耐硼賴(lài)氨酸芽孢桿菌的保護(hù)劑篩選及其對(duì)羅非魚(yú)腸道微生物群落的影響

陳欽鎮(zhèn)，李飛航，武浩恒，林向民，王樹(shù)啟，陳家林，劉 柱

（1.海南大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，?？?570228; 2.海南大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，?？?570228; 3.福建農(nóng)林大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，福州 350001; 4.汕頭大學(xué) 理學(xué)院，廣東 汕頭 515063; 5.廣東海大集團(tuán)股份有限公司，廣州 510700）

近年來(lái)，隨著魚(yú)類(lèi)需求量增加和水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)不斷擴(kuò)大，魚(yú)類(lèi)疾病也在威脅著養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。集約化生產(chǎn)模式和抗生素的濫用使得魚(yú)類(lèi)疾病難以得到有效的預(yù)防和控制，且抗生素的濫用容易產(chǎn)生負(fù)面影響，如水產(chǎn)養(yǎng)殖系統(tǒng)中抗生素抗性基因（ARGs）的轉(zhuǎn)移[1]和耐藥細(xì)菌的出現(xiàn)；它們對(duì)大多數(shù)水生生物具有一定毒性，易殘留且對(duì)生態(tài)環(huán)境造成破壞[2]。尋找和研發(fā)抗生素的替代飼料添加劑是目前水產(chǎn)養(yǎng)殖中亟待解決的重大問(wèn)題。益生菌是一種已被確定的抗生素替代品。聯(lián)合國(guó)糧食及農(nóng)業(yè)組織 (FAO) 和世界衛(wèi)生組織（WHO）將益生菌定義為當(dāng)在動(dòng)物體內(nèi)定植一定數(shù)量后對(duì)機(jī)體產(chǎn)生有益影響的活性微生物[3]。胃腸道是一個(gè)復(fù)雜的環(huán)境，有不同的微生物群落聚集，益生菌可以影響腸道微生物群落，減少疾病的發(fā)生[4]，如細(xì)菌數(shù)量增加、多樣性減少會(huì)引起腸道微生物生態(tài)失調(diào)，導(dǎo)致疾病。動(dòng)物機(jī)體的免疫也與微生物的組成密切相關(guān)[5]。

國(guó)內(nèi)外都有許多關(guān)于益生菌對(duì)魚(yú)類(lèi)腸道菌群影響的報(bào)道，益生菌能夠調(diào)節(jié)腸道微生物組成，改善腸道健康[6]。廖慶釗等[7]在羅非魚(yú)飼料中添加乙醇假絲酵母，結(jié)果表明，投喂乙醇假絲酵母后,羅非魚(yú)腸道中梭桿菌門(mén)、鯨桿菌屬和艾克曼菌屬等有益菌群的豐度顯著上調(diào)，藍(lán)細(xì)菌門(mén)豐度減少。Hongqin 等[8]研究結(jié)果表明，在飼料中添加1×105CFU·g-1的丁酸梭菌增加了羅非魚(yú)腸道菌群的多樣性和有益菌（如芽孢桿菌）的相對(duì)豐度，降低了條件致病菌（如氣單胞菌）的相對(duì)豐度。在大黃魚(yú)幼魚(yú)的飼料中添加丁酸梭菌，改變了大黃魚(yú)幼魚(yú)腸道微生物群結(jié)構(gòu)，降低了腸道微生物多樣性；添加丁酸梭菌可有效提高大黃魚(yú)幼魚(yú)腸道中丁酸梭菌的豐度，降低大黃魚(yú)幼魚(yú)腸道中一些潛在致病菌的豐度，對(duì)大黃魚(yú)的生長(zhǎng)起到促進(jìn)作用。Goncalves 等[9]在虹鱒魚(yú)基礎(chǔ)日糧中添加益生菌，飼喂7 d 后，其腸道微生物多樣性增加，厚壁菌門(mén)和梭桿菌門(mén)豐度增加，這兩個(gè)門(mén)的成員具有有益的作用，而變形菌門(mén)豐度降低。

