation level of NOL9 promoter was negatively correlated with its mRNA level in hepatocellular carcinoma. NOL9 mRNA level was negatively correlated with one CpG region （cg07997941）. In hepatocellular carcinoma， NOL9 was positively correlated with the transcription levels of TET1， TET2 and TET3. After administration of 5-Aza-Dc， the expression level of NOL9 was up-regulated. Treatment with 5-Aza-Dc could reverse the inhibitory effect of NOL9 knockdown on cell proliferation and colony formation. Conclusion NOL9 is highly expressed in hepatocellular carcinoma tissues. Knockdown of NOL9 suppresses the proliferation and colony formation of hepatocellular carcinoma cells. The mechanism underlying NOL9 up-regulation may be related to promoter hypomethylation.

【Key words】Hepatocellular carcinoma； NOL9； Proliferation； Methylation

肝細(xì)胞癌（肝癌）是原發(fā)性肝癌的主要形式，占肝癌病例的75%～85%，且是全球癌癥相關(guān)死亡的第三大原因［1］。自2019年Science一篇文獻(xiàn)報(bào)道，核仁可以暫時(shí)性儲存錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)，對于蛋白質(zhì)的質(zhì)量控制至關(guān)重要［2］。核仁蛋白（NOL）已成為惡性腫瘤相關(guān)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，Hong等［3］發(fā)現(xiàn)端粒酶以NOL1蛋白依賴的方式激活細(xì)胞周期蛋白D1基因的轉(zhuǎn)錄。Gu等［4］在前列腺癌中發(fā)現(xiàn)NOL8的上調(diào)及其的致癌作用。Chen等［5］根據(jù)Kaplan-Meier生存分析得出結(jié)論，NOL4的表達(dá)與子宮內(nèi)膜癌的總生存時(shí)間相關(guān)。Liang等［6］發(fā)現(xiàn)NOL6在子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中作為一種促癌基因。Heindl等（2010年）和Bielczyk等（2015年）發(fā)現(xiàn)，NOL9是一種多核苷酸5′-激酶，主要位于細(xì)胞核仁中，對核糖體RNA成熟至關(guān)重要。已有研究發(fā)現(xiàn)NOL9與多種惡性腫瘤密切相關(guān)，如三陰性乳腺癌和急性髓系白血病等［7-8］。Castle等（2012年）認(rèn)為，NOL9參與重要癌癥標(biāo)志基因Las1L的組裝和運(yùn)輸，且與細(xì)胞周期相關(guān)蛋白P53密切相關(guān)，可誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯。這些都提示NOL9可能與肝癌的發(fā)生、發(fā)展過程密切相關(guān)。

本研究旨在闡明NOL9在肝癌中的具體作用和潛在機(jī)制，以期尋找肝癌診斷的生物標(biāo)志物和潛在的治療靶點(diǎn)。

材料與方法

一、研究對象

收集2020年9月至2021年12月在中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院行肝癌切除術(shù)的7例患者肝臟腫瘤組織和癌旁組織樣本，-80℃保存。肝癌組織均經(jīng)病理學(xué)確診。本研究經(jīng)中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)（批件號：中大附三申倫［2021］02-356），所有參與者均知情同意。

二、細(xì)胞及主要試劑

肝細(xì)胞癌Huh7和HCCLM3細(xì)胞均來自中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院肝病實(shí)驗(yàn)室，胎牛血清、高糖DMEM培養(yǎng)基、0.25%乙二胺四乙酸（EDTA）胰蛋白酶溶液、青霉素加鏈霉素以及磷酸鹽緩沖液（PBS）均購自美國Gibco公司，NOL9小干擾RNA（siRNA）及陰性對照購自廣州漢一生物科技有限公司，轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 3000及Opti-MEM無血清培養(yǎng)基購自美國Thermo Fisher公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒購自日本TaKaRa公司，蛋白免疫印跡相關(guān)試劑均購自上海雅酶生物醫(yī)藥科技有限公司，DNA去甲基化試劑5-Aza-Dc購自美國Sigma公司，PCR所需引物均購自生工生物工程（上海）股份有限公司，第一抗體：NOL9（1∶1000， ab140597）和GAPDH（1∶3000， ab8245）以及第二抗體均購自英國Abcam公司，細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8（CCK-8）試劑盒購自廣州信研生物科技有限公司，結(jié)晶紫染液購自北京索萊寶科技有限公司。

