肝細(xì)胞癌Adv—p53、AAV—HGFK1聯(lián)合轉(zhuǎn)基因治療的臨床療效和預(yù)后分析

張法標(biāo)+方哲平

[摘要] 目的 分析肝細(xì)胞癌Adv-p53、AAV-HGFK1聯(lián)合轉(zhuǎn)基因治療的臨床療效和預(yù)后。 方法 選取我科2009年1月～2012年1月進(jìn)展期肝癌患者共50例，隨機(jī)分為重組腺相關(guān)病毒-肝細(xì)胞生長因子第l螺旋區(qū)（recombinant adeno-associated virus-kringle 1 domain of hepatocyte growth factor）AAV-HGFK1+Adv-p53組和AAV-HGFKI組。比較兩組患者治療后肝穿刺活檢標(biāo)本新生微血管和凋亡細(xì)胞率、臨床療效、復(fù)發(fā)率、生存率。 結(jié)果 AAV-HGFK1+Adv-p53組治療后第14天、第21天的新生微血管數(shù)量顯著低于AAV-HGFK1組，凋亡細(xì)胞率顯著高于AAV-HGFK1組（P<0.01）。AAV-HGFK1+Adv-p53組的疾病控制率為84.00%，顯著高于AAV-HGFK1組48.00%（P<0.05）；兩組患者的疾病緩解率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。AAV-HGFK1+Adv-p53組1年、3年復(fù)發(fā)率顯著低于AAV-HGFK1組，1年、3年生存率顯著高于AAV-HGFK1組（P<0.05）。 結(jié)論 Adv-p53、AAV-HGFK1聯(lián)合治療進(jìn)展期肝細(xì)胞癌療效優(yōu)于AAV-HGFK1單獨(dú)治療，預(yù)后更佳。

[關(guān)鍵詞] Adv-p53；AAV-HGFK1；轉(zhuǎn)基因治療；肝細(xì)胞癌；預(yù)后

[中圖分類號] R735.7 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-9701（2015）26-0008-04

Clinical efficacy and prognosis of Adv-p53， AAV-HGFK1 combined gene therapy for HCC

ZHANG Fabiao FANG Zheping

Department of Hepatobiliary Surgery， Taizhou Hospital in Zhejiang Province， Linhai 317000， China

[Abstract] Objective To analyze the clinical efficacy and prognosis of Adv-p53， AAV-HGFK1 combined gene therapy for HCC. Methods Fifty patients with advanced liver cancer in our department from January 2009 to January 2012 were randomly divided into AAV-HGFK1+Adv-p53 group and AAV-HGFK1 group. The liver biopsy specimens microvessel and apoptosis rate， clinical efficacy and relapse rate were compared in two groups of patients. Results The number of microvessels in AAV-HGFK1+Adv-p53 group 14 days and 21 days was significantly lower than AAV-HGFKI group. The apoptosis rate was significantly higher than that of AAV-HGFK1 group（P<0.01）. The disease control rate in AAV-HGFK1+Adv-p53 group was 84.00%， which was significantly higher than 48.00% in the AAV-HGFK1 group（P<0.05）. The remission of the disease in patients had no significant difference between the two groups（P>0.05）. The 1，3-year recurrence rate in the AAV-HGFK1+Adv-p53 group was significantly lower than AAV-HGFK1 group， the 1，3-year survival rate was significantly higher than that of AAV-HGFK1 group（P<0.05）. Conclusion Adv-p53， AAV-HGFK1 combination therapy for advanced hepatocellular carcinoma is more effective than AAV-HGFK1 alone treatment， while the prognosis is better.

[Key words] Adv-p53； AAV-HGFK1； Gene therapy； Hepatocellular carcinoma； Prognosis

