青楷槭莖皮乙醇提取工藝優(yōu)化和抗氧化性研究

熊思瑞，金鐵巖

延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院（延吉 133002）

青楷槭（Acer tegmeutosumMaxim）屬槭樹(shù)科、落葉喬木，普遍高度在10~15 m之間，樹(shù)皮顏色偏灰，摸上去略微平滑，有少許黑色裂紋[1]。青楷槭又名青楷子或遼東槭，主要產(chǎn)于中國(guó)長(zhǎng)白山和俄羅斯遠(yuǎn)東地區(qū)，是長(zhǎng)白山地區(qū)特有植物，且資源豐富[2]。目前，已從青楷槭中分離多種生物活性成分，如多酚、紅景天、木質(zhì)素等。朝鮮、日本等地民間藥方中將青楷槭視為可以防治眼部疾患和肝病的秘方良藥[3]。在國(guó)內(nèi)，人們通過(guò)泡水或食用青楷槭莖皮和幼葉來(lái)保肝、解酒、抗菌消炎、化毒等。而且，青楷槭還有抗血管增生、抗腫瘤和阻止脂肪生成等藥理作用[4]。

常用的植物生物活性物質(zhì)提取方法包括傳統(tǒng)水蒸氣蒸餾提取法和有機(jī)溶劑提取法[5]。水蒸氣蒸餾法[6]提取植物生物活性物質(zhì)雜質(zhì)較多，如無(wú)機(jī)鹽、蛋白質(zhì)、糖等，且當(dāng)水浴溫度過(guò)高時(shí)破壞生物活性成分的程度還有待進(jìn)一步研究。有機(jī)溶劑提取法[7]操作簡(jiǎn)單，生物活性物質(zhì)的損失減少，提取率高、溶劑用量少，省時(shí)省力，不足之處是容易造成溶劑的殘留。青楷槭主要化學(xué)成分為多酚類(lèi)物質(zhì)，乙醇可以很好地溶解多酚類(lèi)物質(zhì)。為避免溶劑殘留的現(xiàn)象，試驗(yàn)在樣品旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后進(jìn)行真空冷凍干燥處理。

植物多酚又稱(chēng)植物單寧，其具有比較強(qiáng)的抗菌活性和抗氧化能力，具有減輕細(xì)胞和組織中存在的氧化損傷的作用，因而可以將其作為一種天然的抗氧化劑應(yīng)用到不同的領(lǐng)域中[8]。DPPH·是一個(gè)穩(wěn)定的以氮原子為中心的質(zhì)子供體自由基，其在波長(zhǎng)為517 nm處具有最大吸收，在其與抗氧化劑反應(yīng)時(shí)，抗氧化劑中的電子與其孤正電子配對(duì)，使其在乙醇溶液褪去紫色變?yōu)辄S色，抗氧化劑的活力強(qiáng)弱[9-10]表現(xiàn)為其褪色程度。2, 2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽與過(guò)二硫酸鉀反應(yīng)，生成綠色的ABTS+·[11]，ABTS+·消除能力是反映抗氧化劑抗氧化能力的關(guān)鍵指標(biāo)。

為進(jìn)一步分離青楷槭莖皮生物活性成分，豐富槭樹(shù)科的利用價(jià)值，現(xiàn)探究其醇提物最優(yōu)提取條件并測(cè)定其抗氧化性，為合理利用青楷槭資源提供理論支持。試驗(yàn)以過(guò)孔徑0.250 mm篩的青楷槭莖皮為原料，經(jīng)乙醇浸泡、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)的方式提取酚類(lèi)物質(zhì)，福林-酚法計(jì)算總酚含量，利用正交試驗(yàn)對(duì)青楷槭莖皮乙醇提取條件進(jìn)行優(yōu)化，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選擇料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)及浸泡時(shí)間為自變量，以青楷槭莖皮醇提物總酚含量為因變量，采用三因素三水平分析法優(yōu)化青楷槭莖皮提取條件，并通過(guò)測(cè)定最優(yōu)條件提取物的DPPH·、ABTS+·兩種自由基的清除率來(lái)評(píng)價(jià)青楷槭莖皮醇提物的抗氧化作用。BHA擁有較高的抗氧化能力，是一種優(yōu)秀的抗氧化劑。通過(guò)將青楷槭莖皮醇提物的各項(xiàng)測(cè)定數(shù)據(jù)與BHA的各項(xiàng)數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，則可以較為直觀地體現(xiàn)出其醇提物的抗氧化能力。文章旨在增加青楷槭的綜合利用，為青楷槭莖皮深加工技術(shù)的發(fā)展提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

