一種新型雙酶體系快速檢測葡萄糖的方法

王振濤，許蓓蓓，程曉宏

1. 南通市產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗所（南通 226011）；2. 南通市食品藥品監(jiān)督檢驗中心（南通 226006）；3. 南通市疾病預(yù)防控制中心（南通 226007）；4. 南通市食品危害因子分析重點實驗室（南通 226011）

葡萄糖是生命活動的重要能量物質(zhì)，其濃度水平是糖尿病診斷的一項重要生化指標(biāo)。糖尿病是由飲食、遺傳等因素共同作用而引起的以糖代謝紊亂為主要癥狀的慢性病，可引起失明、腎臟病、心臟病及神經(jīng)損傷等[1]。因此，快速準(zhǔn)確檢測食品和血液中葡萄糖含量對于糖尿病的治療和控制有重大意義。

國內(nèi)外快速檢測葡萄糖方法主要有高效液相色譜法[2-3]、煮沸滴定法[3]、辣根過氧化物酶法[4-6]、過氧化物模擬酶法[7-8]、納米粒子模擬酶法[9-16]、熒光光譜法[17-19]和生物傳感器[20-22]。由于天然酶具有高效催化功能、高度專一性和高度受控性，是檢測葡萄糖的主要手段，但同時天然酶也具有穩(wěn)定性差、易失活、不易制備等缺點，使其在實際應(yīng)用過程中受限。經(jīng)過長時間實踐發(fā)現(xiàn)，上述檢測方法存在缺陷有：試劑合成工藝復(fù)雜，對檢測儀器或設(shè)備要求高；檢測使用的天然生物酶價格昂貴，導(dǎo)致生產(chǎn)成本增高；檢測工序步驟過多，費時費力，難以快速實施。因此，建立一種低成本、快速簡便、靈敏較高的檢測葡萄糖方法十分重要。

天然存在酶具有高效催化活性、高度選擇性和高度受控性的一類特殊蛋白質(zhì)，但是天然酶具有穩(wěn)定性差、成本較高、易失活和不易制備等缺點，使其在實際檢測過程中受限。試驗針對檢測葡萄糖的方法缺點（如天然酶昂貴且穩(wěn)定性差，試劑昂貴，復(fù)雜設(shè)備，合成路線繁瑣，費時費力等），以期提供一種廉價易得、操作簡單和快速高效的檢測葡萄糖方法，可應(yīng)用于食品安全、臨床檢驗等領(lǐng)域。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

圓二色譜儀（Jasco J-815，Japan）；超純水機（Milli-Q，密理博上海公司）；離心機（MIKRO 220R，德國Hettich公司）；分光光度計（WFJ7200，蘇州賽恩斯公司）；電子分析天平（CPA225D，德國賽多利斯公司）；數(shù)顯恒溫水浴鍋（HH-2，國華儀器制造有限公司）。

葡萄糖氧化酶（生物試劑）、葡萄糖、30% H2O2、HCl、KCl、NaCl、三羥基氨基甲烷（Tris）、底物2, 2’-連氮基-雙-（3-乙基苯并二氫噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽（ABTS）、Triton X-100表面活性劑、二甲基亞砜（均為分析純）；二級純水（由Millipore純水儀制備）；G4-DNA VEDF序列為5’-(G3C)2CG5CG3-3’。

1.2 溶液的配制

1.2.1 緩沖溶液的配制

用HCl調(diào)節(jié)緩沖液Tris的pH，依次添加NaCl、KCl，添加Triton X-100表面活性劑，得到緩沖液為20 mmol/L pH 7.4 Tris/HCl，150 mmol/L NaCl，20 mmol/L KCl和0.03% Triton X-100。

1.2.2 G4-DNA溶液的配制

將G4-DNA用緩沖液溶解，并在95 ℃下加熱5 min，加熱結(jié)束后迅速在冰上冷卻至室溫，4 ℃靜置過夜，濃度為10 μmol/L，備用。

1.2.3 氯化血紅素hemin溶液的配制

hemin用二甲基亞砜溶解得10 mmol/L hemin儲備液，于-20 ℃保存，將hemin工作液用緩沖液稀釋成合適的氯化血紅素hemin溶液，濃度為20 μmol/L，備用。

