基于模式識(shí)別技術(shù)結(jié)合UPLC的西紅花產(chǎn)地鑒別

管彬彬，熊金恩，李克慶，朱琳，蔣凡

南通市食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)中心（南通 226006）

西紅花為鳶尾科植物番紅花（Crocus sativus L.）的干燥柱頭，是一種名貴的藥食同源產(chǎn)品，用途廣泛，在一些歐洲國(guó)家，如法國(guó)、西班牙、希臘等地區(qū)，西紅花常被作為不可或缺的食品添加劑和香料。在中國(guó)，西紅花是特別珍貴的中藥材和膳食材料，具有活血化瘀、解郁安神、涼血解毒等功效，其有效成分包括西紅花苷、苦番紅花素和藏紅花醛等[1-3]。其中西紅花苷是西紅花色澤主要來(lái)源，具有活血、養(yǎng)顏、降血脂等作用；苦番紅花素是西紅花的主要呈味物質(zhì)，具有消炎、抗腫瘤等作用；藏紅花醛是西紅花香氣的主要來(lái)源，具有緩解心肌損傷、抗氧化應(yīng)激等作用[4-6]。以上幾種成分賦予西紅花明媚的色彩、獨(dú)特的香氣和味道，集觀(guān)賞、藥用和經(jīng)濟(jì)價(jià)值于一身。

因?yàn)樗幉脑谀骋坏赜蛱囟ǖ淖匀簧鷳B(tài)環(huán)境下，加之較為集中的栽培、生產(chǎn)、加工技術(shù)，使其品質(zhì)優(yōu)良、療效確切，因此中藥素來(lái)有“道地藥材”一說(shuō)，產(chǎn)地的“道地性”在很大程度上也是中藥材品質(zhì)的保證[7-8]。西紅花的原產(chǎn)地位于西亞中東地區(qū)，主要分布在地中海沿岸以及歐洲，再經(jīng)印度到西藏傳入我國(guó)，故又被稱(chēng)為“藏紅花”或“番紅花”。在20世紀(jì)80年代，我國(guó)進(jìn)行了引種栽培，在上海、江蘇、浙江以及河南等地實(shí)現(xiàn)了規(guī)模化的種植[9-11]。目前西紅花在各個(gè)國(guó)家及地區(qū)都有規(guī)模化的培育和種植，但是也正是由于受到產(chǎn)地及種植方式等差異的影響，各產(chǎn)地的西紅花藥材品質(zhì)和質(zhì)量也存在差異[12-13]。此次研究以不同產(chǎn)地的西紅花為研究對(duì)象，通過(guò)UPLC分離和檢測(cè)其有效成分，結(jié)合模式識(shí)別，對(duì)產(chǎn)地進(jìn)行區(qū)分。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

西紅花樣本分別購(gòu)自于上海、江蘇、浙江、伊朗、西藏5個(gè)地區(qū)，共29批，每批樣品取3份，共87份樣品，具體樣品信息見(jiàn)表1。

Waters H-class超高效液相色譜系統(tǒng)（美國(guó)沃特斯）；KQ5200DB超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；Sartorius CPA225D電子分析天平（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；Milli-Q Academic超純水機(jī)（密理博上海公司）。

對(duì)照品西紅花苷Ⅰ（批號(hào)111588-201704，含量以88.4%計(jì)）、西紅花苷Ⅱ（批號(hào)111589-201705，含量以92.2%計(jì)）、苦番紅花素（批號(hào)112056-202102，含量以97.3%計(jì)）：中國(guó)食品藥品檢定研究院；藏紅花醛[純度≥99.5%，梯希愛(ài)（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司]。

乙腈（默克股份有限公司）為色譜純，乙酸（西隴科學(xué)股份有限公司）為優(yōu)級(jí)純，乙酸銨（西隴科學(xué)股份有限公司）、無(wú)水乙醇（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）為分析純，水為超純水。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件

色譜柱：安捷倫ZORBAX Eclipse Plus C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；柱溫：35 ℃；流動(dòng)相A為0.05 mol/L乙酸銨水溶液（含0.05%乙酸），流動(dòng)相B為乙腈，流動(dòng)相梯度程序見(jiàn)表2。

表2 流動(dòng)相梯度程序

進(jìn)樣量為1 μL；西紅花苷Ⅰ和西紅花苷Ⅱ的檢測(cè)波長(zhǎng)為440 nm，苦番紅花素的檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm，藏紅花醛的檢測(cè)波長(zhǎng)為308 nm[14-15]。

1.2.2 樣品預(yù)處理

精密稱(chēng)取40 mg西紅花藥材粉末，置于100 mL棕色量瓶中，加入90 mL 70%乙醇水溶液，冰浴超聲20 min后放至室溫，再以初始流動(dòng)相比例A-B（90∶10，V/V）定容，搖勻，用0.22 μm的有機(jī)濾膜過(guò)濾后即得。

