放射性損傷導(dǎo)致的唾液腺內(nèi)源性休眠干細(xì)胞的研究進(jìn)展

肖向陽 張霓霓 綜述 黃桂林△ 審校

(1.遵義醫(yī)科大學(xué)，貴州 遵義 563000；2.遵義醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院頜面外科，貴州 遵義 563000)

唾液腺是人或脊椎動(dòng)物口腔內(nèi)分泌唾液的腺體，其對放射線敏感，因而在頭頸部惡性腫瘤放療中易受到損傷，致機(jī)能減退，出現(xiàn)口干、口內(nèi)黏膜炎、潰瘍等癥狀[1]。臨床防治唾液腺放射性損傷的方法主要是應(yīng)用細(xì)胞保護(hù)劑、促涎劑等修復(fù)，但是療效都不甚理想[2]。近年來，隨著唾液腺組織工程學(xué)技術(shù)發(fā)展及干細(xì)胞在再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究深入，內(nèi)源性干細(xì)胞的移植為唾液腺放射性損傷治療提供新的可能。與目前已經(jīng)知曉的其他成體干細(xì)胞一樣，唾液腺干細(xì)胞(SGSC)是一種未分化細(xì)胞，存在于已分化唾液腺細(xì)胞中，處于休眠狀態(tài)，有著自我更新和分化成特定細(xì)胞能力[3]?，F(xiàn)階段，國內(nèi)外諸多研究發(fā)現(xiàn)動(dòng)物以及人的唾液腺中存在具體成體干細(xì)胞特征的細(xì)胞，且有研究應(yīng)用藥物促進(jìn)SGSC的增殖，對唾液腺放射性損傷起到了修復(fù)作用，并對作用機(jī)制進(jìn)行了深入探究[4]。本文基于國內(nèi)外關(guān)于放射性唾液腺損傷的發(fā)生機(jī)制及治療的相關(guān)研究進(jìn)行綜述。

1 唾液腺放射性損傷的病理生理

唾液腺是人體重要的組織，由薄壁組織和間質(zhì)組成。其中，實(shí)質(zhì)為腺上皮細(xì)胞形成的腺泡和導(dǎo)管；間質(zhì)是由纖維結(jié)締組織和小葉間或小葉間隔形成的包膜，其中有血管、淋巴管和神經(jīng)。腺泡是產(chǎn)生唾液的重要組織，分為漿液型、黏液型和混合型。摘要人的唾液腺由腮腺、頜下腺、舌下腺等許多大腺體和許多小腺體組成。它們都有通向口腔的分泌唾液的導(dǎo)管。唾液中所含的水和黏液可以起到更好的作用。潤滑口腔。據(jù)調(diào)查，成人每天唾液分泌量為1～1.5 L，不同腺體分泌量不同，其中腮腺、頜下腺和舌下腺分泌的唾液腺超過90%。一般來說，60%～65%的唾液由頜下腺鎖分泌，20%～30%由腮腺分泌，剩下的2%～5%由舌下腺分泌。唾液腺細(xì)胞高度分化，有絲分裂期較長。腺泡細(xì)胞通常是有絲分裂后的細(xì)胞，應(yīng)該是輻射不敏感的組織。然而，唾液分泌在輻射后不久就會顯著減少，臨床上對輻射高度敏感的性別尚不清楚[5]。通常在放射線照射后數(shù)小時(shí)內(nèi)逐漸發(fā)生壓痛，偶爾也會發(fā)生明顯的腫脹。持續(xù)照射3d后唾液量明顯減少，后期腺體會萎縮，唾液分泌偶爾會恢復(fù)，但與放療前相比，分泌量明顯減少，口干癥狀明顯。放射治療引起的唾液腺損傷的病理表現(xiàn)主要為炎性細(xì)胞浸潤、膠原纖維增加、細(xì)胞萎縮、腺泡細(xì)胞內(nèi)線粒體空泡變性[6]。