如何讓益生菌在使用過(guò)程中長(zhǎng)久發(fā)揮作用是目前研究的重要關(guān)注點(diǎn)。冷凍干燥是生產(chǎn)干燥菌粉的經(jīng)典方法，干燥過(guò)程在真空、低溫下進(jìn)行，從而減少了熱降解[10]。該方法通過(guò)冷凍含有細(xì)胞的水溶液并干燥，通過(guò)升華去除水分，但益生菌可能由于冰晶的形成、高滲透壓導(dǎo)致的膜損傷、DNA 變性和水分蒸發(fā)而損壞細(xì)胞[11]，因此，為了保護(hù)益生菌在脫水過(guò)程中不被破壞，在冷凍干燥前添加干燥介質(zhì)作為保護(hù)劑[12]。添加保護(hù)劑可以提高益生菌在冷凍干燥和儲(chǔ)存過(guò)程中的穩(wěn)定性[13]。保護(hù)劑在冷凍干燥過(guò)程中極為重要，本研究選定脫脂奶粉、海藻糖、乳糖和蔗糖4 種常見(jiàn)保護(hù)劑進(jìn)行篩選，旨在獲得最適合耐硼賴(lài)氨酸芽孢桿菌（Lysinibacillus boronitolerans，YS11）冷凍干燥的保護(hù)劑。目前YS11 對(duì)羅非魚(yú)腸道微生物菌群的影響尚不清楚，因此，本研究探究YS11 對(duì)羅非魚(yú)幼魚(yú)腸道微生物菌群的影響，為羅非魚(yú)養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)益生菌使用和病原菌防治提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物羅非魚(yú)作為實(shí)驗(yàn)用魚(yú)，魚(yú)苗購(gòu)自海南寶路水產(chǎn)科技有限公司文筆峰養(yǎng)殖基地，共250 尾，初始平均體質(zhì)量為（1.11±0.26）g。養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)在海南省海南大學(xué)實(shí)驗(yàn)室的玻璃缸（30 cm×30 cm×80 cm）中完成。魚(yú)預(yù)先在實(shí)驗(yàn)室環(huán)境養(yǎng)殖2 周，250 尾魚(yú)分5 缸，每缸各有50 尾。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中使用無(wú)氯自來(lái)水（自來(lái)水靜置過(guò)夜以去除余氯）。

1.2 耐硼賴(lài)氨酸芽孢桿菌的保存和培養(yǎng)將實(shí)驗(yàn)室篩選到的耐硼賴(lài)氨酸芽孢桿菌16S rDNA 數(shù)據(jù)放入NCBI 中比對(duì)，發(fā)現(xiàn)與YS11 有99.83%的相似度。耐硼賴(lài)氨酸芽孢桿菌與甘油混合保存于-80 ℃冰箱。菌種復(fù)蘇使用1% 的菌體接種，采用LB 液體培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，用分光光度計(jì)在600 nm 處的吸光度測(cè)定菌液濃度。

1.3 保護(hù)劑制備保護(hù)劑為5%蔗糖、10%蔗糖、5%海藻糖、10%海藻糖、10%乳糖、20%乳糖、10%脫脂奶粉、20%脫脂奶粉，以1%蛋白胨作為對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)中使用的保護(hù)劑均使用無(wú)菌蒸餾水溶解，在115 ℃下滅菌15 min。

1.4 真空冷凍干燥取1% YS11 接種于LB 液體培養(yǎng)基中，過(guò)夜培養(yǎng)16 h，取108CFU·L-1的菌體，8 350 r·min-1，離心15 min，PBS 緩沖液洗滌重懸，離心棄上清，分別與1 mL 保護(hù)劑混合菌懸液，置于10 mL 離心管中，防止由于真空條件下液體溢出。先放置于-20 ℃冰箱，預(yù)冷12～24 h，再放入-80 ℃冰箱，放置5 h，再放入真空干燥機(jī)，-55 ℃，0.061 mar，干燥18 h。凍干粉制備完成后，存儲(chǔ)于4 ℃。

