不同投餌率對黑鯛及其雜交子二代幼魚影響差異

孫瑞健，仇玉燕，2，楊志強，徐大鳳，肖李霞，秦亞麗，倪可雯，2，周堂建，2，陳淑吟*

(1.江蘇省海洋水產(chǎn)研究所，江蘇 南通 226007；2.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)科學(xué)國家級實驗教學(xué)示范中心，上海 201306；3.江蘇省淡水水產(chǎn)研究所，江蘇 南京 210017；4.江蘇省啟東市漁業(yè)技術(shù)推廣站，江蘇 啟東 226222)

黑鯛(Acanthopagrusschlegelii)是我國南北沿海均有分布的優(yōu)質(zhì)鯛科魚類。利用生長較快的真鯛(Pagrusmajor)與黑鯛雜交獲得的新種質(zhì)，在養(yǎng)殖性能上較其親本有明顯的提升。其中，以黑鯛 (♀)×真鯛(♂)的雜交子一代為親本培育獲得的雜交子二代(暫定名為“雜交鯛”，HF2)，相比黑鯛親本(AS)，有較為明顯的生長優(yōu)勢[1-2]。

綠色高效的飼料投喂策略是當(dāng)前魚類養(yǎng)殖技術(shù)研究的重要內(nèi)容。其中，投餌率指所投飼料量占魚類體質(zhì)量的百分?jǐn)?shù)，是投喂策略中影響投喂效果的重要因素之一[3]。適宜的投餌率，不僅有助于魚類的生長，也有利于養(yǎng)殖環(huán)境的營造及養(yǎng)殖效益的提高[4]。確定最適投餌率對魚類的高效養(yǎng)殖有十分重要的意義[5]。不同養(yǎng)殖魚種的最適投餌率有較大差異，如300～600 g大雜交鱘(Husodauricus♀×Acipenserschrenckii♂)的適宜投餌率為1.2%～1.6%，而在此基礎(chǔ)上降低投餌率至0.8%，其增重率、特定生長率及腸道脂肪酶活性均顯著降低[6]；5～25 g細(xì)鱗鮭(Brachymystaxlenok)幼魚的最適投餌率為3.0%～4.0%，當(dāng)繼續(xù)提高投餌率至5.0%后，其增重率、特定生長率及飼料轉(zhuǎn)化率均顯著降低[7]；約15 g的紅鰭東方鲀(Takifugurubripes)的最適投餌率為4.0%左右，當(dāng)提高投餌率至8.0%～10%后，其成活率和飼料利用率[8]及糜蛋白酶活力[9]均顯著降低；投喂水平為6.0%的1.15 g長吻(Leiocassislongirostris)幼魚的消化酶活性分別顯著高于投喂水平為2.0%和10%[10]。另外，投餌率也會影響?zhàn)B殖魚種的生長及消化攝食等[11-14]，如當(dāng)投餌率從0.5%升高到2.5%時，18～54 g斑鱖(Sinipercascherzeri)幼魚的增重率和特定生長率顯著升高，而投餌率升至3.0%，其飼料效率顯著降低[15]；巴西小沙丁魚(Sardinellabrasiliensis)的全魚脂肪含量隨攝食量的增加而顯著增加，蛋白酶活性則顯著降低[16]；過低或過高的投餌率導(dǎo)致吉富羅非魚(Oreochromisniloticus)餌料系數(shù)顯著升高，特定生長率、cck1(飽食信號)基因表達(dá)量顯著降低[17]。以上研究結(jié)果突顯了在開展魚類養(yǎng)殖時必須確定適宜投餌率的重要價值。而有關(guān)雜交鯛及黑鯛幼魚在生長性能等方面的差異表現(xiàn)研究還未見報道。因此，本文通過分析不同投餌率下雜交鯛與黑鯛幼魚的生長性能、體成分、消化酶活性及生長相關(guān)基因表達(dá)等差異表現(xiàn)，旨在為新種質(zhì)建立科學(xué)的投喂技術(shù)與養(yǎng)殖管理策略，也為海水魚類的新品種選育及養(yǎng)殖提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗魚來源及規(guī)格

