宜春明月山富硒土壤中耐硒酵母菌株的篩選與鑒定

包珍，嚴美婷，許莉倩，肖勇生

江西省檢驗檢測認證總院食品檢驗檢測研究院（宜春 336000）

硒是人體必需的15種微量元素之一，是人體內(nèi)許多種酶的活性基團，硒對人體健康有著直接或間接的影響，是很好的抗氧化劑，有抗腫瘤、防衰老和增強機體免疫力等多種功能[1-4]?？茖W(xué)研究表明：缺硒會引起人體許多生理功能的下降，從而導(dǎo)致克山病、糖尿病、大骨節(jié)病、心腦血管病、神經(jīng)退行疾病等多種疾病的發(fā)生[5-8]。江西省宜春市是全國三大天然富硒地之一，根據(jù)2018年宜春市全域開展的硒資源普查，全市有1 545萬畝（1畝=666.67 m2）富硒土壤和潛在富硒土壤，占全市國土面積的55%[9]。但由于自然界中的硒元素多以人類不能直接吸收和使用的無機硒形式存在，于是，如何將無機硒轉(zhuǎn)化為有機硒，就成了人們研究的重點。酵母菌可以在細胞內(nèi)將含硫氨基酸替換為硒生成硒代氨基酸，從而實現(xiàn)無機硒向?qū)ι眢w無毒害作用的有機硒轉(zhuǎn)化，因此，對耐硒酵母菌的篩選馴化具有十分重要的科學(xué)價值[10-11]。研究通過采用PDA培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、馬丁氏培養(yǎng)基篩選出耐亞硒酸鈉濃度較高的菌株，根據(jù)菌株形態(tài)學(xué)特征和菌株26S rDNA基因序列進行分析后，對其進行種屬分類鑒定，為宜春富硒土壤資源轉(zhuǎn)化為經(jīng)濟資源提供了生物種質(zhì)資源和技術(shù)手段，豐富了富硒酵母菌株的資源[12]。

1 材料與設(shè)備

1.1 土壤樣品

土壤樣品采集自宜春明月山地區(qū)毛竹林，選取毛竹筍根系旁的土壤，除去表面沙土和雜物，采集深度20~30 cm左右的土樣多點混勻，去除石塊、根莖、落葉等，用自封袋密封帶回實驗室，以備篩選耐硒菌株時使用。

1.2 培養(yǎng)基和試劑

PDA培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、馬丁氏培養(yǎng)基（廣東環(huán)凱微生物科技有限公司）；98%亞硒酸鈉（鄭州百利化工產(chǎn)品有限公司）。

AX523ZH電子天平[奧豪斯儀器（上海）有限公司]；SW-CJ-2D潔凈工作臺（蘇州凈化設(shè)備有限公司）；BSP-400生化培養(yǎng)箱（上海博迅儀器有限公司）；LDZD-150L滅菌鍋（上海申安醫(yī)療器械廠）；SHA-CA水浴恒溫振蕩器（常州榮華儀器制造有限公司）；CX31顯微鏡（OLYMPUS）。

2 試驗方法

2.1 菌株的篩選

采集回的土壤樣品，經(jīng)原子熒光法檢測后土壤中總硒含量大于0.6 mg/kg作為試驗土壤樣品。稱取試驗土壤樣品10 g，倒入裝有90 mL滅菌去離子水的錐形瓶中，在30 ℃ 100 r/min條件下恒溫振蕩10 min后靜置30 min。取1 mL上清液在含有14 μg/mL亞硒酸鈉的PDA培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、馬丁氏培養(yǎng)基上分別進行平板涂布分離，觀察單株菌落在平板上的生長狀態(tài)和菌落形態(tài)。挑取不同菌落形態(tài)、生長狀況良好的單個菌落，在同樣的培養(yǎng)基上進行劃線培養(yǎng)純化，將純化后的菌種進行平板培養(yǎng)基梯度硒耐受篩選，篩選平板培養(yǎng)基中亞硒酸鈉質(zhì)量濃度梯度為20，40，80和120 μg/mL，對耐硒能力較差的菌株在篩選過程中不斷進行淘汰，篩選出耐硒能力強的菌株[13-14]。