青楷槭莖皮（延吉市西市場(chǎng)）；福林試劑（上海源葉生物科技有限公司）；DPPH、ABTS、BHA（上海源葉生物科技有限公司）；無(wú)水乙醇、沒(méi)食子酸、碳酸鈉、過(guò)硫酸鉀（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；無(wú)水乙醇、過(guò)硫酸鉀、碳酸鈉均為分析純。

1.1.2 儀器與設(shè)備

ME204E型分析天平（梅特勒-托利多）；LT2002TS型電子天平（常熟市天量?jī)x器有限責(zé)任公司）；DK-8D型電熱恒溫水浴鍋（無(wú)錫沃信儀器有限公司）；SY2000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；SHZ-D（III）型真空抽濾機(jī)（上海力辰邦西儀器科技有限公司）；FD-IC-50型真空冷凍干燥（北京博醫(yī)試驗(yàn)儀器有限公司）；UV-1800型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海美譜達(dá)儀器有限公司）；1400032S型電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海恒科儀器有限公司）。

1.1.3 溶液的配制

DPPH溶液的配制：參考胡瀟文[12]的方法，準(zhǔn)確稱(chēng)取0.025 6 g DPPH粉末，用無(wú)水乙醇充分溶解后轉(zhuǎn)移入100 mL棕色容量瓶，定容后成功制得濃度為6.49×10-4mol/L的DPPH儲(chǔ)備液，低溫貯藏。使用時(shí)用無(wú)水乙醇稀釋10倍。

ABTS儲(chǔ)備液：參考李亞會(huì)等[13]的方法，將2.6 mmol/L過(guò)硫酸鉀溶液與7.4 mmol/LABTS溶液等體積混合，避光冷藏24 h后使用，現(xiàn)用現(xiàn)稀釋?zhuān)♂屢何舛葹?.70±0.020。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 工藝流程

青楷槭莖皮→粉碎→過(guò)篩→乙醇浸提→抽濾→旋蒸→真空冷凍干燥→單因素試驗(yàn)→測(cè)定總酚含量→正交試驗(yàn)→優(yōu)化青楷槭莖皮醇提條件→抗氧化測(cè)定

1.2.2 青楷槭莖皮乙醇提取物的制備

將青楷槭莖皮粉碎，過(guò)孔徑0.250 mm篩，取50 g青楷槭莖皮粉末按不同料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、浸泡時(shí)間進(jìn)行提取，將浸泡后的樣品經(jīng)過(guò)濾后60 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得到濃縮液。再將濃縮液倒入培養(yǎng)皿中，用保鮮膜密封好以免受到污染，并放入-80 ℃冰箱冷凍24 h后進(jìn)行冷凍干燥，最終得到青楷槭莖皮乙醇提取物。

1.2.3 沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的繪制

采用Folin-Ciocalteu法[14]進(jìn)行測(cè)定，以沒(méi)食子酸作為標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行定量。

標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)：準(zhǔn)確稱(chēng)取0.110±0.001 g一水合沒(méi)食子酸，用無(wú)水乙醇溶解到100 mL容量瓶中，分別吸取0，1.0，2.0，3.0，4.0和5.0 mL上述標(biāo)準(zhǔn)溶液到100 mL的容量瓶中，分別得到質(zhì)量濃度為0，10，20，30，40和50 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

分別移取1.0 mL沒(méi)食子酸工作液于10 mL比色管中，分別加5 mL水、1 mL福林酚試劑、3 mL 7.5% Na2CO3溶液，搖勻后避光顯色2 h。在765 nm波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光度。以濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

1.2.4 青楷槭莖皮乙醇提取物總酚含量的測(cè)定

取1 mL樣品稀釋液，加入5 mL的蒸餾水，加入1 mL福林試劑和3 mL 7.5%的Na2CO3溶液，避光顯色2 h。在765 nm波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光度，利用曲線(xiàn)計(jì)算其含量?？偡雍浚é蘥/mg）按式（1）計(jì)算。