實驗魚為江蘇省海水增養(yǎng)殖技術(shù)及種苗中心繁育的健康幼魚。雜交鯛幼魚：體質(zhì)量為(4.38±0.68)g，體長為(5.00±0.24)cm；黑鯛幼魚：體質(zhì)量為(4.83±0.66)g，體長為(5.19±0.26)cm。

1.2 實驗設(shè)計

實驗容器為0.75 m×0.50 m×0.40 m塑料框，水體體積約150 L。每3個塑料桶為1組，即每個實驗組設(shè)3個重復(fù)，兩種魚放養(yǎng)密度均為30尾/桶；投餌率設(shè)置為2.5%、4.0%、5.5%及7.0%，即為4個組別；實驗周期40 d。采用定制的粗蛋白≥40%的海水魚配合飼料投喂，每日投喂2次(7：00、18：00)，飼料粒徑大小根據(jù)魚體規(guī)格而調(diào)整；前期投喂定制海水魚1#配合飼料，后期改為投喂定制海水魚2#配合飼料；每次投喂約40 min后，回收并記錄殘餌量與死亡魚尾數(shù)。

實驗期間水質(zhì)因子采用在線探頭監(jiān)測，水溫22～29℃，pH 7.5～8.2，鹽度29～30，氨氮濃度小于0.2 mg·L-1；24 h持續(xù)充氣，水中溶解氧濃度大于8.0 mg·L-1；每天換水2次，日換水量超過50%。

正式實驗前，將實驗魚先暫養(yǎng)適應(yīng)1周，暫養(yǎng)期間各投喂管理與實驗期一致。

1.3 樣品采集與指標(biāo)測定

養(yǎng)殖實驗結(jié)束后，實驗魚停止投喂24 h，然后從每組3個平行中的桶里隨機(jī)取10尾魚進(jìn)行體長、體質(zhì)量測量，并開始采樣。采樣時，從每個桶里隨機(jī)抽取3尾魚，快速解剖，取肝臟、胃、肌肉等組織速凍于液氮中，之后轉(zhuǎn)移到-80℃冰箱中冷凍保存。

1.3.1 生長指標(biāo)測定

投喂實驗結(jié)束后，根據(jù)雜交鯛及黑鯛的體長、末體質(zhì)量(Final body weight，F(xiàn)BW)，計算實驗魚的增重率(Weight gain rate，WGR)、特定生長率(Special growth rate，SGR)及肥滿度(Condition fact，CF)；解剖后，稱取肝臟重、內(nèi)臟重，計算肝體指數(shù)(Hepatosomatic index，HSI)、臟體指數(shù)(Viscera somatic index，VSI)；65℃烘干每次投喂結(jié)束后回收的殘餌，并稱重，以計算餌料系數(shù)(Feed conversion ratio，F(xiàn)CR)；清算每個實驗組的存活魚尾數(shù)，計算成活率(Survival rate，SR)；以體質(zhì)量樣本標(biāo)準(zhǔn)差和樣本平均數(shù)之比，計算體質(zhì)量變異系數(shù)(Coefficient of variation，CV)。

WGR(%)=100×(Wt-W0)/W0

(1)

SGR(%·d-1)=100×(lnWt-lnW0)/t

(2)

HSI(%)=100×Wh/Wt

(3)

VSI(%)=100×Wv/Wt

(4)

CF(%)=100×Wt/L3

(5)

SR(%)=100×Nt/N0

(6)

(7)

FCR=Fi/(Wt-W0)

(8)

1.3.2 消化酶活力測定

取胃、肝臟組織測定消化酶活力。胃蛋白酶(Pepsin)、脂肪酶(Lipase，LPS)、α-淀粉酶(α-Amylase，α-AMS)活力均采用南京建成生物工程研究所提供的試劑盒進(jìn)行測定，測定方法參照說明書。

1.3.3 基因表達(dá)量測定

取肝臟組織，用于測定相關(guān)基因表達(dá)量。使用Trizol法提取雜交鯛及黑鯛肝臟組織總RNA，采用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)(TaKaRa，#RR047A)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，并置于-20℃保存待用。