2 SGSC的發(fā)現(xiàn)及與放射性唾液腺損傷相關(guān)性

在正常情況下，成熟的個(gè)體組織中只有很少的干細(xì)胞。但是當(dāng)組織受損時(shí)，干細(xì)胞就會增殖和分化，以修復(fù)受損組織。M.Kwak等[7]提出了雙儲備干細(xì)胞理論，即唾液腺排泄管(ED)中的基底細(xì)胞和間充質(zhì)細(xì)胞(ID)可能具有長生不老增殖和定向分化的潛能，可分化為唾液腺組織干細(xì)胞。何榮根等[8]的研究表明，所有具有增殖和分裂活性的腺細(xì)胞都可能成為干細(xì)胞，參與腺體的自我更新和受損腺體的修復(fù)。

臨床研究[9]顯示，干細(xì)胞在輻照后仍存在干細(xì)胞，并能繁殖和分化，進(jìn)而促進(jìn)唾液腺的結(jié)構(gòu)和生理功能良好恢復(fù)。Y.atsuishi等[10]實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，在放療后頜下腺組織損傷較小的情況下，仍可在臨床樣本中發(fā)現(xiàn)SGSC，并且很難從接受較高輻射劑量和細(xì)胞老化嚴(yán)重的頜下腺組織中培養(yǎng)SGSC。大量研究通過建立動(dòng)物腺體損傷模型，在動(dòng)物腺體中發(fā)現(xiàn)了具有成體干細(xì)胞特征的細(xì)胞。K.Okumura等[11]報(bào)道大鼠涎腺主導(dǎo)管結(jié)扎后，腺泡細(xì)胞大部分消失，且會有明顯的管細(xì)胞增生。當(dāng)主導(dǎo)管再次松動(dòng)后，唾液腺又恢復(fù)了分泌功能，說明唾液腺組織中有干細(xì)胞可以不斷分化為腺泡細(xì)胞。I.M.Lombaert等[12]首次報(bào)道小鼠SGSC在體外誘導(dǎo)向腺泡細(xì)胞分化，并可分泌淀粉酶。體內(nèi)腺移植可恢復(fù)部分唾液腺的形態(tài)和功能。

有研究者猜測輻射唾腺損傷的主要原因是較高的輻射劑量導(dǎo)致部分SGSC死亡，進(jìn)而刺激相關(guān)信號通路，導(dǎo)致腺泡和導(dǎo)管細(xì)胞凋亡，進(jìn)而對唾腺造成不可逆的損傷。許多學(xué)者發(fā)現(xiàn)，對大鼠唾液腺進(jìn)行一次15 Gy X射線照射后第1天，唾液分泌量明顯降低。腺泡是唾液產(chǎn)生的主要部分。放射治療后的急性唾液腺損傷可能與腺泡功能障礙或腺泡細(xì)胞死亡有關(guān)。A.Vissink等[13]報(bào)道，輻照的腮腺腺體老鼠每次15 Gy，發(fā)現(xiàn)輻照0～3 d后，唾液分泌減少，和G腮腺腺泡的細(xì)胞膜上的蛋白質(zhì)受體減少和退化，所以他們認(rèn)為這可能是輻射它破壞了G蛋白受體，是一個(gè)組件的細(xì)胞膜，導(dǎo)致唾液腺功能下降。納格爾等人認(rèn)為這可能是因?yàn)榉置陬w粒和過渡金屬離子位于腺泡的細(xì)胞都被激活，共同的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，但當(dāng)氧化還原活性金屬離子不是位于顆粒但是很接近的DNA，生殖細(xì)胞死亡。因此，可能會發(fā)生金屬離子介導(dǎo)的增強(qiáng)輻射損傷細(xì)胞，但這一機(jī)制可能不是輻射誘導(dǎo)的唾液腺損傷的主要原因。