1.2.3 對(duì)照品溶液的制備

分別取適量對(duì)照品西紅花苷Ⅰ、西紅花苷Ⅱ、苦番紅花素、藏紅花醛，精密稱(chēng)定，置10 mL量瓶中，以初始流動(dòng)相（A-B=90∶10，V/V）配制成質(zhì)量濃度約為0.4 mg/mL的對(duì)照品儲(chǔ)備液，再用70%乙醇分別稀釋成質(zhì)量濃度為0.181，0.363，0.904，1.809，3.617，9.043，18.087和90.433 μg/mL的西紅花苷Ⅰ系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，質(zhì)量濃度為0.197，0.394，0.984，1.968，3.935，9.838，19.675，98.377 μg/mL的西紅花苷Ⅱ系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，質(zhì)量濃度為1.718，3.436，6.871，17.178，34.355，68.710和171.776 μg/mL的苦番紅花素系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，以及質(zhì)量濃度為0.380，0.950，1.900，3.800，9.500和19.000 μg/mL的藏紅花醛系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別以液相色譜圖的峰面積為縱坐標(biāo)，對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 線(xiàn)性關(guān)系

利用UPLC對(duì)不同產(chǎn)地的西紅花中的西紅花苷Ⅰ、西紅花苷Ⅱ、苦番紅花素、藏紅花醛進(jìn)行分析，以上色譜條件能將以上成分完全分離，理論塔板數(shù)按所測(cè)各成分色譜峰計(jì)均不低于10 000，分離度均不小于1.5，對(duì)照品和樣品色譜圖分別見(jiàn)圖1和圖2。其中：西紅花苷Ⅰ的回歸方程為Y=2.105×107X+4.623× 103，r=0.999 9，線(xiàn)性范圍為0.181~90.433 μg/mL；西紅花苷Ⅱ的回歸方程為Y=2.604×107X+3.941×103，r=0.999 9，線(xiàn)性范圍為0.197~98.377 μg/mL；苦番紅花素的回歸方程為Y=3.325×106X-2.921×103，r=1.000 0，線(xiàn)性范圍為1.718~171.776 μg/mL；藏紅花醛的回歸方程為Y=1.224×107X-3.080×102，r=1.000 0，線(xiàn)性范圍為0.380~19.000 μg/mL。

圖1 混合對(duì)照品溶液色譜圖

圖2 樣品液相色譜圖

2.2 精密度

取編號(hào)為S1的西紅花樣品，按1.2.2小節(jié)進(jìn)行樣品預(yù)處理后上機(jī)，分別于1天內(nèi)連續(xù)進(jìn)樣6次和連續(xù)3 d內(nèi)重復(fù)進(jìn)樣3次，西紅花苷Ⅰ的日內(nèi)精密度和日間精密度分別為0.98%和1.01%，西紅花苷Ⅱ的日內(nèi)精密度和日間精密度分別為0.34%和1.27%，苦番紅花素的日內(nèi)精密度和日間精密度分別為0.92%和1.68%，藏紅花醛的日內(nèi)精密度和日間精密度分別為1.08%和1.77%，精密度良好。

2.3 回收率

取3份已知含量的編號(hào)為S1的西紅花樣品，每份20 mg，精密稱(chēng)定，置100 mL量瓶中，分別精密加入相當(dāng)于樣品成分量100%的各對(duì)照品溶液，按1.2.2小節(jié)進(jìn)行樣品預(yù)處理后上機(jī)測(cè)定，西紅花苷Ⅰ、西紅花苷Ⅱ、苦番紅花素、藏紅花醛的回收率分別為100.01%，100.10%，99.46%和98.00%，SRSD分別為0.14%，0.04%，0.78%和0.40%。

2.4 樣品測(cè)定結(jié)果

將UPLC測(cè)得的87份樣本的西紅花苷Ⅰ、西紅花苷Ⅱ、苦番紅花素、藏紅花醛四種成分峰面積，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，并折算其干燥失重后，得到各樣本中的各自含量，如表3所示。從表3可以看出，不同產(chǎn)地的西紅花樣本中的成分存在一定差異。浙江和上海的西紅花苷Ⅰ、西紅花苷Ⅱ較為接近，均高于其他地區(qū)，其中浙江的西紅花苷Ⅰ、西紅花苷Ⅱ平均含量最高，西藏和伊朗的西紅花苷Ⅰ、西紅花苷Ⅱ含量較為接近，均比較低，這可能是由于浙江、江蘇和上海的西紅花多為大棚種植，而伊朗和西藏多為露天種植的原因；浙江產(chǎn)的苦番紅花素的含量遠(yuǎn)高于其余產(chǎn)地，江蘇和上海產(chǎn)的含量接近；藏紅花醛含量江蘇產(chǎn)的西紅花含量最高，伊朗和上海的較為接近，浙江和西藏的藏紅花醛含量均比較低，這可能與當(dāng)?shù)氐募庸すに囉嘘P(guān)。