1.2.4 底物ABTS、過氧化氫溶液制備

用緩沖液配制得10 mmol/L底物ABTS工作液溶液，于4 ℃棕色保存?zhèn)溆谩?/p>

取質(zhì)量分?jǐn)?shù)30%的過氧化氫溶液，先用純水稀釋至物質(zhì)濃度100 mmol/L，用緩沖溶液將其稀釋成工作液，臨用前現(xiàn)配。

1.2.5 葡萄糖、葡萄糖氧化酶溶液標(biāo)準(zhǔn)系列配制

葡萄糖固體先用純水稀釋至濃度10 mmol/L，用緩沖溶液將其按濃度梯度稀釋至0，0.125，0.250，0.500，1.00和2.500 mmol/L的濃度梯度溶液，臨用現(xiàn)配。

用緩沖液稀釋10倍，得濃度23.8 U/mL的葡萄糖氧化酶溶液，臨用現(xiàn)配。

1.3 過氧化物模擬酶的構(gòu)建

將上述1.2.2中的G4-DNA溶液與1.2.3中的氯化血紅素hemin溶液等體積混合，室溫孵育1 h，即可構(gòu)建氧化物模擬酶，濃度為5 μmol/L。

1.4 圓二色譜試驗

DNA使用1.2.1緩沖液配制；DNA與hemin的濃度比為2︰1。400 μL DNA與DNA/hemin溶液置于 1 cm比色皿中，掃描收集220~320 nm范圍內(nèi)的圓二色譜，掃描速率為500 nm/min。為便于比較，所得的圓二色譜均為扣除背景、平滑處理、濃度校準(zhǔn)后的結(jié)果。

1.5 葡萄糖定性/半定量分析

依次吸取50 μL 1.2.5中配制的不同濃度梯度葡萄糖溶液，并分別與50 μL葡萄糖氧化酶溶液混合于酶標(biāo)板微孔中，反應(yīng)10 min后，依次加入50 μL濃度5 μmol/L的VEGF/氯化血紅素過氧化物模擬酶和50 μL濃度10 mmol/L的底物ABTS溶液于微孔中，手輕微平移搖動混勻進(jìn)行反應(yīng)，10 min后將各反應(yīng)后的溶液按濃度梯度排列。根據(jù)溶液的變化情況來定性篩查樣品中是否存在葡萄糖。將其溶液顏色和對應(yīng)的葡萄糖濃度制作標(biāo)準(zhǔn)比色卡的色階，作為葡萄糖的半定量分析依據(jù)。

1.6 樣品處理方法

稱取1 g（精確到0.01 g）粉碎均勻的蘋果試樣，加50 mL緩沖液充分搖勻，靜置5 min后，取50 μL上清液，按照上述1.5步驟進(jìn)行定性篩查和半定量分析；在100 μL原始血清中加入1.0 mL三氯乙酸（0.6 mol/L）沉淀蛋白質(zhì)，在10 000 r/min下離心后，將上清液移至5 mL容量瓶，用緩沖液定容，取50 μL上清液，按照上述步驟1.5進(jìn)行半定量分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 圓二色譜圖譜

G-四鏈體結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)的圓二色譜CD信號取決于鏈的方向，平行G-四鏈體結(jié)構(gòu)具有264 nm左右的正峰和240 nm左右的負(fù)峰[23]。從圖1可以看出，G4-DNA VEDF在緩沖液中以平行結(jié)構(gòu)。加入hemin后，hemin誘導(dǎo)VEGF形成的更穩(wěn)定的分子內(nèi)平行結(jié)構(gòu)。而分子內(nèi)平行結(jié)構(gòu)的G4-DNA具有很強的過氧化物酶活性[23]，為建立快速檢測過氧化氫奠定理論基礎(chǔ)。

圖1 VEGF及VEGF/hemin（濃度比2︰1）復(fù)合物的CD光譜

2.2 檢測條件的選擇

G4/hemin模擬酶在室溫、弱堿性條件下活性較高[23-24]。因此，選擇常溫、接近人體液弱堿性pH 7.4用于葡萄糖的分析檢測。

由于分子內(nèi)平行結(jié)構(gòu)G4與hemin是采用上下末端堆積形成的[23,25]，即G4與hemin的最佳濃度比為2︰1。由圖1可知，hemin使得VEGF形成更穩(wěn)定平行結(jié)構(gòu)，進(jìn)而使得VEGF/hemin模擬酶更高的穩(wěn)定性和酶活性。因而，VEGF/hemin濃度比選2︰1。