凍干粉復(fù)蘇：取凍干前同等溶液體積的PBS緩沖液重懸凍干粉。室溫靜置15 min，取100 μL菌懸液稀釋涂板，并計(jì)算存活率。

細(xì)菌存活率=凍干后活菌數(shù) / 凍干前活菌數(shù) ×100。

1.5 實(shí)驗(yàn)配方與飼料制作以魚(yú)粉、豆粕為蛋白源，配菜粕、小麥、面粉、磷酸二氫鈣、維生素A、維生素D3、維生素E、煙酰胺、D-泛酸鈣、硫酸亞鐵、硫酸錳、硫酸鋅、硫酸銅等，制成42%粗蛋白及6%粗脂肪的基礎(chǔ)飼料。在基礎(chǔ)飼料中分別添加YS11、發(fā)酵液上清、YS11 加發(fā)酵液上清制備成3 種實(shí)驗(yàn)飼料，分別記為YS11 組、FB 組和FLF 組，其中含有耐硼賴(lài)氨酸芽孢桿菌有效活菌數(shù)為107CFU·g-1。在基礎(chǔ)飼料中添加LB 液體培養(yǎng)基作為陰性對(duì)照組（LB 組），以投喂不添加益生菌的基礎(chǔ)飼料為空白對(duì)照組（Control）。飼料質(zhì)量與液體配比（w/v）為10∶3。每天配制新鮮飼料，保存于4 ℃冰箱，飼喂前先取出放置至室溫再飼喂。1 d 飼喂2 次，日投喂量為魚(yú)體質(zhì)量的7%～10%，分別為上午9：00 與下午4：00，每天排出50%原有的水，加入新鮮的水，并清理干凈羅非魚(yú)的糞便，飼喂周期為70 d。

1.6 樣品采集在飼喂70 d 后，分別在5 組中隨機(jī)撈取3 尾羅非魚(yú)，置于預(yù)冷的解剖盤(pán)上，解剖取整段腸道，將組織表面血液和結(jié)締組織用預(yù)冷的PBS 緩沖液沖洗干凈，分裝于EP 管中，液氮速凍，-80 ℃冰箱保存，由北京百邁客生物科技有限公司進(jìn)行腸道微生物高通量測(cè)序。

1.7 數(shù)據(jù)分析SPSS 軟件分析保護(hù)劑配方優(yōu)化實(shí)驗(yàn)和羅非魚(yú)高通量測(cè)序方面的數(shù)據(jù) (SPSS Inc.,Chicago, IL, USA)。采用t檢驗(yàn)來(lái)檢測(cè)5%顯著性水平下的差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 保護(hù)劑對(duì)YS11 存活率的影響篩選最佳保護(hù)劑的濃度（表1），對(duì)照組對(duì)YS11 無(wú)法起到保護(hù)作用，凍干后存活菌數(shù)為（0.03±0.002 1）×108CFU·mL-1，存活率僅有0.19%，遠(yuǎn)小于其他凍干保護(hù)劑的存活率。與對(duì)照組相比，4 種保護(hù)劑均起到了保護(hù)細(xì)菌免受低溫凍傷的情況。不同濃度的保護(hù)劑對(duì)細(xì)菌起到的保護(hù)作用也不相同，對(duì)比2 個(gè)蔗糖濃度下的細(xì)菌存活率，10%蔗糖組的存活率為9.20%，而5%蔗糖組的存活率為5.86%。對(duì)比2 個(gè)海藻糖濃度下的細(xì)菌存活率，10%海藻糖組的存活率為11.48%，而5% 海藻糖組存活率為4.64%。對(duì)比2 個(gè)乳糖濃度下的細(xì)菌存活率，10%乳糖組的存活率為9.93%，而20% 乳糖組的存活率為6.84%。對(duì)比2 個(gè)脫脂奶粉濃度下的細(xì)菌存活率，10%脫脂奶粉組的存活率為11.16%，而20% 脫脂奶粉組的存活率為2.42%。通過(guò)保護(hù)劑篩選實(shí)驗(yàn)的優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)YS11在10%海藻糖的保護(hù)下，能夠在干燥后保持較高的存活率。