2.5 方差分析

分別對(duì)5個(gè)不同產(chǎn)地的西紅花4種有效成分進(jìn)行單因素方差分析，結(jié)果見(jiàn)表4。從表4可以看出，上海、江蘇、浙江、西藏、伊朗的西紅花樣本中的西紅花苷Ⅰ、西紅花苷Ⅱ、苦番紅花素、藏紅花醛這4種成分含量均存在顯著性差異，P值均小于0.01。

表4 不同產(chǎn)地西紅花有效成分差異方差分析表

2.6 主成分分析

圖3是不同產(chǎn)地西紅花樣本中西紅花苷Ⅰ、西紅花苷Ⅱ、苦番紅花素、藏紅花醛的含量進(jìn)行主成分分析后前3個(gè)主成分的得分圖，是校正集中的西紅花樣本在該三維平面上的投影?？梢钥闯?，第一主成分（PC1）的貢獻(xiàn)率為97.58%，第二主成分（PC2）的貢獻(xiàn)率為2.40%，第三主成分（PC3）的貢獻(xiàn)率為0.01%，不同產(chǎn)地的西紅花在圖上有一定的分類(lèi)趨勢(shì)，上海的西紅花樣本能和其他產(chǎn)地樣本完全分開(kāi)，浙江和江蘇的西紅花樣本也有一定的聚類(lèi)趨勢(shì)，但是兩省樣本有一定的重疊，西藏的西紅花樣本投影點(diǎn)分布比較分散，和伊朗的西紅花樣本有一定重疊，這是由于通過(guò)UPLC測(cè)得的西藏和伊朗的西紅花樣本中的有效成分含量均比較接近，投影點(diǎn)分布交叉較多。

2.7 模式識(shí)別

以不同產(chǎn)地的西紅花樣本的主成分得分向量作為線(xiàn)性判別（LDA）模型的輸入，進(jìn)行LDA分析。從圖4（a）可以看出，當(dāng)主成分因子數(shù)（Pcs）為2時(shí)，西紅花產(chǎn)地鑒別的訓(xùn)練集和預(yù)測(cè)集的識(shí)別率均為最高，分別為81.03%和86.21%，預(yù)測(cè)集樣本中有4個(gè)樣本判別錯(cuò)誤，其中有2個(gè)浙江的西紅花樣本誤判為江蘇，1個(gè)西藏的西紅花樣本誤判為伊朗，1個(gè)伊朗的西紅花樣本誤判為西藏。將不同產(chǎn)地的西紅花樣本的主成分得分向量作為K臨近（KNN）模型的輸入，進(jìn)行KNN模型分析，當(dāng)K值為1，主成分?jǐn)?shù)為3時(shí)，模型的預(yù)測(cè)集識(shí)別率最高，為100%，此時(shí)訓(xùn)練集的識(shí)別率為96.55%。

圖4 不同產(chǎn)地西紅花樣本的LDA（a）和KNN（b）模型識(shí)別率

3 結(jié)論與討論

文章建立了一種基于UPLC法同時(shí)定量檢測(cè)不同產(chǎn)地西紅花樣本中西紅花苷Ⅰ（保留時(shí)間3.909 min）、西紅花苷Ⅱ（保留時(shí)間4.232 min）、苦番紅花素（保留時(shí)間3.235 min）、藏紅花醛（保留時(shí)間11.751 min）這4種有效成分的方法，還可通過(guò)該方法同時(shí)鑒別西紅花樣本中是否添加檸檬黃（保留時(shí)間0.820 min）、新品紅（保留時(shí)間5.118，5.702和6.551 min）、金胺O（保留時(shí)間5.210和6.222 min）、胭脂紅（保留時(shí)間2.547 min）等色素，色譜圖中峰形對(duì)稱(chēng)無(wú)干擾，分離度均大于1.5。從方差分析結(jié)果看，試驗(yàn)不同產(chǎn)地樣本中西紅花苷Ⅰ、西紅花苷Ⅱ、苦番紅花素、藏紅花醛的含量均存在顯著性差異。將UPLC測(cè)得的4種有效成分主成分分析后的得分向量作為模式識(shí)別的輸入，進(jìn)行LDA、KNN模式識(shí)別，結(jié)果表明KNN模型的效果更加，當(dāng)主成分?jǐn)?shù)為3，K值為1時(shí)，模型的訓(xùn)練集和預(yù)測(cè)集的識(shí)別率分別為96.55%和100%。結(jié)果表明模式識(shí)別技術(shù)結(jié)合UPLC的西紅花產(chǎn)地鑒別是可行的。此次試驗(yàn)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)地的西紅花中的有效成分存在顯著性差異，但要使模型更加準(zhǔn)確可靠，還需收集更多數(shù)量的西紅花樣本，此外，還需進(jìn)一步研究不同產(chǎn)地西紅花樣本含量不同的原因，以便后期整體提高西紅花的質(zhì)量。