式中：ρ為多酚的質(zhì)量濃度，μg/mL；V為溶液總體積，mL；N為稀釋倍數(shù)；m為醇提物質(zhì)量，mg。

1.2.5 單因素試驗(yàn)

以總酚浸提含量作為主要測(cè)量指標(biāo)，以乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、浸泡時(shí)間三個(gè)因素為影響因素進(jìn)行單因素試驗(yàn)。

1.2.5.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)青楷槭莖皮醇提物總酚含量影響

準(zhǔn)確稱(chēng)取50 g青楷槭莖皮粉末，在料液比1∶10（g/mL）、不同體積分?jǐn)?shù)乙醇溶液（60%，65%，70%，75%和80%）、浸泡時(shí)間24 h的條件下進(jìn)行提取，研究不同乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)青楷槭莖皮總酚浸提量的影響。

1.2.5.2 料液比對(duì)青楷槭莖皮醇提物總酚含量影響

準(zhǔn)確稱(chēng)取50 g青楷槭莖皮粉末，在乙醇體積分?jǐn)?shù)70%、浸泡時(shí)間24 h、不同料液比（1∶5，1∶10，1∶15，1∶20，和1∶25 g/mL）的反應(yīng)條件下對(duì)其進(jìn)行提取，研究不同料液比對(duì)青楷槭莖皮總酚浸提量的影響。

1.2.5.3 浸泡時(shí)間對(duì)青楷槭莖皮醇提物總酚含量影響

準(zhǔn)確稱(chēng)取50 g青楷槭莖皮粉末，在乙醇體積分?jǐn)?shù)70%、料液比1∶10（g/mL）、不同浸泡時(shí)間（6，12，18和24 h）的反應(yīng)條件下對(duì)其進(jìn)行提取，研究不同浸泡時(shí)間對(duì)青楷槭莖皮總酚浸提量的影響。

1.2.6 正交試驗(yàn)

以乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、浸泡時(shí)間為因素，總酚浸提含量為指標(biāo)，選擇三因素三水平正交試驗(yàn)，對(duì)其中的工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化和設(shè)計(jì)。

表1 因素及水平表

1.2.7 抗氧化試驗(yàn)

依據(jù)正交試驗(yàn)得出的結(jié)果，對(duì)其設(shè)計(jì)體外抗氧化試驗(yàn)來(lái)測(cè)定青楷槭莖皮醇提物的抗氧化性。

1.2.7.1 青楷槭莖皮乙醇提物對(duì)DPPH·的清除能力

準(zhǔn)確吸取0.1 mL不同質(zhì)量濃度5，10，50和100 μg/mL的樣品溶液于比色皿中，再加入2.9 mL DPPH標(biāo)準(zhǔn)溶液，充分搖勻，避光條件下靜置30 min，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定其在517 nm處的吸光度。樣品+乙醇組用無(wú)水乙醇代替樣品溶液，DPPH+乙醇組用無(wú)水乙醇代替DPPH，對(duì)照組用BHA溶液代替樣品溶液，以上三組其他操作不變，分別測(cè)定吸光度。DPPH·清除率按式（2）計(jì)算。

式中：Ai為樣品+DPPH溶液的吸光度；Aj為樣品+無(wú)水乙醇的吸光度；Ac為DPPH+無(wú)水乙醇的吸光度。

1.2.7.2 青楷槭莖皮乙醇提物對(duì)ABTS+·的清除能力

取0.4 mL樣品醇提液，加入3.6 mL ABTS儲(chǔ)備液，避光放置10 min，在734 nm處測(cè)定吸光度。對(duì)照樣品用無(wú)水乙醇代替ABTS溶液，空白樣品用無(wú)水乙醇代替樣品醇提液。ABTS+·清除率按式（3）計(jì)算。

式中：A0為空白組測(cè)得的吸光度；A1為試驗(yàn)組測(cè)得的吸光度。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)方差”統(tǒng)計(jì)于Excel中，采用SPSS 26.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

橫坐標(biāo)為沒(méi)食子酸濃度，縱坐標(biāo)為765 nm處的吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)回歸方程：y= 0.012 8x+0.011 3，R2=0.998 2。