原發(fā)性肝癌為我國特別是農(nóng)村地區(qū)高發(fā)惡性消化道腫瘤之一，由于其早期臨床主要表現(xiàn)為右下腹隱痛、嘔心嘔吐以及消化不良等胃腸道非特異性表現(xiàn)，故早期陽性診斷水平較低[1]，而以手術(shù)為主聯(lián)合術(shù)后放化療等治療方式并未取得滿意療效，其術(shù)后五年生存率約30%～45%。近年來臨床上對于原發(fā)性肝癌的基因水平的治療取得了一定成效，通過轉(zhuǎn)染抑癌基因等基因片段進(jìn)入癌細(xì)胞組織中，通過抑制相關(guān)信號通路的激活等方式來抑制腫瘤細(xì)胞增值、轉(zhuǎn)移[2，3]。本研究通過對原發(fā)性肝癌患者進(jìn)行AAV-HGFK1+Adv-p53和AAV-HGFK1基因治療，揭示腺病毒-P53對于治療肝癌治療的潛在價(jià)值，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取我科2009年1月～2012年1月進(jìn)展期肝癌患者共50例，均符合第四屆全國肝癌會議修訂標(biāo)準(zhǔn)（1999年）[1]。納入標(biāo)準(zhǔn)：①具有完整的肝功能、AFP、CT或MRI檢查資料；②預(yù)計(jì)壽命超過12周，體能狀態(tài)評分（ECOG）0～2分；③之前未經(jīng)過手術(shù)、放療、射頻消融、栓塞化療、肝動脈灌注、冷凍消融、經(jīng)皮乙醇注射等治療；④無嚴(yán)重的心、肺、腎或造血系統(tǒng)疾病。排除標(biāo)準(zhǔn)：①入組前接受過針對肝癌任何形式的治療；②預(yù)計(jì)壽命<12周或ECOG>2分；③合并嚴(yán)重的心、肺、腎或造血系統(tǒng)疾??；④妊娠或哺乳期女性。隨機(jī)分為AAV-HGFK1+Adv-p53組和AAV-HGFK1組，其中AAV-HGFK1+Adv-p53組25例，男17例，女8例；年齡37～64歲，平均（51.9±3.3）歲；腫瘤直徑3.1～10.8 cm，平均（5.4±0.8）cm；腫瘤數(shù)目1個(gè)7例，2個(gè)4例，≥3個(gè)14例；伴有肺轉(zhuǎn)移9例，骨轉(zhuǎn)移1例；侵犯門脈主干5例。AAV-HGFK1組25例，男18例，女7例；年齡39～66歲，平均（52.4±3.5）歲；腫瘤直徑3.6～10.2 cm，平均（5.7±0.2）cm；腫瘤數(shù)目1個(gè)8例，2個(gè)5例，≥3個(gè)12例；伴有肺轉(zhuǎn)移10例，骨轉(zhuǎn)移2例；侵犯門脈主干6例。兩組患者性別構(gòu)成、年齡、腫瘤直徑和數(shù)目、轉(zhuǎn)移及侵犯血管情況差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。

1.2 治療方法

采用OlympusXQ260電子顯微鏡，在彩色電子顯微鏡屏幕指示下，通過逆行膽管造影方式，在肝臟原發(fā)性肝癌組織進(jìn)行多點(diǎn)注射，AAV-HGFK1注射劑量為1×1012 VP，Adv-p53注射劑量為2×1012 VP（Adv-p53和AAV-HGFK1注射液均購自南京凱基生物科技有限公司，規(guī)格：1×1024 VP/支）。每周1次，每5次為一個(gè)療程，針刺深度應(yīng)適宜，一般達(dá)正常組織交界處即可，不必超越腫瘤組織而進(jìn)入正常肝細(xì)胞組織內(nèi)。

1.3 評價(jià)指標(biāo)

1.3.1 新生微血管和凋亡細(xì)胞率 對兩組患者治療后肝穿刺活檢標(biāo)本進(jìn)行組織石蠟切片，免疫組化染色。其中兔抗小鼠vWF多克隆抗體和羊抗人HGFK1多克隆抗體購自上海研晶實(shí)業(yè)科技有限公司。UFX-DX倒置顯微鏡和熒光顯微鏡購自日本Olympus公司。陽性細(xì)胞為棕色，新生微血管計(jì)數(shù)首先在低倍鏡視野下確定腫瘤內(nèi)新生微血管最密集區(qū)域，之后在高倍鏡視野內(nèi)計(jì)數(shù)5個(gè)視野，取5個(gè)視野中的新生微血管平均數(shù)。凋亡細(xì)胞率檢測采用原位細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（購自深圳紐邦生物科技有限公司），檢測方法按照試劑盒說明書進(jìn)行。在高倍鏡視野內(nèi)選取5個(gè)區(qū)域進(jìn)行凋亡細(xì)胞和總細(xì)胞計(jì)數(shù)，凋亡細(xì)胞率為二者比值。

1.3.2 臨床療效 采用mRECIST評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，評價(jià)兩組患者治療效果。分為完全緩解（CR）：至少維持4周無新病灶出現(xiàn)，同時(shí)已知病灶消失；部分緩解（PR）：至少維持4周無新病灶出現(xiàn)，同時(shí)已知病灶最大直徑總和縮小>30%；疾病穩(wěn)定（SD）：至少維持4周無新病灶出現(xiàn)，但未達(dá)CR、PR或PD標(biāo)準(zhǔn)；疾病進(jìn)展（PD）：出現(xiàn)新病灶或已知病灶最大直徑總和增大>20%[2]。其中疾病控制率為CR、PR和SD患者占所有患者的比率，疾病緩解率為CR、PR患者占所有患者的比率。