表1 保護(hù)劑對(duì)YS11 存活率的影響

2.2 YS11 對(duì)腸道微生物群的結(jié)構(gòu)變化的影響

從16S rDNA 基因的V3 V4 擴(kuò)增子中產(chǎn)生1 198 583 對(duì)Reads，雙端 Reads 質(zhì)控、拼接后共產(chǎn)生 1 195 379 條 Clean Reads，每個(gè)樣品至少產(chǎn)生79 369 條 Clean Reads ，平均產(chǎn)生79 692 條 Clean Reads。組裝的序列平均長(zhǎng)度為410 bp。截止97%的操作分類(lèi)單位聚類(lèi)產(chǎn)生了整個(gè)數(shù)據(jù)集的總共10 247 個(gè)操作分類(lèi)單位。用α多樣性和β多樣性對(duì)樣品內(nèi)部和樣品之間的微生物復(fù)雜性進(jìn)行分析。從維恩圖中顯示（圖1-A），Control 組、LB 組、YS11 組、FB 組、FLF 組 共 有 特 征 個(gè) 數(shù)680 個(gè)OTUs，YS11 組、FB 組、FLF 組 中 特 征 個(gè) 數(shù) 的OTUs 數(shù)量分別為6、3 和4。從稀釋性曲線中（圖1 -B），筆者發(fā)現(xiàn)15 個(gè)樣本中，YS11 組、FB 組、FLF 組微生物多樣性有相似的趨勢(shì)，接近飽和平臺(tái)，Control 組、LB 組微生物多樣性有相似的趨勢(shì)?；谡w群落組成的β多樣性分析而言，表明添加YS11 后，腸道微生物群的聚集相似程度較高。對(duì)10 247 個(gè)OTUs（按97%序列同一性分組）的UniFrac 主坐標(biāo)分析（PCoA）表明（圖1-C），對(duì)照組和處理組有明顯的分離，且對(duì)照最相同處理的樣品具有較高的分散性，處理組沒(méi)有顯示出與對(duì)照的單獨(dú)聚類(lèi)，3 個(gè)處理組出現(xiàn)較高的聚集。通過(guò)非加權(quán)組平均法（UPGMA）分析進(jìn)行樣品層次聚類(lèi)（圖1-D），YS11、FB、FLF 組的腸道微生物群結(jié)構(gòu)相似，聚集在較高的分支內(nèi)，而Control 組和LB 組與處理組不同，聚集在較低的分支內(nèi)。

圖1 腸道微生物群結(jié)構(gòu)變化

2.3 YS11 對(duì) 腸 道微生物組 的 分 類(lèi) 組 成 的 影 響

為了確定YS11 是如何影響羅非魚(yú)腸道微生物群落，在腸道微生物不同的分類(lèi)尺度上，比較3 組不同處理組的微生物群落差異。在門(mén)、屬、種水平上最豐富的細(xì)菌分類(lèi)群（前10 個(gè)）出現(xiàn)在所有魚(yú)類(lèi)腸道樣本中。在門(mén)水平上（圖2-A），羅非魚(yú)腸道內(nèi)變形桿菌門(mén)（Proteobacteria）、放線菌門(mén)（Actinobacteria）、厚壁菌門(mén)（Firmicutes）、梭桿菌門(mén)（Fusobacteria）構(gòu)成4 個(gè)最主要的細(xì)菌群落門(mén)，其中變形桿菌門(mén)在FB 組和FLF 組的相對(duì)豐度高于其他組，在FLF 組中厚壁菌門(mén)的相對(duì)豐度顯著高于其他組，其次是擬桿菌門(mén)（Bacteroidetes）、酸桿 菌 門(mén)（Acidobacteria）、疣 維 菌 門(mén)（Verrucomicrobia）、巴氏桿菌門(mén)（Patescibacteria）、軟壁菌門(mén)（Tenericutes）、綠彎菌門(mén)（Chloroflexi）。在屬水平上（圖2-B），羅非魚(yú)腸道內(nèi)非培養(yǎng)微桿菌科（uncultured bacterium Microbacteriaceae）、博斯氏菌 屬（Bosea）、非 培 養(yǎng) 根 瘤 菌 科（uncultured bacterium Rhizobiaceae）、鯨 蠟 桿 菌 屬（Cetobacterium）為主要細(xì)菌屬。在種水平上（圖2-C），羅非魚(yú)腸道內(nèi)非培養(yǎng)微桿菌科（uncultured bacterium Microbacteriaceae）、非培養(yǎng)博斯氏菌屬（uncultured bacteriumBosea）、非培養(yǎng)根瘤菌科（uncultured bacterium Rhizobiaceae）、非培養(yǎng)鯨蠟桿菌（uncultured bacteriumCetobacterium）為主要細(xì)菌種。