圖1 沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

2.1.2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)青楷槭莖皮醇提物總酚含量影響

由圖2可知，青楷槭莖皮醇提物總酚含量隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大呈現(xiàn)先上升后下降最終趨于平穩(wěn)的趨勢(shì)。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%~70%時(shí)提取物總酚含量逐步增加，70%時(shí)總酚含量達(dá)到最大值410.7 μg/mg，顯著高于其他乙醇體積分?jǐn)?shù)（P＜0.05）。在乙醇體積分?jǐn)?shù)70%~75%時(shí)，總酚含量有所下降。體積分?jǐn)?shù)為75%~80%時(shí)，總酚含量無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。一方面可能是由于溶液的介質(zhì)常數(shù)隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的不斷增加而減少，傳質(zhì)所需的能量減少，溶質(zhì)分子更易進(jìn)入溶劑，且提高了溶液極性和多酚化合物極性相似率，多酚化合物的水溶解性提高。另外，由于植物細(xì)胞遇水迅速膨脹，也增加了材料和溶液的接觸面積，容易被水破壞。同時(shí)，由于多酚的活性官能團(tuán)中羥基較易和水結(jié)合形成氫鍵作用，而其他基團(tuán)則既可溶于水中也能被酒精萃取。所以，適當(dāng)比例水的存在也有助于提高目標(biāo)物質(zhì)提取效率[15-17]。綜上所述，選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，70%和80%作為正交試驗(yàn)中乙醇體積分?jǐn)?shù)的因素水平。

圖2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)青楷槭莖皮醇提物總酚含量的影響

2.1.3 料液比對(duì)青楷槭莖皮醇提物總酚含量影響

由圖3可知，青楷槭莖皮醇提物總酚含量隨液體占比的增大先升高后下降。在料液比為1∶5~1∶10（g/mL）時(shí)醇提物總酚含量逐漸增加，并在料液比為1∶10（g/mL）時(shí)達(dá)到最大值，總酚含量為410.7 μg/mg顯著高于其他料液比（P＜0.05）。隨著液體占比的繼續(xù)增加，總酚的提取量逐漸下降。溶劑量的增加增大了料液接觸面積、溶液傳質(zhì)推動(dòng)力以及濃度梯度，利于酚類(lèi)物質(zhì)溶出；但當(dāng)溶劑量過(guò)大，物料吸附溶劑的量也隨之變大，從而導(dǎo)致酚類(lèi)物質(zhì)被物料吸附而不易溶出，不僅造成了浪費(fèi)且增大了后續(xù)回收難度[18]。綜上所述，料液比在1∶10（g/mL）時(shí)，青楷槭莖皮醇提物總酚含量最高，從節(jié)省溶劑消耗，降低提取成本角度考慮，選擇1∶5，1∶10和1∶15（g/mL）的料液比作為正交試驗(yàn)中料液比的因素水平。

圖3 料液比對(duì)青楷槭莖皮醇提物總酚含量的影響

2.1.4 浸泡時(shí)間對(duì)青楷槭莖皮醇提物總酚含量影響

由圖4可知，青楷槭莖皮醇提物總酚含量隨著浸泡時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì)，浸泡時(shí)間為12 h時(shí)總酚提取含量為415.4 μg/mg，顯著高于其他浸泡時(shí)間（P＜0.05）。開(kāi)始時(shí)隨著浸泡時(shí)間變長(zhǎng)，青楷槭莖皮總酚物質(zhì)不斷被溶出，當(dāng)達(dá)到一定時(shí)間后，青楷槭莖皮中總酚物質(zhì)被基本溶出，即使再增加提取時(shí)間也不能達(dá)到明顯的提取效果。隨著時(shí)間的繼續(xù)進(jìn)行，有些酚類(lèi)物質(zhì)可能出現(xiàn)降解、縮合、氧化等反應(yīng)，導(dǎo)致總酚得率的下降[19]。因此綜合考慮，選擇6，12和18 h的浸泡時(shí)間作為正交試驗(yàn)中浸泡時(shí)間的因素水平。