3 SGSC的分布及分類

3.1SGSC的分布 有臨床研究[14]報(bào)道，SGSC可能位于唾液腺導(dǎo)管和ED中。M.Kwak等[15]首次證實(shí)了SGSC參與維持唾液腺穩(wěn)態(tài)，并發(fā)現(xiàn)唾液腺導(dǎo)管中存在少量的K14+-sma-細(xì)胞。通過遺傳譜系追蹤，他們發(fā)現(xiàn)這些細(xì)胞繼續(xù)自我復(fù)制，并在唾液腺發(fā)育過程中參與導(dǎo)管的形成和更新。A.W.Konings等[16]研究了鼠腮腺組織對輻射的敏感性，發(fā)現(xiàn)有地區(qū)差異在輻射后腮腺損傷的程度，和腮腺頭組織比尾巴更嚴(yán)重的組織輻射后，表明老鼠腮腺組織負(fù)責(zé)人包含更多的干細(xì)胞。P.L.Van等[17]發(fā)現(xiàn)唾液腺對輻射最敏感的排泄管可能是SGSC的來源。以上研究表明，SGSC在唾液腺中的分布不均勻，主要集中在唾液腺較大的ED部位。建議放療時(shí)應(yīng)保護(hù)唾液腺較大的ED，即可以更好地保護(hù)SGSC，放療后可能修復(fù)受損的唾液腺組織和功能。

3.2SGSC的分類 下頜下腺干細(xì)胞：國外研究人員將動(dòng)物頜下腺主管結(jié)扎，分離培養(yǎng)上皮樣細(xì)胞，標(biāo)記表達(dá)α6β1整合素和層粘連蛋白(LN)的上皮樣細(xì)胞，命名為SGP-1細(xì)胞。細(xì)胞功能組織干細(xì)胞可分化為內(nèi)胚層細(xì)胞系。T.Kishi等[18]首次證明了新生和成熟小鼠頜下腺管細(xì)胞中均存在自我更新的多功能唾液腺干細(xì)胞/祖細(xì)胞，并發(fā)現(xiàn)成年小鼠頜下腺干細(xì)胞的增殖潛能弱于新生小鼠。他們成功地制備并使用單細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)進(jìn)行克隆繁殖。Y.G.Man等[19]利用懸浮球培養(yǎng)系統(tǒng)成功分離培養(yǎng)出小鼠頜下腺源性干細(xì)胞，證實(shí)干細(xì)胞來源于導(dǎo)管上皮；體外實(shí)驗(yàn)[20]表明，該細(xì)胞在體內(nèi)具有向唾液腺導(dǎo)管細(xì)胞和腺泡細(xì)胞分化的能力，實(shí)驗(yàn)證明，移植的干細(xì)胞恢復(fù)了部分分泌功能。國外研究發(fā)現(xiàn)，從未結(jié)扎下頜下管的正常大鼠腺體中分離培養(yǎng)的SGCG高表達(dá)α6β1和c-Kit，并可在12個(gè)月內(nèi)分化通過92次傳代維持細(xì)胞形態(tài)、增殖和多向性。此外，這些SGCGs可分化為內(nèi)胚層細(xì)胞系，形成腺泡樣細(xì)胞和分泌胰島素的細(xì)胞。此項(xiàng)研究證實(shí)，正常大鼠腺體中也存在SGCG，這些細(xì)胞可作為種子細(xì)胞治療唾液腺損傷或糖尿病。腮腺干細(xì)胞：最近幾年，關(guān)于腮腺干細(xì)胞相關(guān)研究不多。Rotter等人首次自人腮腺中分離并鑒定出人腮腺干細(xì)胞[21]。O.Katsumata等[22]的研究結(jié)果表明，注射后大鼠腮腺腺泡細(xì)胞和橫紋肌細(xì)胞增生，但不包括間充質(zhì)細(xì)胞。注射后第5天，腺泡細(xì)胞總數(shù)增加了60%，細(xì)胞與小葉之間的橫紋肌細(xì)胞數(shù)量無明顯變化。因而，認(rèn)為增殖紋狀體細(xì)胞可能分化成腺泡細(xì)胞。小唾液腺干細(xì)胞(MSGs)：作為一種與主要唾液腺同源的組織，理論上也應(yīng)該含有SGCG。MSGs具有來源廣、取材便捷、創(chuàng)傷小、供體隱蔽等優(yōu)點(diǎn)。然而，目前國內(nèi)外關(guān)于MSGs和SGCG的研究報(bào)道并不多。從肌聚糖中分離培養(yǎng)SGCG可為干細(xì)胞治療和組織工程提供新的種子細(xì)胞來源。陳玉成等[23]首次得到干燥綜合征患者下唇微信號。在光鏡下，MSGs結(jié)構(gòu)正常。體外分離、培養(yǎng)公司獲得的細(xì)胞群混合成纖維細(xì)胞和epithelial-like細(xì)胞向脂肪細(xì)胞分化的潛能，軟骨細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞的修復(fù)，和早期的干細(xì)胞標(biāo)記物的表達(dá)，包括NANOG Oct-3/4 SSEA-3除此之外，它還表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)記CD90-thy1特點(diǎn)。與此同時(shí)，實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，在細(xì)胞群中有部分細(xì)胞表達(dá)角蛋白7/8，由此提示具有上皮細(xì)胞表型；但是不表達(dá)水通道蛋白1，說明細(xì)胞群以間充質(zhì)干細(xì)胞占主導(dǎo)，上皮干細(xì)胞要少。唾液腺間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)：MSCs是擁有數(shù)種潛能的一類成體干細(xì)胞，已成人多種體間充質(zhì)組織內(nèi)分離出來。該細(xì)胞能夠在體外培養(yǎng)，增殖和分化為各類結(jié)締組織、骨骼及神經(jīng)等細(xì)胞。無論是自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞還是異體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，它們通常不會引起宿主免疫應(yīng)答。所以，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可以作為組織工程的種子細(xì)胞用于干細(xì)胞移植治療。組織特異性培養(yǎng)基可誘導(dǎo)干細(xì)胞向中胚層、外胚層和內(nèi)胚層分化。此外，在肝臟部分切除之后，體外培養(yǎng)的hMSGMSCss被移植到嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷(SCID)小鼠體內(nèi)。hMSGMSCs存活并遷移，表達(dá)干細(xì)胞標(biāo)記物AFP和KPT18。上述相關(guān)研究均證實(shí)hMSGMSCss的存在及其在干細(xì)胞治療和再生醫(yī)學(xué)方面的潛力。