2.2 菌株的鑒定

觀察平板上菌株的菌落特征，挑取菌落用革蘭氏染色法在顯微鏡下觀察菌株的形態(tài)結(jié)構(gòu)。將符合典型酵母菌特征的菌株送廣東省微生物分析檢測中心進行生理生化和分子生物學(xué)鑒定。根據(jù)26S rDNA序列信息結(jié)果，在NCBI上進行BLAST比對，利用MEGA 7.0構(gòu)建進化樹，獲得菌株種屬信息。

3 結(jié)果與分析

3.1 耐硒菌株的篩選

當亞硒酸鈉質(zhì)量濃度在選擇性平板分離培養(yǎng)過程中達到120 μg/mL時，菌株基本停止生長，最終在亞硒酸鈉質(zhì)量濃度為80 μg/mL的平板上，獲得耐硒能力較強的7個菌株，分別是：營養(yǎng)瓊脂平板上分離得到三種不同形態(tài)的菌落，編號為Y3、Y7、A1；PDA培養(yǎng)基平板上分離得到兩種不同形態(tài)菌落，編號為P1和P5；馬丁氏培養(yǎng)基平板中分離得到兩種不同形態(tài)的菌落，編號為M3和M5。

3.2 耐硒酵母菌株的鑒定

3.2.1 耐硒酵母菌株的形態(tài)特征

對篩選出的菌株進行形態(tài)觀察，經(jīng)過觀察：菌株A1菌落如圖1（A）所示，菌落為白色、圓形、表面光滑濕潤；菌株P(guān)1如圖1（B）所示，菌落為白色、圓形、凸起、有皺褶、有明顯的酵母發(fā)酵氣味。在顯微鏡下用革蘭氏染色法觀察兩株菌株的菌體形態(tài)特征，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：菌株A1和P1均呈酵母菌細胞卵圓形、芽殖，如圖1（C）和（D）所示。

3.2.2 耐硒酵母菌株的生理生化特征

生理生化鑒定試驗主要有糖類發(fā)酵、碳源同化等試驗[15]。菌株A1、P1的生理生化反應(yīng)結(jié)果見表1。由表1結(jié)果可看出：葡萄糖、半乳糖、麥芽糖、蔗糖、乳糖、纖維二糖、松叁糖、棉子糖、L-阿拉伯糖、D-木糖、海藻糖可被菌株A1分解同化利用，醇類可同化肌醇、山梨醇。菌株P(guān)1只對葡萄糖，D-木糖，纖維二糖，蔗糖，棉子糖有分解利用作用。

表1 耐硒酵母菌株的生理生化特性

3.2.3 耐硒酵母菌株的分子生物學(xué)鑒定

菌株A1和P1的26S rDNA測序結(jié)果在NCBI上的GeneBank進行Blast同源性比對，獲得2株耐硒酵母菌株近緣種相似種屬（見表2），結(jié)果發(fā)現(xiàn)菌株A1與Saitozymapodzolica同源性達100%，菌株P(guān)1與Cyberlindnerasaturnus同源性99%以上。使用MEGA 7.0軟件中構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，如圖2所示[16-17]，進一步表明菌株A1與Saitozymapodzolica聚為一支，菌株P(guān)1與Cyberlindnerasaturnus聚為一支。

圖2 菌株26S rDNA基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹

表2 菌株26S rDNA同源性分析

4 結(jié)論

研究通過對宜春明月山地區(qū)毛竹林土壤耐硒菌株進行篩選，篩選得到7株具有較強耐硒能力的菌株，經(jīng)過形態(tài)學(xué)觀察后對其中兩株具有典型酵母菌形態(tài)特征的菌株進行分子生物學(xué)鑒定。經(jīng)初步鑒定，其中菌株P(guān)1為Cyberlindnerasaturnus（土星形塞伯林德納氏酵母），該菌株目前發(fā)現(xiàn)可用于科研或生產(chǎn)，主要用于生產(chǎn)2-乙酯，有較高的實際應(yīng)用價值；A1為Saitozymapodzolica，暫未查明其具體使用用途。研究為下一步對富硒酵母蛋白、水溶性有機硒等產(chǎn)品研究和開發(fā)提供了理論依據(jù)，且耐硒酵母菌在土壤硒活化方面有巨大的應(yīng)用潛力，對宜春明月山地區(qū)富硒土壤資源利用、富硒農(nóng)產(chǎn)品開發(fā)等具有重要的現(xiàn)實意義。