蔣德旗,莫杰梅,蔣麗林,臧青民,徐蘭程,陳曉白
玉林師范學(xué)院生物與制藥學(xué)院,廣西高校亞熱帶生物資源保護(hù)與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣西農(nóng)產(chǎn)資源化學(xué)與生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(玉林 537000)
莪術(shù)為姜科植物蓬莪術(shù)、廣西莪術(shù)或溫郁金的干燥根莖,在我國(guó)主產(chǎn)于廣西、云南等地,其功效包括行氣破血、消積止痛等[1]。莪術(shù)有效成分主要包括揮發(fā)油、姜黃素和多糖類,其中揮發(fā)油含量較多,揮發(fā)油藥用活性成分為莪術(shù)醇、β-欖香烯、莪術(shù)酮等萜類化合物[2],已被制成多種劑型,如莪術(shù)油注射液、栓劑、軟膏等,臨床用于抗病毒、抗菌消炎,具有較好療效。此外,莪術(shù)還有抗腫瘤、抗氧化、抗血小板聚集等多種藥理活性[2-3]。目前莪術(shù)揮發(fā)油提取主要采用水蒸氣蒸餾、微波或超聲輔助提取、索氏提取、超臨界提取等方法[4-5],這些方法存在提取率低、提取時(shí)間過(guò)長(zhǎng)、需要大型設(shè)備等不足。纖維素酶可通過(guò)降解纖維素,破壞植物細(xì)胞壁,促進(jìn)胞內(nèi)活性成分有效溶出,提高提取率,已被用于當(dāng)歸、茴香揮發(fā)油提取[6-7]。研究使用纖維素酶預(yù)處理輔助提取莪術(shù)揮發(fā)油,優(yōu)化其提取工藝并探究體外抗氧化活性,以期將莪術(shù)揮發(fā)油進(jìn)一步開(kāi)發(fā)為食品保鮮劑或保健品添加劑提供更多試驗(yàn)證據(jù)。
莪術(shù)購(gòu)自廣西玉林中藥港,經(jīng)玉林師范學(xué)院陳曉白教授鑒定為姜黃屬植物廣西莪術(shù)(Curcuma kwangsiensis)的干燥根莖;纖維素酶(5萬(wàn) U/g,北京索萊寶科技有限公司);1, 1-二苯基-2-苦肼基自由基(DPPH,上海阿拉丁生化科技股份有限公司);L-抗壞血酸分析標(biāo)準(zhǔn)品(上海麥克林生化科技有限公司);檸檬酸、檸檬酸鈉、硫酸亞鐵、水楊酸、過(guò)氧化氫、無(wú)水硫酸鈉、石油醚(國(guó)產(chǎn)分析純,西隴化工股份有限公司)。
FW135中藥粉碎機(jī)(天津市泰斯特儀器);5 mL揮發(fā)油提取測(cè)定器(江蘇三愛(ài)思儀器設(shè)備);98-I-B磁力攪拌電熱套(菲斯福儀器);RV-211A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海一恒科學(xué)儀器);SHY-2A水浴恒溫振蕩器(常州國(guó)宇儀器);FA1004B電子分析天平(上海佑科儀器儀表);PHSJ-6L pH計(jì)(上海儀電科學(xué)儀器);TU-1901紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(北京普析通用儀器)。
粉碎廣西莪術(shù),過(guò)0.425 mm篩,準(zhǔn)確稱取50 g放入1 000 mL圓底燒瓶中,加10倍量蒸餾水室溫浸泡12 h后,經(jīng)水蒸氣蒸餾4 h。蒸餾液加石油醚作為萃取劑,萃取相加無(wú)水硫酸鈉靜置脫水,采用減壓旋蒸法去除石油醚,得到廣西莪術(shù)揮發(fā)油,精密稱定質(zhì)量。揮發(fā)油得率=揮發(fā)油質(zhì)量/莪術(shù)質(zhì)量×100%。
準(zhǔn)確稱取50 g過(guò)0.425 mm篩的莪術(shù)粉末,按料液比1∶10 g/mL加入蒸餾水,添加一定量的纖維素酶(0.5%,1.0%,1.5%,2.0%和2.5%),調(diào)節(jié)pH(4.0,4.4,4.8,5.2和5.6),分別在不同溫度下(40,45,50,55和60 ℃)酶解處理一定時(shí)間(0.5,1.5,2.5,3.5和4.5 h)。單因素試驗(yàn)優(yōu)化某一條件時(shí),其他因素固定值分別為酶添加量1.5%、酶解pH 4.8、酶解溫度50 ℃、酶解時(shí)間2.5 h,搖床速度為120 r/min。纖維素酶預(yù)處理完畢后,再按照2.1小節(jié)方法提取揮發(fā)油。