根據(jù)黑鯛基因組中的相關(guān)基因序列，應(yīng)用Primer 5.0軟件設(shè)計特異性引物。所有引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成，序列見表1。采用SYBR Green熒光嵌合法，利用BIO-RAD CFX ConnectTM熒光定量 PCR 檢測系統(tǒng)，進(jìn)行實時熒光定量PCR擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)程序為95℃預(yù)變性3 min；循環(huán)條件：95℃變性10 s、55℃退火20 s、72℃延伸20 s、75℃最后延伸5 s，共進(jìn)行40個循環(huán)。反應(yīng)完成后繪制熔解曲線，熔解反應(yīng)條件為65～95℃、升溫速度0.5℃/5 s。選取actin作為內(nèi)參基因，對各組織樣本進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，采用2-ΔΔCt法進(jìn)行計算基因相對表達(dá)量。

表1 實時定量PCR引物Tab.1 Gene-specific real-time quantitative PCR primers

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

實驗數(shù)據(jù)分析應(yīng)用Excel 2019和SPSS 22統(tǒng)計軟件，采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(Mean±SE)表示。當(dāng)差異顯著(P<0.05)時，采用Duncan法進(jìn)行組間差異的多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 雜交鯛及黑鯛的生長性能

雜交鯛及黑鯛的生長性能指標(biāo)檢測結(jié)果見表2。隨著投餌率的升高，兩種實驗魚的FBW、WGR、SGR、CF等均呈現(xiàn)先顯著升高后顯著降低的趨勢(P<0.05)，當(dāng)投餌率為4.0%時，上述指標(biāo)顯著高于其他投喂組(P<0.05)。兩種實驗魚的HSI和SR在投餌率低于5.5%時無顯著變化(P>0.05)，而在投餌率升高至7.0%時，顯著降低(P<0.05)。投餌率對兩種實驗魚的VSI、CV及FCR無顯著影響(P>0.05)。從測試結(jié)果得出，對于雜交鯛、黑鯛，4.0%投餌率均可取得最好的養(yǎng)殖效果。兩種實驗魚相比，雜交鯛在全部組別中的WGR和SGR均高于黑鯛，且在2.5%、4.0%、5.5%這3組尤為顯著(P<0.05)。雜交鯛的FCR也有優(yōu)于黑鯛的表現(xiàn)，4.0%組和5.5%組雜交鯛的FCR分別較黑鯛低23.3%和37.9%，即雜交鯛的飼料轉(zhuǎn)化率高于黑鯛。

表2 不同投餌率下雜交鯛及黑鯛生長性能的變化差異Tab.2 Differences of growth performance of the hybrid porgy of A.schlegelii♀ × P.major ♂ and A.schlegeliiin different feeding rates

2.2 雜交鯛及黑鯛消化酶的變化差異

由消化酶檢測結(jié)果(圖1)可知，隨著投餌率的升高，兩種實驗魚的胃蛋白酶活力顯著降低(P<0.05)，2.5%組的胃蛋白酶活力顯著高于7.0%組(P<0.05)；脂肪酶活力先降低后保持不變，4.0%組的脂肪酶活力顯著低于2.5%(P<0.05)，但與其他2組無顯著差異(P>0.05)；投餌率對兩種實驗魚的α-淀粉酶活力無顯著影響(P>0.05)。此外，4.0%組和5.5%組雜交鯛的胃蛋白酶活力顯著高于黑鯛(P<0.05)。

2.3 雜交鯛及黑鯛ghr和igf1基因表達(dá)量的變化差異

不同投餌率對兩種實驗魚的肝臟ghr和igf1基因表達(dá)水平有不同程度的影響(圖2)。隨著投餌率的升高，雜交鯛的ghr基因表達(dá)量呈先降低后升高的趨勢，2.5%組顯著高于4.0%組(P<0.05)，但與其他2組無顯著差異(P>0.05)；黑鯛的變化趨勢與雜交鯛相似，其中2.5%組顯著高于5.5%組(P<0.05)。兩種實驗魚的igf1基因表達(dá)量呈先升高后降低的趨勢，4.0%組顯著高于2.5%組和7.0%組(P<0.05)，但5.5%組無顯著差異(P>0.05)。此外，4.0%組雜交鯛的ghr基因表達(dá)量顯著低于黑鯛(P<0.05)，4.0%組和5.5%組的igf1基因表達(dá)量顯著高于黑鯛。

