四川內(nèi)江兩種野生天冬品質(zhì)及去皮前后活性成分分析

勾鳳杰，李博

中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院（北京 100083）

天冬（Radix asparagi）是百合科植物天門冬[Asparagus cochinchinensis（Lour.）Merr.]的干燥塊根，是一種傳統(tǒng)中藥，具有養(yǎng)陰潤燥、清肺生津的功效，主要用于肺燥干咳、頓咳痰黏、咽干口渴、腸燥便秘等癥狀[1]。隨著中藥研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)天冬中含有多糖類、皂苷類、氨基酸等多種活性成分[2]，具有抗癌[3-4]、抗衰老[5-6]、抗炎[7-8]、降血糖[9]、調(diào)節(jié)腸道菌群[10]、神經(jīng)保護(hù)[11-12]等多種藥理功效，但天冬中的活性成分含量因產(chǎn)地和品種的不同具有較大的差異[13-16]，因此目前對于天冬藥材質(zhì)量尚未有統(tǒng)一的評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。

四川省內(nèi)江市是天冬的主產(chǎn)地之一，該地種植天冬的歷史悠久，規(guī)模龐大，有“中國天冬之鄉(xiāng)”的美譽(yù)[17]。除了大片天冬種植園外，研究人員還發(fā)現(xiàn)該地存在一些野生天冬，這些野生天冬生長環(huán)境偏僻，不易查尋。此研究是以此地發(fā)現(xiàn)的兩種野生天冬為試驗(yàn)材料，測定其水分、灰分、淀粉、蛋白質(zhì)等基礎(chǔ)成分和多糖、皂苷、游離氨基酸等活性成分指標(biāo)，從而篩選出更為優(yōu)良的野生天冬品種，為其是否適合進(jìn)行大規(guī)模人工栽培提供理論依據(jù)。此外，天冬藥材在炮制過程中往往有“去皮”這一步驟[18]，而有研究表明天冬皮中也含有較多的活性成分，這樣做會(huì)降低天冬的利用價(jià)值[14]，因此，此研究還測定了去皮前、后天冬中總多糖、總皂苷、游離氨基酸等活性成分的含量，探究去皮的操作是否會(huì)顯著改變天冬中活性成分的含量，旨在為今后天冬藥材的制作方法提供一定的參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

野生鮮天冬（四川省內(nèi)江市山區(qū)），于傳統(tǒng)收獲季節(jié)采挖并經(jīng)由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院李博教授鑒定。

C10J9Q52616標(biāo)準(zhǔn)品薯蕷皂苷元（上海源葉生物科技有限公司）；SLCJ4452氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)液[西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司]；C10421163D-無水葡萄糖（上海麥克林生化科技股份有限公司）；甲醇、乙醇、乙腈（色譜純，美國Thermo Fisher公司）；冰醋酸（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；蒽酮、香蘭素、福林酚（北京索萊寶科技有限公司）；濃硫酸、高氯酸、正丁醇、鹽酸（分析純，北京化工廠）；無水碳酸鈉（西隴化工股份有限公司）；石油醚[現(xiàn)代東方（北京）科技發(fā)展公司]。

1.2 儀器與設(shè)備

DTM-4T高溫馬弗爐（上海儒一恒溫設(shè)備中心）；DHG-9023A電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；UV-5100紫外分光光度計(jì)（上海精密儀器儀表有限公司）；KDN-04A自動(dòng)凱氏定氮儀[閩測儀器設(shè)備（廈門）有限公司]；LC-15C高效液相色譜系統(tǒng)[島津國際貿(mào)易（上海）有限公司]；MS204S電子分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理及形態(tài)特征比較

將采集到的新鮮天冬用冰袋運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室，待洗凈晾干后進(jìn)行長度、直徑、重量的測定。之后對樣品進(jìn)行切片、烘干、制成粉末和過篩，備用。

1.3.2 水分、灰分、淀粉、蛋白質(zhì)的測定

水分測定按照GB 5009.3—2016[19]《食品中水分的測定》中的第一法；灰分測定依據(jù)GB 5009.4—2016[20]《食品中灰分的測定》中的第一法；淀粉的含量按照GB 5009.9—2016[21]《食品中淀粉的測定》中的第一法進(jìn)行測定；蛋白質(zhì)的含量按照GB 5009.5—2016[22]《食品中蛋白質(zhì)的測定》中的第一法測定。