比較1，2，5，10和20 μmol/L（過氧化物模擬酶終濃度）對催化反應(yīng)的影響：較小濃度1和2 μmol/L過氧化物模擬酶時，催化反應(yīng)所需時間較長；較大濃度10和20 μmol/L時，降解所需時間較短，催化效果太好，不容易區(qū)分葡萄糖的濃度。故選擇中等濃度的5 μmol/L（終濃度）過氧化物模擬酶用于酶催化反應(yīng)。

由于VEGF/hemin模擬酶具有過氧化物酶活性，也具有過氧化氫酶活性，及酶催化的專一性較強，考察乳糖、麥芽糖、蔗糖、果糖等物質(zhì)對模擬酶體系無干擾。

偶聯(lián)VEGF/hemin過氧化物模擬酶和葡萄糖氧化酶雙酶系統(tǒng)活性較強，反應(yīng)5 min后即可觀察到顏色的變化，可用于定性篩查葡萄糖。反應(yīng)10~15 min后，所觀察到顏色基本穩(wěn)定，可用于半定量分析葡萄糖。反應(yīng)超過20 min后，所觀察到顏色可能會因為過量的過氧化氫漂白褪色。故選擇催化反應(yīng)5 min后，可用于快速定性篩查。催化反應(yīng)10 min后，可用于半定量分析。

2.3 葡萄糖定性篩查

吸取50 μL待測樣品溶液和50 μL葡萄糖氧化酶溶液混合于酶標(biāo)板微孔中，反應(yīng)10 min后，依次加入50 μL 5 μmol/L的VEGF/hemin過氧化物模擬酶和50 μL 10 mmol/L的底物ABTS溶液于微孔中，移液槍吹打混勻進(jìn)行反應(yīng)，5 min后通過肉眼觀察溶液的從無色變成綠色，即可初步判斷存在葡萄糖。

2.4 葡萄糖半定量分析

依次吸取50 μL 1.2.5中配制的不同濃度梯度葡萄糖溶液，并分別與50 μL葡萄糖氧化酶溶液混合于酶標(biāo)板微孔中，反應(yīng)10 min后，依次加入50 μL 5 μmol/L的VEGF/hemin過氧化物模擬酶和50 μL 10 mmol/L的底物ABTS溶液于微孔中，移液槍吹打混勻進(jìn)行反應(yīng)，5~10 min后將各反應(yīng)后的溶液按濃度梯度排列，將其溶液顏色和對應(yīng)的葡萄糖濃度制作標(biāo)準(zhǔn)比色卡的色階，作為葡萄糖的半定量分析依據(jù)。

圖2 雙酶體系半定量分析過氧化氫標(biāo)準(zhǔn)色階圖

2.5 樣品分析

2.5.1 蘋果中葡萄糖的快速檢測

稱取1 g（精確到0.01 g）粉碎均勻的蘋果試樣，加50 mL緩沖液充分搖勻，靜置5 min后，取50 μL上清液進(jìn)行定性篩查和半定量分析，其檢測結(jié)果如圖3（A）所示。該蘋果中存在一定量的葡萄糖，且溶液葡萄糖濃度約2.5 mmol/L，經(jīng)計算得蘋果試樣中的葡萄糖含量約2.25%，與文獻(xiàn)報道的蘋果中葡萄糖含量2.5%~3.5%接近。

圖3 雙酶體系快速檢測葡萄糖圖

2.5.2 人血清中葡萄糖的快速檢測

在100 μL原始血清中加入1.0 mL三氯乙酸（0.6 mol/L）沉淀蛋白質(zhì)，在10 000 r/min下離心后，將上清液移至5 mL容量瓶，用緩沖液定容，取50 μL上清液進(jìn)行定性篩查和半定量分析，其檢測結(jié)果如圖3（B）所示。該人血清樣品中存在一定葡萄糖，且葡萄糖溶液濃度約1.0 mmol/L，經(jīng)計算得原始血清葡萄糖含量約5.0 mmol/L，屬于正常血糖濃度范圍。

3 結(jié)論

試驗采用偶聯(lián)過氧化物模擬酶和葡萄糖氧化酶雙酶系統(tǒng)，通過肉眼判斷酶催化作用后，體系顏色的變化和深淺用于快速定性和半定量分析葡萄糖，其構(gòu)建成本較低，方法簡便，穩(wěn)定性和重復(fù)性良好，可推廣應(yīng)用到食品安全和臨床檢驗等各種領(lǐng)域中的葡萄糖快速分析，應(yīng)用前景廣闊。