注：柱形圖上方無字母或相同字母表示差異不顯著(P>0.05)；不同小寫字母表示實驗組間有差異性顯著(P<0.05)；不同大寫字母表示實驗組內(nèi)種間有差異性顯著(P<0.05)。以下同此。Notes：No letters or the same letters above the column chart indicated that there was no significant difference (P>0.05)，but different small letters meant significant differences between the experimental groups (P<0.05)，and different capital letters meant significant differences among the species within the experimental groups (P<0.05).The same case in the following figures.

3 討論

3.1 生長與飼養(yǎng)效果分析

WGR、SGR、CF等指標(biāo)可以直觀反映養(yǎng)殖魚類的生長效果[18]。FCR是反映飼料利用率的負(fù)相關(guān)指標(biāo)[19]。本實驗中，隨著投餌率的升高，雜交鯛及黑鯛的FBW、WGR、SGR、CF等先顯著升高(4.0%組)后顯著降低(5.5%～7.0%組)，與此相反，F(xiàn)CR先降低后升高，SR在7.0%組顯著降低。這說明在適宜的范圍內(nèi)增加投餌率，魚體的WGR和SGR顯著升高，但過高的投餌率反而不利于魚體的生長。結(jié)合養(yǎng)殖實驗過程，當(dāng)投餌率為2.5%時，實驗魚搶食嚴(yán)重，死亡魚數(shù)明顯多于投餌率為4.0%組和5.5%組；當(dāng)投餌率為4.0%時，實驗魚無激烈搶食，無殘餌；投餌率為5.5%的實驗組殘餌量相較7.0%組的少，死亡魚數(shù)略多于4.0%組；當(dāng)投餌率為7.0%時，實驗魚在每次喂食過后，均存在大量殘餌，且死亡魚數(shù)量最多。這表明，在2.5%投餌率下，較低的營養(yǎng)攝入不足以維持魚體的生長所需，各項生長指標(biāo)均處在較低的水平；投餌率提高至4.0%后，機(jī)體攝入的營養(yǎng)在維持生命活動的同時還可以作為能量積累儲存下來，故WGR、SGR、CF等指標(biāo)均顯著升高；再繼續(xù)提高投餌率后，過大的胃腸負(fù)荷影響了食物中營養(yǎng)的充分吸收，抑制了魚的生長；同時也造成了飼料浪費、水質(zhì)污染，進(jìn)而影響了養(yǎng)殖魚種的存活[20]。不過，可能由于魚類攝食習(xí)性的不同，雜交鱘(A.schrenckii♀ ×A.baeri♂)[21]和羅非魚(Oreochromismossambicus)[22]的WGR和SGR隨投餌率升高呈持續(xù)升高的趨勢，而大雜交鱘[6]、施氏鱘(A.schrenckii)[23]、巨骨舌魚(Arapaimagigas)[24]的WGR和SGR先顯著升高后保持不變。HSI、VSI可以衡量魚體能量狀態(tài)[25]。實驗結(jié)果表明，低于5.5%的投餌率對兩種實驗魚的HSI無顯著影響，繼續(xù)提高投餌率至7.0%后，HSI顯著降低。這表明超過一定的限度后，繼續(xù)提高投餌率，魚體的營養(yǎng)和能量積累并不會隨之增加，甚至還會產(chǎn)生負(fù)面的影響。另外，投餌率對兩種實驗魚的VSI、CV均無顯著影響。綜合上述生長指標(biāo)結(jié)果，在每天2次的投喂頻率下，雜交鯛和黑鯛幼魚的生長最適投餌率為其體質(zhì)量的4.0%。