三、方 法

1.細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

取對數(shù)生長期的肝癌HCCLM3和Huh7細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。根據(jù)轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 3000脂質(zhì)體說明書將NOL9 siRNA（si-NOL9#1和si-NOL9#2）和陰性對照si-RNA分別添加到肝癌HCCLM3和Huh7細(xì)胞，轉(zhuǎn)染的細(xì)胞在恒溫箱培養(yǎng)24～72 h后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。根據(jù)轉(zhuǎn)染物的不同，實(shí)驗(yàn)分為NOL9敲低組（si-NOL9#1和si-NOL9#2）和陰性對照組（si-nc）。

2. CCK-8檢測

細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h后，接種在96孔板中，細(xì)胞密度1×104/孔，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。使用CCK-8檢測細(xì)胞增殖能力，根據(jù)CCK-8試劑盒說明書，在37℃下培養(yǎng)1 h后，酶標(biāo)儀測量490 nm處各孔吸光度值，棄去最小值和最大值，計(jì)算細(xì)胞增殖指數(shù)。

3.細(xì)胞集落形成實(shí)驗(yàn)

細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h后，接種在6孔板中，細(xì)胞密度500/孔，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。細(xì)胞培養(yǎng)14 d，每3 d更換培養(yǎng)基。細(xì)胞固定后采用結(jié)晶紫染色，并用Image J軟件計(jì)算克隆形成數(shù)量。

4. RNA分離和RT-qPCR

按照TRIzol法提取細(xì)胞總RNA，采用紫外分光光度計(jì)NANODROP ONE檢測RNA的濃度和純度。接下來，根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書，將RNA逆轉(zhuǎn)錄成模板DNA（cDNA）；再根據(jù)實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒說明書，將cDNA進(jìn)行RT-qPCR檢測。2-ΔΔCt法計(jì)算目的 mRNA 相對表達(dá)量。

表1 目的基因的引物序列

基 因 引物序列

NOL9 正向 5′-ATCTGTCGTGTGACTTGCCTC-3′

反向 5′-AAAAATTCTGCATCGACCAACG-3′

GAPDH 正向 5′-ACAACTTTGGTATCGTGGAAGG-3′

反向 5′-GCCATCACGCCACAGTTTC-3′

5.蛋白免疫印跡法

采用蛋白免疫印跡法檢測NOL9蛋白的表達(dá)，采用化學(xué)發(fā)光法檢測試劑盒進(jìn)行顯影，以GAPDH為對照，計(jì)算各蛋白的相對表達(dá)量。

6.生物信息學(xué)分析

利用癌癥基因組圖譜（TCGA）數(shù)據(jù)分析HCC中NOL9 mRNA和啟動子甲基化水平。使用UALCAN檢測HCC中NOL9啟動子甲基化水平［9］。探針（cg07997941）信息從MEXPRESS獲得［10］。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析和圖形繪制分別使用SPSS 26.0版軟件、GraphPad Prism 8.0。正態(tài)分布資料以? 表示，比較采用t檢驗(yàn)；多組間比較采用單因素方差（One-way ANOVA）分析，進(jìn)一步組間兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)；癌旁組織與癌組織間比較用配對t檢驗(yàn)。P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