圖2 微生物群落分布分析

2.4 YS11 對(duì)腸道微生物菌群中益生菌和病原菌的影響為了檢測(cè)羅非魚(yú)腸道中病原菌和益生菌的變化，從腸道微生物屬水平菌群相對(duì)豐度數(shù)據(jù)中，計(jì)算有益菌和病原菌增加或者減少的讀數(shù)。結(jié)果顯示桿菌屬、梭菌屬在FLF 組與對(duì)照組相比中存在顯著差異，數(shù)量增加。放線菌屬、雙歧桿菌屬和乳桿菌屬無(wú)顯著差異（表2）。氣單胞菌屬和愛(ài)德華氏菌屬在對(duì)照組和處理組中均存在顯著差異，數(shù)量顯著減少，其中愛(ài)德華氏菌屬在處理組中的數(shù)據(jù)均降為0（表2）。

表2 YS11 對(duì)腸道微生物菌群中益生菌和病原菌增加或減少的讀數(shù) /條

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)在前人研究[14-20]的基礎(chǔ)上，采用海藻糖、蔗糖、脫脂奶粉和乳糖作為YS11 的保護(hù)劑，利用保護(hù)劑克服了由于低溫對(duì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞導(dǎo)致干燥后存活率低的影響，并篩選出最佳保護(hù)劑濃度，結(jié)果表明10%海藻糖在保護(hù)細(xì)菌免受冷凍干燥過(guò)程中的損傷較為出色，使細(xì)胞在冷凍干燥后仍具有較強(qiáng)的活性，且有利于長(zhǎng)期保存。

魚(yú)腸道內(nèi)環(huán)境復(fù)雜，由復(fù)雜多樣的微生物群組成，這些微生物相互作用，影響宿主的各種功能，包括營(yíng)養(yǎng)、消化發(fā)育、免疫和抗病能力[21]。本研究結(jié)果表明，通過(guò)在基礎(chǔ)飼料中添加YS11，可以調(diào)節(jié)羅非魚(yú)腸道微生物群向更有益的微生物群落發(fā)展。由稀釋性曲線、PCoA 分析和UPGMA分析可知，在OTU 水平上，3 個(gè)處理組與對(duì)照組間的微生物群落分布差異較大，對(duì)照組間差異較小，且對(duì)照組的多樣性減少，YS11 的菌體和發(fā)酵液對(duì)羅非魚(yú)腸道微生物群的影響較為相近，可以調(diào)節(jié)腸道微生物群的結(jié)構(gòu)，增加腸道微生物的多樣性和豐度，說(shuō)明YS11 對(duì)腸道微生物群發(fā)育起到積極作用。本研究結(jié)果與前人研究結(jié)果相同，即添加益生菌后，能夠從稀釋性曲線、PCoA 分析和UPGMA 分析中發(fā)現(xiàn)處理組和對(duì)照組中存在顯著差異。