前期研究中，雜交鯛在每天1～4次的投喂頻率下均有優(yōu)于黑鯛的生長效果[26]，而在本實驗的4個投餌率組別中，雜交鯛的FBW、WGR、SGR亦有優(yōu)于黑鯛的表現(xiàn)，其中投餌率為2.5%的雜交鯛的WGR和SGR分別較黑鯛高21%和11%以上，投餌率為4.0%的分別較黑鯛高31%和14%以上，投餌率為5.5%的分別較黑鯛高49%和24%以上，投餌率為7.0%的分別較黑鯛高4.5%和3.0%左右。這些結(jié)果進(jìn)一步說明了，雜交鯛具有比親本黑鯛更好的生長優(yōu)勢，而FCR的結(jié)果則可以反映出雜交鯛的餌料利用率相對更高，具有更好的品種經(jīng)濟(jì)優(yōu)勢。

3.2 消化酶結(jié)果分析

消化酶顯著影響著魚體吸收和利用營養(yǎng)物質(zhì)[16]。實驗發(fā)現(xiàn)，隨著投餌率的升高，雜交鯛及黑鯛的胃蛋白酶活力顯著降低，脂肪酶活力先在4.0%組顯著降低后維持平衡。這可能是因為在一定程度上，魚類消化酶活力受飽食程度的影響[27]。在投餌率較低時，機(jī)體通過升高消化酶活力來充分分解食物中的大分子物質(zhì)如脂類、蛋白質(zhì)等，為魚體快速供能；加大飼料投喂量后，魚體的消化能力只需維持在正常甚至是較低的水平，就可以滿足生長代謝所需。也有研究推測，這可能是因為高投喂水平下魚體腸胃負(fù)擔(dān)過重，機(jī)體的消化吸收能力下降，從而導(dǎo)致消化酶活力降低[28]。對長吻[10]、施氏鱘[23]等幼魚的研究也得到了類似的結(jié)果。不同的是，大雜交鱘[4]、烏蘇里擬鲿[14]等的胃蛋白酶活性隨著投餌率的升高而升高，推測可能是因為在飼料蛋白質(zhì)的攝入量增加后，其刺激了蛋白酶的分泌。淀粉酶主要水解食物中的淀粉及糖原等貯存多糖，兩種實驗魚的淀粉酶活性較低，且不受投餌率的顯著影響，這可能與雜食性魚類對糖類的利用能力較差有關(guān)[29]。由以上結(jié)果得出，在每天投喂2次的條件下，4.0%的投餌率完全可以滿足實驗魚的生長代謝所需。另外，在4.0%～5.5%的投餌率下，雜交鯛的胃蛋白酶活性顯著高于黑鯛，結(jié)合兩種實驗魚的生長性能及飼料利用率結(jié)果，進(jìn)一步證明了雜交鯛對食物的消化吸收能力更強[28]。

3.3 基因表達(dá)水平分析

igf1基因的表達(dá)受魚類營養(yǎng)狀況的影響[30]。兩種實驗魚的igf1基因表達(dá)量均呈先升高后降低的趨勢，4.0%組顯著高于2.5%組和7.0%組，但與5.5%組無顯著差異。結(jié)合生長性能的相關(guān)檢測結(jié)果分析，當(dāng)投餌率為4.0%時，雜交鯛的WGR分別比投餌率為2.5%和7.0%時高出57%、141%，SGR分別高出26%和61%；當(dāng)投餌率為4.0%時，黑鯛的WGR分別比投餌率為2.5%和7.0%時高出44%和91%，SGR分別高出22%和45%。這說明在過低或過高的投餌率下，igf1基因表達(dá)均會受到顯著的負(fù)面影響，魚體的生長代謝因而受到抑制。

ghr基因是檢驗魚類生長性能和生理狀態(tài)的重要指標(biāo)[31]。隨著投餌率降低，兩種實驗魚的ghr基因表達(dá)量呈先降低后升高的趨勢。這可能是因為在投喂水平過低或過高時，魚體均會通過上調(diào)生長激素及其受體的表達(dá)水平來減小營養(yǎng)不足或過剩給生長帶來的影響[32]。此外，隨著投餌率的升高，兩種實驗魚的ghr與igf1基因表達(dá)量的變化趨勢相反，其中igf1與SGR呈正相關(guān)，ghr與SGR呈負(fù)相關(guān)，該結(jié)果與前期研究結(jié)果一致[26]，同時也證實了雜交鯛有更優(yōu)于黑鯛的生長效果。