根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果,以酶添加量、酶解pH及酶解時(shí)間為自變量,揮發(fā)油得率為響應(yīng)值,利用Box- Behnken響應(yīng)面法對(duì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)化,設(shè)計(jì)三因素三水平,見(jiàn)表1。數(shù)據(jù)分析使用Design Expert Version 13.01.0軟件。
表1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)的因素與水平
莪術(shù)揮發(fā)油體外抗氧化活性檢測(cè)及自由基清除率計(jì)算均參照黃培池[8]的研究方法進(jìn)行。樣品溶液檢測(cè)前使用無(wú)水乙醇配成0.2,0.4,0.6,0.8,1.0和1.2 mg/mL不同質(zhì)量濃度的系列溶液。DPPH清除能力檢測(cè):2 mL樣品溶液與2 mL 0.1 mmol/mL的DPPH溶液充分混勻,避光靜置30 min后檢測(cè)其在517 nm波長(zhǎng)處的吸光度。羥自由基清楚能力檢測(cè):1 mL樣品溶液與2 mL 6 mmol/L的FeSO4溶液、2 mL 6 mmol/L的H2O2溶液充分混勻后靜置10 min,再向混合溶液中加入2 mL 6 mmol/L的水楊酸乙醇溶液,在50 ℃水浴30 min后檢測(cè)其在510 nm波長(zhǎng)處的吸光度。以等體積相同濃度抗壞血酸溶液代替樣品溶液作為陽(yáng)性對(duì)照。
隨著酶添加量的增大,莪術(shù)揮發(fā)油得率提高,當(dāng)酶添加量達(dá)到1.5%時(shí),得率為4.53%,再進(jìn)一步添加纖維素酶,得率并沒(méi)有顯著變化,說(shuō)明此時(shí)酶已達(dá)到飽和狀態(tài)。故選擇1.5%為最適酶添加量,見(jiàn)圖1。
溫度過(guò)高或過(guò)低,都不利于酶活性的發(fā)揮,纖維素酶輔助提取莪術(shù)揮發(fā)油的最適溫度為50 ℃,此時(shí)得率達(dá)到最大值4.48%,見(jiàn)圖2。
隨著pH增大,莪術(shù)揮發(fā)油得率提高,當(dāng)pH為4.8時(shí),得率達(dá)到最大值4.76%,再進(jìn)一步提高pH,得率反而減小。故選擇pH 4.8為最佳酶解pH,見(jiàn)圖3。
隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng),莪術(shù)揮發(fā)油得率變大,當(dāng)酶解時(shí)間為2.5 h時(shí),得率達(dá)到4.26%,之后得率增幅很小,考慮到實(shí)際生產(chǎn)效率,故選擇2.5 h為最佳酶解時(shí)間,見(jiàn)圖4。
圖4 酶解時(shí)間對(duì)莪術(shù)揮發(fā)油得率的影響
試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2,方差分析結(jié)果見(jiàn)表3。通過(guò)回歸擬合,獲得莪術(shù)揮發(fā)油得率(Y)與自變量(酶添加量、酶解pH、酶解時(shí)間)的二次多項(xiàng)回歸方程:Y= -76.98+11.50A+34.93B-6.80C+0.75AB-0.18AC+4.04BC-4.51A2-4.88B2-2.65C2?;貧w方程模型P<0.000 1,失擬項(xiàng)不顯著(P=0.476 1),模型總決定系數(shù)R2=0.990 7,調(diào)整后Radj2=0.978 7,變異系數(shù)(C.V.)為3.03%,以上參數(shù)均說(shuō)明該模型與試驗(yàn)數(shù)據(jù)擬合程度好,試驗(yàn)誤差小,可用于不同變量條件下的響應(yīng)值預(yù)測(cè)。三個(gè)因素對(duì)莪術(shù)揮發(fā)油酶法輔助提取的影響均非常顯著(P<0.01),其中酶解時(shí)間(C)影響最大,酶添加量(A)次之,酶解pH(B)影響最小。表3和圖5結(jié)果表明,BC間交互作用對(duì)酶法輔助提取莪術(shù)揮發(fā)油的影響非常顯著(P<0.01),AB和AC間交互作用則對(duì)揮發(fā)油得率的影響不顯著(P>0.05)。