1.3.3 隨訪 對于兩組患者進(jìn)行隨訪，隨訪內(nèi)容為：治療后1年內(nèi)每3個(gè)月檢測一次血清甲胎蛋白（AFP）和腹部CT、胸部CT和骨掃描。1年后每半年復(fù)查一次。對比兩組患者1年、3年的復(fù)發(fā)率和生存率。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)資料以%表示，采用χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料以（x±s）表示，采用t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者治療后新生微血管和凋亡細(xì)胞率比較

AAV-HGFK1+Adv-p53組治療后第14天、第21天的新生微血管數(shù)量顯著低于AAV-HGFK1組，凋亡細(xì)胞率顯著高于AAV-HGFK1組（P<0.01）。兩組患者治療后第21天的新生微血管數(shù)量和凋亡細(xì)胞率均顯著高于治療后第14天（P<0.01）。見表1、封三圖5、圖6。

2.2 兩組患者臨床療效比較

AAV-HGFK1+Adv-p53組的疾病控制率為76.00%，顯著高于AAV-HGFK1組的48.00%（χ2=4.1596，P=0.041<0.05）；兩組患者的疾病緩解率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=2.9138，P>0.05）。見表2。

2.3 兩組患者復(fù)發(fā)率和生存率比較

AAV-HGFK1+Adv-p53組的平均隨訪時(shí)間為（37.1±4.4）個(gè)月（4～51個(gè)月），AAV-HGFK1組的平均隨訪時(shí)間為（18.4±2.7）個(gè)月（3～39個(gè)月）。AAV-HGFK1+Adv-p53組1年、3年復(fù)發(fā)率分別為20.00%和44.00%，1年、3年生存率分別為92.00%和80.00%；AAV-HGFK1組1年、3年復(fù)發(fā)率分別為68.00%和72.00%，1年、3年生存率分別為52.00%和40.00%。AAV-HGFK1+Adv-p53組1年、3年復(fù)發(fā)率顯著低于AAV-HGFK1組，1年、3年生存率顯著高于AAV-HGFK1組（P<0.05）。見表3。

表3 兩組患者復(fù)發(fā)率和生存率比較[n（%）]

3 討論

現(xiàn)階段對于原發(fā)性肝癌的治療越來越傾向于基因水平的干預(yù)治療，鑒于傳統(tǒng)手術(shù)切除原發(fā)肝癌組織并適度聯(lián)合術(shù)后放療或者化療的方式，并未顯著改善患者術(shù)后5年生存率或者中位生存時(shí)間，科研工作者以及一線臨床醫(yī)生越來越傾向于通過轉(zhuǎn)染抑癌基因來干擾腫瘤細(xì)胞增殖以及轉(zhuǎn)移[4]。HGFK1為79個(gè)氨基酸組成的環(huán)形結(jié)構(gòu)，最早被發(fā)現(xiàn)能夠通過抑制成纖維細(xì)胞生長因子而促進(jìn)牛血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，Jin B等[5]研究發(fā)現(xiàn)HGFK1拮抗肝原發(fā)性癌細(xì)胞增殖以及抗局部微血管形成作用主要通過EGF/EGFR或者VEGF/VEGFR信號通路激活來實(shí)現(xiàn)，同時(shí) Jin B等在大鼠肝癌模型中發(fā)現(xiàn)，HGFK1能顯著降低肝細(xì)胞癌局部微血管密度，阻斷相應(yīng)的肺部腫瘤轉(zhuǎn)移的發(fā)生；而P53基因主要通過促進(jìn)受損DNA細(xì)胞凋亡、調(diào)控細(xì)胞周期、修復(fù)DNA異常甲基化或者磷酸化等損傷，實(shí)現(xiàn)其抗腫瘤效應(yīng)，而突變型P53不僅難以維持正常細(xì)胞周期，還可能加劇相關(guān)腫瘤信號通路激活促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖，而 Cheung PF等[6]學(xué)者發(fā)現(xiàn)，原發(fā)性肝癌患者體內(nèi)P53基因突變型約占78%～85%，提示肝癌患者體內(nèi)P53難以發(fā)揮其抗腫瘤效應(yīng)。本研究重在探討AAV-HGFK1聯(lián)合Adv-p53治療原發(fā)性肝癌的療效，以揭示相應(yīng)的基因治療對于肝癌治療的潛在價(jià)值。