一、肝癌和癌旁組織中NOL9 mRNA以及蛋白相對表達(dá)量比較

收集7例肝癌患者手術(shù)切除的新鮮組織標(biāo)本，通過RT-qPCR和蛋白免疫印跡檢測NOL9在癌組織和癌旁組織中的表達(dá)情況。與癌旁組織相比，癌組織的NOL9 mRNA（t = 11.76，P < 0.001）和蛋白（t = 2.52，P = 0.045）相對表達(dá)量均明顯上調(diào)。見圖1A～C。

二、NOL9的敲低對HCCLM3和Huh7細(xì)胞集落形成的影響

轉(zhuǎn)染后的RT-qPCR檢測結(jié)果顯示，在HCCLM3細(xì)胞中，與si-nc組細(xì)胞相比，si-NOL9#1（t = 9.37，P < 0.001）和si-NOL9#2（t = 9.54，P < 0.001）組細(xì)胞的NOL9 mRNA和蛋白相對表達(dá)均明顯下調(diào)；在Huh7細(xì)胞中，與si-nc組細(xì)胞相比，si-NOL9#1（t = 7.72，P < 0.001）和si-NOL9#2（t =

9.84，P < 0.001）組細(xì)胞的NOL9 mRNA和蛋白相對表達(dá)均明顯下調(diào)。見圖2A～C。

平板克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在HCCLM3中，si-NOL9#1組（t = 13.18，P < 0.001）和si-NOL9#2組（t = 14.79，P < 0.001）集落數(shù)均少于si-nc組；在Huh7中，si-NOL9 #1組（t = 6.59，P < 0.001）和si-NOL9#2組（t = 8.40，P < 0.001）集落數(shù)也均少于si-nc組。見圖2D、E。

三、NOL9的敲低對HCCLM3和Huh7細(xì)胞增殖的影響

CCK-8結(jié)果顯示，在HCCLM3細(xì)胞中，48 h

后，si-NOL9#1組（t = 7.34，P < 0.001）和si-NOL9#2組（t = 15.00，P < 0.001）細(xì)胞活力均低于si-nc組；72 h后，si-NOL #1組（t = 18.72，P < 0.001）和si-NOL9#2組（t = 29.47，P < 0.001）細(xì)胞活力仍低于si-nc組。在Huh7細(xì)胞中，48 h后，si-NOL9#1組（t = 13.64，P < 0.001）和si-NOL9#2組（t = 11.02，P < 0.001）細(xì)胞活力均低于si-nc組；72 h后，si-NOL9#1組（t = 12.74，P < 0.001）和si-NOL9#2組（t = 12.40，P < 0.001）細(xì)胞活力仍低于si-nc組。見圖3A、B。

四、NOL9啟動子甲基化水平

生物信息學(xué)分析表明，肝癌中NOL9 mRNA水平與一個(gè)CpG區(qū)域（cg07997941）呈負(fù)相關(guān)（R =

-0.25，P < 0.001）。此外，在肝癌中NOL9的表達(dá)上調(diào)，而其啟動子甲基化水平下調(diào)（P均 < 0.001），見圖4A～C。NOL9與TET1（R = 0.35，P < 0.001）、TET2（R = 0.52，P < 0.001）和TET3（R =

0.50，P < 0.001）的轉(zhuǎn)錄水平均呈正相關(guān)。見圖4D～F。

五、5-Aza-Dc對NOL9表達(dá)的影響

在給予不同濃度DNA去甲基化試劑5-Aza-Dc處理后，通過RT-qPCR檢測，NOL9 mRNA水平呈濃度依賴性上調(diào)（P均 < 0.001），見圖5A。蛋白免疫印跡法檢測顯示，不同濃度5-Aza-Dc處理后，NOL9蛋白表達(dá)上調(diào)（P均 < 0.001）。見圖5B、C。

六、5-Aza-Dc對NOL9敲低細(xì)胞增殖的影響

CCK8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，DNA去甲基化試劑5-Aza-Dc能逆轉(zhuǎn)NOL9敲低對HCCLM3和Huh7細(xì)胞增殖的抑制作用（P均 < 0.001）。見圖6。