Hongqin 等[8]在大黃魚(yú)幼魚(yú)期向飼料中添加丁酸梭菌，結(jié)果表明在處理組中，幼魚(yú)腸道中的微生物物種豐度下降，顯著提高丁酸梭菌屬的豐度，降低某些潛在病原菌的豐度。在門(mén)水平上，大黃魚(yú)腸道中以變形菌門(mén)、厚壁菌門(mén)和放線菌門(mén)為主要優(yōu)勢(shì)菌。在屬水平上，檢測(cè)到雷辛格氏菌、假單胞菌和不明梭狀芽孢桿菌為大黃魚(yú)腸道中的優(yōu)勢(shì)菌屬。在種水平上，耐冷假單胞菌、丁酸梭菌、糞產(chǎn)堿菌成為腸道菌群群落的優(yōu)勢(shì)種。Tan 等[22]研究報(bào)道，從尼羅羅非魚(yú)腸道中分離出的1 株菌株為穩(wěn)定乳桿菌（Rummeliibacillus stabekisii），飼喂8 周益生菌后，結(jié)果表明，處理組中益生菌相對(duì)豐度高，如桿菌屬和乳酸菌屬顯著高于對(duì)照組，而病原菌如葡萄球菌和鏈球菌的相對(duì)豐度顯著低于對(duì)照組。

本研究結(jié)果表明，在微生物群落門(mén)水平上，變形桿菌門(mén)、放線菌門(mén)、厚壁菌門(mén)、梭桿菌門(mén)為最主要的細(xì)菌群落門(mén)。與對(duì)照組相比，處理組放線菌門(mén)豐度較低，厚壁菌門(mén)和變形菌門(mén)豐度較高；在屬水平上，處理組博斯氏菌屬和鯨醋桿菌屬豐度較高，F(xiàn)LF 組根瘤菌豐度顯著增加。根瘤菌有利于纖維素分解和果膠分解[23]，鯨醋桿菌能夠抵抗膽汁，代謝肽和碳水化合物產(chǎn)生乙酸[24]。屬水平上益生菌和病原菌數(shù)量變化的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，病原菌如愛(ài)德華氏菌屬和氣單胞菌屬的豐度下降；益生菌如桿菌屬、梭菌屬的豐度上升。愛(ài)德華氏菌于2013 年首次被發(fā)現(xiàn)，是侵染全球大多數(shù)魚(yú)類(lèi)的病原體，傳播速度快，宿主多，對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成大量經(jīng)濟(jì)損失[25]。氣單胞菌屬中有許多種是危害水產(chǎn)的病原菌，如維氏氣單胞菌[26]、嗜水氣單胞菌[27]等。結(jié)果表明，YS11 能夠使腸道微生物中的病原菌數(shù)量減少，同時(shí)使益生菌數(shù)量增加。在門(mén)水平上，與前人研究結(jié)果大致相同，變形菌門(mén)的變化有所不同，在屬和種水平上，與前人研究結(jié)果不同，可能是因?yàn)槭褂玫囊嫔煌?，或者?shí)驗(yàn)魚(yú)不同，對(duì)微生物菌群影響也不盡相同。在屬水平上，YS11 還能夠使愛(ài)德華氏菌屬豐度下降，表現(xiàn)出更好的抑制病原菌的能力，同時(shí)促進(jìn)桿菌屬豐度的增加，且促進(jìn)梭菌屬豐度增加，與之前研究結(jié)果一致[8,20]。

4 結(jié) 論

通過(guò)研究飼料中添加益生菌耐硼賴(lài)氨酸芽孢桿菌YS11，對(duì)羅非魚(yú)腸道微生物群落的影響，結(jié)果表明，添加益生菌后，腸道微生物群落發(fā)生變化，益生菌生存環(huán)境得到改善，有利于羅非魚(yú)的生長(zhǎng)。本研究的創(chuàng)新點(diǎn)在于探究耐硼賴(lài)氨酸芽孢桿菌YS11 對(duì)羅非魚(yú)腸道微生物群落的影響尚未見(jiàn)報(bào)道，本研究的不足在于本實(shí)驗(yàn)選取時(shí)間點(diǎn)較少。