1.3.3 天冬總多糖的測定[16]

繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：精密稱取10 mgD-無水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品，加水溶解，隨后轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中定容，搖勻，即為對照品溶液。分別精密吸取0.1，0.2，0.3，0.4，0.5和0.6 mL無水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液置于具塞試管中，加水至2 mL，緩慢滴加8 mL 0.2%蒽酮-硫酸溶液，混勻，置沸水浴中水浴10 min，取出，置冰水浴中冷卻10 min，空白對照為水。采用紫外-可見分光光度法在576 nm處測定溶液吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，無水葡萄糖質(zhì)量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程，如圖1所示。

圖1 D-無水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

樣品溶液制備：精密稱取1 g天冬粗粉（過0.425 mm篩），置200 mL具塞錐形瓶中，加100 mL石油醚，回流提取至提取液無色，藥渣揮干溶劑；再加入100 mL體積分?jǐn)?shù)為80%的乙醇，水浴回流1 h，趁熱過濾，將殘?jiān)盀V紙置錐形瓶中，加80 mL水，于100 ℃水浴回流1.5 h，趁熱濾過，殘?jiān)板F形瓶用熱水10 mL洗滌1次，濾液加水定容至100 mL容量瓶中。精密量取0.5 mL待測樣，加水至2 mL，按標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制項(xiàng)中的方法顯色和測定，以對照品計(jì)算各樣品中天冬總多糖的含量。

1.3.4 天冬總皂苷的測定[16]

總皂苷標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：精密稱取5 mg薯蕷皂苷元對照品，加甲醇定容至25 mL容量瓶中，搖勻即得。分別精密吸取0.3，0.4，0.5，0.6，0.7和0.8 mL對照品溶液于具塞試管中，置水浴中揮干甲醇液體，之后分別加入0.2 mL 5%香草醛-冰醋酸溶液和0.8 mL高氯酸溶液，蓋上試管塞混勻，在60 ℃水浴加熱顯色15 min，結(jié)束之后冷卻5 min，再加入5 mL冰醋酸稀釋，搖勻?？瞻讓φ諡榧状?，用相同方式顯色，采用紫外-可見分光光度法在456 nm處測定吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)，薯蕷皂苷元質(zhì)量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程，如圖2所示。

圖2 薯蕷皂苷元標(biāo)準(zhǔn)曲線

樣品溶液制備：精密稱取1 g天冬粗粉（過0.425 mm篩），置于100 mL的具塞錐形瓶中，精密吸取50 mL 48%乙醇，搖勻，超聲61 min，過濾后取25 mL續(xù)濾液，沸水浴蒸干，加水轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中并定容，用水飽和正丁醇（每次約10 mL）萃取3次，萃取液合并后減壓回收至干，殘?jiān)蛹状嫁D(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中并定容，作為樣品溶液。精密吸取一定量的樣品溶液，按標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制項(xiàng)下的方法顯色和測定，以對照品計(jì)算各樣品中天冬總皂苷的含量。

1.3.5 天冬游離氨基酸的測定[23]

采用HPLC-異硫氰酸苯酯（PITC）柱前衍生法測定，包括樣品處理、柱前衍生、液相分析及含量計(jì)算四部分。

樣品處理：參考劉夢迪[16]試驗(yàn)方法，并加以修改。精密稱取1 g（精確至0.001 g）大天冬粗粉，置250 mL具塞錐形瓶中，加入80 mL水，在90 ℃水浴80 min，趁熱濾過，殘?jiān)板F形瓶用10 mL熱水洗滌后，收集濾液，加水定容至100 mL，搖勻，即得樣品溶液。

柱前衍生：衍生前先將樣品溶液用水系濾膜過濾（去除水系雜質(zhì)），之后將100 μL 0.1 mol/L異硫氰酸苯酯、100 μL 1 mol/L三乙胺與200 μL樣品混合于離心管中，漩渦振蕩均勻，室溫黑暗條件下1 h，結(jié)束后，向上述反應(yīng)體系中加入400 μL正己烷，漩渦振蕩1 min，靜置10 min，用移液槍吸取下層溶液，并用0.22 μm有機(jī)濾膜過濾，濾液進(jìn)行HPLC分析。