討論

由于高復(fù)發(fā)、高轉(zhuǎn)移、預(yù)后差及5年生存率低，肝癌發(fā)生、發(fā)展的分子調(diào)控機(jī)制仍需進(jìn)一步深入研究。在本研究中，我們揭示了NOL9在肝癌中表達(dá)上調(diào)，NOL9的敲低抑制細(xì)胞增殖和克隆形成，并證實(shí)了啟動子低甲基化促進(jìn)NOL9的表達(dá)。

眾所周知，表觀遺傳修飾在基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控中起著關(guān)鍵作用，如乙?；⒓谆?、磷酸化以及泛素化等，其中DNA啟動子甲基化水平與基因轉(zhuǎn)錄活性密切相關(guān)。表觀遺傳修飾通過對基因表達(dá)的精細(xì)調(diào)節(jié)參與調(diào)控許多關(guān)鍵的生物學(xué)過程，如細(xì)胞分化和胚胎發(fā)生。同時(shí)，許多研究表明表觀遺傳修飾在癌癥相關(guān)基因動態(tài)轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用［11］。TET蛋白家族可將5-甲基胞嘧啶轉(zhuǎn)化為5-羥甲基胞嘧啶，該過程是DNA去甲基化的1個(gè)必要階段［12］。已有研究表明，TET蛋白家族對癌基因或抑癌基因啟動子甲基化的調(diào)控是肝癌進(jìn)展中關(guān)鍵的表觀遺傳修飾因子［13-14］。本研究顯示，在肝癌中NOL9啟動子甲基化降低，而NOL9 mRNA表達(dá)被上調(diào)。此外，我們還觀察到在肝癌中NOL9 與TET1、TET2及TET3在轉(zhuǎn)錄水平呈正相關(guān)。同時(shí)，體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證DNA甲基化在NOL9表達(dá)調(diào)控中的作用，我們用DNA去甲基化試劑5-Aza-Dc處理肝癌細(xì)胞，然后檢測NOL9的表達(dá)。結(jié)果顯示，5-Aza-Dc處理后NOL9的mRNA和蛋白表達(dá)明顯上調(diào)。以上結(jié)果說明，NOL9啟動子低甲基化可能是肝癌細(xì)胞系和肝癌組織中NOL9表達(dá)增加的關(guān)鍵因素。與此同時(shí)，本研究通過體外實(shí)驗(yàn)初步探討了NOL9在肝癌中的作用。本研究首先將NOL9的siRNA轉(zhuǎn)染至HCCLM3和Huh7細(xì)胞，通過調(diào)節(jié)NOL9的表達(dá)水平，利用集落形成實(shí)驗(yàn)及CCK-8觀察細(xì)胞生長的變化。轉(zhuǎn)染NOL9后細(xì)胞生長受到抑制。這說明NOL9可能通過促進(jìn)肝癌細(xì)胞生長，在肝癌發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮癌基因的作用。接著在轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中加入5-Aza-Dc，細(xì)胞的增殖能力較未加入5-Aza-Dc升高，進(jìn)一步證明對癌基因NOL9的去甲基化修飾促進(jìn)肝癌細(xì)胞的生長，這與既往研究結(jié)論一致。因此，NOL9異常甲基化可用于肝癌細(xì)胞增殖的預(yù)測因子。

本研究有三點(diǎn)不足：①組織樣本量不夠大；②未進(jìn)一步探究NOL9啟動子甲基化的調(diào)控機(jī)制；③未通過動物模型對NOL9在肝癌發(fā)生、發(fā)展中的作用進(jìn)行體內(nèi)研究。后續(xù)相關(guān)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證將進(jìn)一步闡明。

綜上所述，NOL9作為癌基因促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖，其表達(dá)上調(diào)與啟動子低甲基化有關(guān)。

參 考 文 獻(xiàn)

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（收稿日期：2022-11-25）

（本文編輯：楊江瑜）