圖4 浸泡時(shí)間對(duì)青楷槭莖皮醇提物總酚含量的影響

2.2 正交試驗(yàn)優(yōu)化青楷槭莖皮醇提總酚含量結(jié)果

2.2.1 正交試驗(yàn)方法與結(jié)果

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以料液比、乙醇體積分?jǐn)?shù)、浸泡時(shí)間為主要的影響因素，每個(gè)因素分別考察3個(gè)水平，選用1.2.6小節(jié)因素及水平表安排試驗(yàn)。

采用正交試驗(yàn)對(duì)青楷槭莖皮乙醇浸提總酚含量的條件及相關(guān)主要因素進(jìn)行綜合優(yōu)化，以紫外分光光度計(jì)測(cè)定的吸光度計(jì)算總酚含量，考察乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、浸泡時(shí)間的綜合正交影響，設(shè)計(jì)了三因素三水平正交試驗(yàn)，試驗(yàn)研究結(jié)果及方差分析可參考表2和表3。

表2 正交試驗(yàn)及結(jié)果

表3 方差分析

由表2可知，根據(jù)直觀分析法中極差的大小，對(duì)因素進(jìn)行主次排序，次序?yàn)锽＞A＞C，即乙醇體積分?jǐn)?shù)＞料液比＞浸泡時(shí)間，最優(yōu)組合為A2B1C1，即料液比1∶10（g/mL）、乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、浸泡時(shí)間6 h。

2.2.2 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

按試驗(yàn)組（A2B1C1）組合的乙醇提取條件與對(duì)照組（A2B2C3）進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。

由表4可知，在料液比1∶10（g/mL）、乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、浸泡時(shí)間6 h條件下，試驗(yàn)組比對(duì)照組總酚含量提高了15.80%。

表4 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

2.3 抗氧化試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 青楷槭莖皮乙醇提物對(duì)DPPH·的清除效果

由圖5可知，在測(cè)定濃度范圍內(nèi)，陽(yáng)性對(duì)照BHA和青楷槭莖皮乙醇提取物均隨樣品濃度增加而增加。當(dāng)質(zhì)量濃度為500 μg/mL時(shí)，青楷槭莖皮醇提物對(duì)DPPH·清除率為89.26%，顯著高于BHA對(duì)DPPH·清除率60.01%（P＜0.05），與薄采穎等[20]提取的松樹(shù)皮多酚清除DPPH·自由基活性趨勢(shì)一致。因此青楷槭莖皮乙醇提取物的DPPH· 清除率與提取物濃度之間存在良好的量效關(guān)系且高濃度條件下抗氧化能力較強(qiáng)[21]。

圖5 青楷槭莖皮乙醇提取物與BHA清除DPPH·能力對(duì)比

2.3.2 青楷槭莖皮乙醇提物對(duì)ABTS+·的清除效果

由圖6可知，在測(cè)定濃度范圍內(nèi)，青楷槭莖皮乙醇提取物對(duì)ABTS+·的清除率與BHA接近均隨濃度增大而增強(qiáng)。當(dāng)質(zhì)量濃度超過(guò)50 μg/mL時(shí)，BHA對(duì)ABTS+·的清除率達(dá)到93.19%，高于青楷槭莖皮乙醇提取物對(duì)ABTS+·的清除率（最高清除率為92.28%）但并無(wú)顯著性差異（P＞0.05），與戴妙妙[22]研究的紫娟茶中花青素提取物對(duì)ABTS+·陽(yáng)離子自由基的能力趨勢(shì)一致。說(shuō)明青楷槭莖皮乙醇提取物有著較強(qiáng)的ABTS+·清除能力，且在較高濃度下的抗氧化能力更為可觀。

圖6 青楷槭莖皮乙醇提取物與BHA清除ABTS+·能力對(duì)比

3 結(jié)論

試驗(yàn)采用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)兩種方法優(yōu)化得到最佳工藝：料液比1∶10（g/mL）、乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、浸泡時(shí)間6 h，此時(shí)總酚含量為577.8 μg/mg。最優(yōu)提取條件下的青楷槭莖皮醇提物具有良好的抗氧化能力和對(duì)DPPH自由基、ABTS自由基的清除能力。試驗(yàn)為進(jìn)一步分離青楷槭莖皮生物活性成分、豐富槭樹(shù)科的利用價(jià)值、開(kāi)發(fā)利用青楷槭資源提供理論依據(jù)。