本研究在分析進(jìn)展期肝癌患者共50例（包括對照組25例和觀察組25例）相應(yīng)的基因治療的效果后發(fā)現(xiàn)，AAV-HGFK1+Adv-p53組治療后第14天、第21天的新生微血管數(shù)量顯著低于AAV-HGFK1組，凋亡細(xì)胞率顯著高于AAV-HGFK1組，與Wei JC等[7]學(xué)者的結(jié)論相似。Wei JC等[7]發(fā)現(xiàn)P53通過腺病毒成功轉(zhuǎn)染入原發(fā)性肝癌細(xì)胞內(nèi)后，通過抑制G0期細(xì)胞快速進(jìn)入G1期并顯著降低G2/S期細(xì)胞比例抑制腫瘤細(xì)胞增殖，同時(shí)通過激活CMAP/pka/cmyc信號通路促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡，同時(shí)Wei JC等學(xué)者發(fā)現(xiàn)，P53成功轉(zhuǎn)染后，肝癌細(xì)胞局部微環(huán)境顯著發(fā)生改變，局部血管密度顯著降低，腫瘤微環(huán)境中肝癌腫瘤干細(xì)胞比例以及活性顯著降低，并認(rèn)為P53可能通過fasl/caspase8/BAX來抑制局部微血管增生；對于兩組患者臨床療效的對比，本研究發(fā)現(xiàn)AAV-HGFK1+Adv-p53組的疾病控制率為76.00%，顯著高于AAV-HGFK1組48.00%，但兩組患者的疾病緩解率尚無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，考慮AAV-HGFK1+Adv-p53治療后，可能通過抑制腫瘤細(xì)胞增殖、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡、降低局部微血管密度改善患者預(yù)后[8-14]，與Hu S[15]、陸玉敏等[16]學(xué)者的研究結(jié)果一致，Hu S等[15]學(xué)者發(fā)現(xiàn)，P53或者單獨(dú)AAV-HGFK1轉(zhuǎn)染機(jī)體腫瘤細(xì)胞后，其臨床轉(zhuǎn)歸明顯優(yōu)于對照組，同時(shí)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的發(fā)生率由37%顯著下降至15%，Hu S等[15]學(xué)者通過腺病毒轉(zhuǎn)染P53入145例亞洲原發(fā)性晚期肝癌患者局部腫瘤組織細(xì)胞內(nèi)后發(fā)現(xiàn)，患者術(shù)后中位生存由（78.5±11.3）個(gè)月顯著上升至（89.5±14.8）個(gè)月，但本研究并未發(fā)現(xiàn)兩組患者疾病緩解率的差異，考慮可能與本研究樣本量不足有關(guān)，同時(shí)觀察時(shí)間可能不足導(dǎo)致統(tǒng)計(jì)學(xué)差異無法體現(xiàn)。最后本研究對于兩組患者出院后相關(guān)臨床預(yù)后進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)，AAV-HGFK1+Adv-p53組1年復(fù)發(fā)率顯著低于AAV-HGFK1組，1年生存率顯著高于AAV-HGFK1組，進(jìn)一步確認(rèn)了AAV-HGFK1聯(lián)合Adv-p53進(jìn)行基因治療的重要臨床價(jià)值。

在注意到AAV-HGFK1聯(lián)合Adv-p53進(jìn)行基因治療的臨床療效的同時(shí)，部分學(xué)者認(rèn)為，AAV-HGFK1聯(lián)合Adv-p53進(jìn)行基因治療的臨床有效情況以及相關(guān)預(yù)后情況的改善主要取決于原發(fā)性肝癌患者體內(nèi)P53或者HGF的突變型比例[17，18]，如 Giovannini C等[19]學(xué)者注意到，一旦P53或者HGF的突變型比例低于40%，相關(guān)的基因治療對于原發(fā)性肝癌特別是晚期患者基本未見有顯著差異的療效，同時(shí)相關(guān)術(shù)后中位生存時(shí)間并無改善。史守良[20]、王苗等[21]學(xué)者也發(fā)現(xiàn)，P53或者HGF的突變型/野生型比例高于2.5時(shí)，相關(guān)肝癌患者術(shù)后五年生存率僅由45%升高至49%，且未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，這都提示臨床醫(yī)生在不應(yīng)盲目采用基因治療，應(yīng)在綜合衡量后采用合適的治療方案。

綜上所述，Adv-p53、AAV-HGFK1聯(lián)合治療進(jìn)展期肝細(xì)胞癌療效優(yōu)于AAV-HGFK1，并通過抑制腫瘤細(xì)胞增殖、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡、降低局部微血管密度等途徑，提升患者的臨床控制率，并有利于改善患者出院后一年內(nèi)肝癌的復(fù)發(fā)率以及生存率，但對于相關(guān)基因突變導(dǎo)致的臨床有效率的問題需進(jìn)一步大樣本研究。

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（收稿日期：2015-05-06）