HPLC分析：流動(dòng)相A：10 mmol/L磷酸氫二鈉，10 mmol/L硼酸鈉，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至8.2；流動(dòng)相B：甲醇-乙腈-水（45∶45∶10，V/V）。采用島津LC-15C，Agilent C18柱（250 mm×4.6 mm），流速0.7 mL/min，室溫，檢測波長254 nm，進(jìn)樣量0.7 μL。

氨基酸含量計(jì)算：以0.1 mol/L鹽酸稀釋的氨基酸為標(biāo)準(zhǔn)品，制備一系列濃度的氨基酸標(biāo)液（0.125，0.25，0.5，1和2 μmol/mL），得到各氨基酸峰面積相對于其濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，以計(jì)算氨基酸含量。氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖如圖3所示。

圖3 氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)均設(shè)重復(fù)、平行各3次，所得數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2016和 SPSS 27.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，采用Graphpad Prism 8進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線和氨基酸色譜圖的繪制。根據(jù)計(jì)算得到的數(shù)據(jù)對兩種天冬進(jìn)行對比，并結(jié)合其他文獻(xiàn)資料進(jìn)行綜合評價(jià)。

2 結(jié)果與分析

2.1 兩種野生天冬形態(tài)特征比較

此試驗(yàn)樣品是來自四川內(nèi)江山區(qū)的兩種野生鮮天冬，如圖4所示。兩種天冬均呈長紡錘形，其中大天冬（a）彎曲程度較為明顯，而小天冬（b）略有彎曲。大天冬外皮多呈淡黃棕色，半透明；小天冬外皮顏色偏深，且表皮帶有深淺不等的縱皺紋。大天冬質(zhì)地稍軟，而小天冬質(zhì)地較為堅(jiān)硬；兩種天冬斷面都有黏性，且中部有不透明的細(xì)心，呈黃白色，以上特點(diǎn)均符合天冬特征。如表1所示，大天冬長8~14 cm，直徑約為2.2~3 cm，平均質(zhì)量在60 g左右；小天冬長5~7 cm，直徑約為1~2 cm，平均重量為10 g左右。綜上可知，大天冬塊長約為小天冬2倍，鮮體質(zhì)量約為小天冬的6倍，表明大天冬個(gè)頭更大。張先等[24]測定的貴州產(chǎn)地野生鮮天冬的鮮重為63.31 g，與此研究結(jié)果相近，但其直徑比大天冬要小。

圖4 大天冬（a）與小天冬（b）

表1 兩種鮮天冬性狀特征比較

2.2 兩種野生天冬的基本成分和藥理活性成分分析

兩種野生天冬的基本成分含量如表2所示。兩種天冬的水分含量均在70%以上，且小天冬的水分含量高于大天冬，二者具有一定的顯著性差異（P＜ 0.05）。兩種天冬的灰分含量為2.18~2.59 g/100 g，均低于熊大勝等[25]測定的廣西、湖南、云南等產(chǎn)地天冬的灰分含量3.01~3.17 g/100 g。大天冬中的淀粉含量較高，為29.69 g/100 g，其含量約為小天冬3倍，說明兩個(gè)品種的淀粉含量差異較大。大天冬、小天冬中的蛋白質(zhì)含量不存在顯著性差異。