表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果
表3 方差分析結(jié)果
通過(guò)求解回歸模型方程,得到莪術(shù)揮發(fā)油纖維素酶提取的最佳工藝:酶添加量1.6%、酶解pH 4.6、酶解時(shí)間2.1 h,在此條件下?lián)]發(fā)油得率的理論值為5.29%。根據(jù)此工藝進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn),獲得的揮發(fā)油得率均值為5.24%±0.31%,與理論值相對(duì)誤差為0.95%,說(shuō)明回歸模型有效可靠。纖維素酶輔助提取的揮發(fā)油得率顯著高于單獨(dú)水蒸氣蒸餾法獲得的得率2.17%±0.46%,纖維素酶輔助提取莪術(shù)揮發(fā)油工藝具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。
如圖6和圖7所示,莪術(shù)揮發(fā)油的DPPH自由基和羥自由基清除率均隨著質(zhì)量濃度的增加而明顯增大,當(dāng)揮發(fā)油質(zhì)量濃度為1.2 mg/mL時(shí),DPPH自由基清除率達(dá)到82.75%,羥自由基清除率為72.94%。莪術(shù)揮發(fā)油對(duì)DPPH自由基和羥自由基的半數(shù)抑制質(zhì)量濃度分別為0.783和0.814 mg/mL。結(jié)果表明莪術(shù)揮發(fā)油對(duì)DPPH自由基和羥自由基均有一定的清除作用,但其體外抗氧化活性弱于抗壞血酸。
圖6 莪術(shù)揮發(fā)油對(duì)DPPH自由基的清除作用
研究通過(guò)單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)獲得了纖維素酶輔助提取莪術(shù)揮發(fā)油的最佳工藝:酶添加量1.6%,酶解pH為4.6,酶解時(shí)間2.1 h,酶解溫度50 ℃,料液比1∶10 mL/g。在此條件下獲得的揮發(fā)油得率為5.24%,與理論預(yù)測(cè)值5.29%相對(duì)誤差小于5%,說(shuō)明回歸模型有效可靠。纖維素酶輔助提取法的揮發(fā)油得率顯著高于單純水蒸氣蒸餾法的得率2.17%。趙海燕等[4,9]分別使用微波、超聲輔助提取法獲得廣西莪術(shù)揮發(fā)油的提取率,結(jié)果分別為5.18%和4.35%。蔡吉祥等[5]采用響應(yīng)面試驗(yàn)對(duì)微波輔助提取蓬莪術(shù)油的工藝進(jìn)行優(yōu)化,獲得的蓬莪術(shù)油得率為4.68%。羅莎等[10]研究發(fā)現(xiàn)超聲波前處理-微波法提取溫莪術(shù)的揮發(fā)油得率可達(dá)4.71%,高于超臨界CO2萃取和水蒸氣蒸餾法的4.47%和2.53%。祝冬青等[11]采用水蒸氣蒸餾法獲得莪術(shù)油的得率為2.40%。研究采用纖維素酶輔助提取,揮發(fā)油得率高于上述文獻(xiàn)使用的方法,值得進(jìn)一步研究推廣。
研究表明,天然植物如花椒籽、落新婦揮發(fā)油對(duì)DPPH和羥自由基具有較強(qiáng)的清除活性,可作為潛在的天然抗氧化劑進(jìn)行開(kāi)發(fā)利用[12-13]。研究也發(fā)現(xiàn),莪術(shù)揮發(fā)油對(duì)DPPH和羥自由基具有較強(qiáng)的清除作用,對(duì)DPPH和羥自由基的半數(shù)抑制質(zhì)量濃度分別為0.783和0.814 mg/mL,這一點(diǎn)與前期文獻(xiàn)結(jié)論一致[4,9]。研究通過(guò)優(yōu)化莪術(shù)揮發(fā)油的纖維素酶輔助提取工藝,為莪術(shù)揮發(fā)油產(chǎn)品的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)提供一定的理論基礎(chǔ),莪術(shù)揮發(fā)油的抗氧化活性研究,對(duì)于開(kāi)發(fā)天然來(lái)源的美白化妝品、食品抗氧化劑和保鮮劑有一定的指導(dǎo)作用。