據(jù)報(bào)道，天冬中主要含有多糖、皂苷和游離氨基酸等藥理活性成分[26]，其中多糖有抗癌[27-28]、增強(qiáng)機(jī)體免疫活性[29]等功能。皂苷有抗腫瘤[30]、抗炎[31]、治療便秘[32]等作用。氨基酸有鎮(zhèn)咳平喘[33]、降血壓和降血糖[34]等功效，因此分析兩種野生天冬中的藥理活性成分含量十分重要。如表2所示，大天冬的總多糖含量為16.17 g/100 g，總皂苷含量為3.63 g/100 g，游離氨基酸含量為1.98 g/100 g，其中多糖含量約為小天冬的2倍，皂苷含量高于小天冬，游離氨基酸低于小天冬，且均具有顯著性差異（P＜0.05）。熊大勝等[25]測定了重慶、云南、廣西和貴州等不同產(chǎn)地的天冬藥材中總多糖、總皂苷及總氨基酸的含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)多糖含量在9.53~13.46 g/100 g，皂苷含量在1.56~1.77 g/100 g，總氨基酸含量在4.13~9.99 g/100 g范圍內(nèi)，經(jīng)對比發(fā)現(xiàn)，此試驗(yàn)樣品野生大天冬含有的多糖和皂苷要顯著高于重慶、云南、廣西和貴州等地的品種，但游離氨基酸含量要低于其測定的經(jīng)酸水解后氨基酸的總含量。由此可見，野生大天冬具有更高的藥用價(jià)值。

表2 兩種天冬的營養(yǎng)成分分析

2.3 大天冬去皮前后藥理活性成分分析

在藥材炮制過程中，天冬要先進(jìn)行去皮處理，但去皮可能會(huì)導(dǎo)致活性成分的損失[14]。因此，試驗(yàn)對去皮前、后大天冬中的總多糖、總皂苷的含量及游離氨基酸種類和含量進(jìn)行了分析。如表3所示，去皮之后大天冬中總多糖、總皂苷及游離氨基酸的含量均出現(xiàn)不同程度的顯著下降，其中總多糖含量下降近22%，總皂苷降低約32.5%，游離氨基酸總量下降約15.6%，且去皮前后的總多糖和總皂苷含量之間存在顯著性差異（P＜0.05）。李敏等[14]對產(chǎn)自四川內(nèi)江種植區(qū)天冬藥材的表皮進(jìn)行了多糖和皂苷的成分測定，發(fā)現(xiàn)一年半生天冬藥材的表皮中皂苷含量約為天冬藥材的2倍，同時(shí)也含有較高的多糖，這表明天冬皮含有較多的活性成分，與此試驗(yàn)的結(jié)果具有一致性。

表3 大天冬去皮前后活性成分比較 單位：g/100 g

目前，研究者還尚未探究去皮對天冬中游離氨基酸組成的影響。因此，研究還測定了去皮前、后大天冬中游離氨基酸的種類和含量。如表4所示，去皮前后大天冬所含游離氨基酸種類是一致的，且大多數(shù)氨基酸的含量均出現(xiàn)了不同程度的下降。但去皮前，大天冬中甘氨酸最多，占總氨基酸的24.7%；甲硫氨酸最少，占總氨基酸的0.9%。去皮之后，蘇氨酸最多，占比25.5%；纈氨酸最少，占比0.7%，這表明去皮導(dǎo)致主要氨基酸的含量發(fā)生了變化。綜上可知，天冬表皮中也含有較多的多糖、皂苷和游離氨基酸，因此去皮之后會(huì)導(dǎo)致這些活性成分的損失，降低其藥用活性。

表4 大天冬去皮前后游離氨基酸種類 單位：mg/g

3 結(jié)論

此試驗(yàn)對四川省內(nèi)江市山區(qū)發(fā)現(xiàn)的兩種野生天冬進(jìn)行了活性成分的檢測和品質(zhì)分析。其中野生大天冬長約8~14 cm，直徑約為2.2~3 cm，平均質(zhì)量為60 g。多糖、皂苷和游離氨基酸等藥理活性成分含量顯著高于小天冬，且優(yōu)于其他產(chǎn)地天冬藥材的相關(guān)測定結(jié)果。野生大天冬在大小形態(tài)和藥理活性成分含量等方面均優(yōu)于其他產(chǎn)地的現(xiàn)有天冬，因此適合進(jìn)行大規(guī)模的人工栽培。此外，此研究還表明去皮會(huì)導(dǎo)致天冬總多糖、總皂苷及游離氨基酸等藥理活性成分的損失，因此，在天冬炮制過程中可以考慮省略“去皮”這一步驟，從而最大程度地保留天冬的藥理活性成分，同時(shí)也可減少人工成本和藥材資源的浪費(fèi)。