4 SGSC治療唾液腺放射性損傷研究

在臨床放療中最大限度保護(hù)SGSC是預(yù)防和治療唾液腺放射損傷的有效措施。然而，因當(dāng)前的臨床放療技術(shù)水平及有關(guān)研究成果不完善，其防治效果收到很大影響。此外，對于晚期頭頸部惡性腫瘤患者，因瘤體較大，該類患者的SGSC大多已受到不可逆的損傷，被激活可能性相對要小，因而，SGSC的修復(fù)效果不甚理想。SGSC組織學(xué)研究為唾液腺放射損傷防治提供了新思路。近年來，國內(nèi)外許多研究探討了SGSC在治療唾液腺放射損傷中的作用。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示，從小鼠頜下腺提取C-Kit+干細(xì)胞，注入放射損傷模型大鼠頜下腺。90 d后，觀察到注射部位出現(xiàn)了腔體結(jié)構(gòu)，腺體被移植。鏡下外觀與正常腺體一致，可見大量腺泡細(xì)胞。有研究[24]顯示，SGSC干細(xì)胞移植后，腺體將恢復(fù)23%～70%的分泌功能。該項(xiàng)研究首次證明了利用SGSC移植技術(shù)修復(fù)放射性唾液腺損傷的可行性。I.Lombard等[25]將表達(dá)C-Kit、CD133、CD49f、CD24的干細(xì)胞標(biāo)記細(xì)胞注入輻射損傷后的大鼠頜下腺，發(fā)現(xiàn)大鼠的唾液量明顯增加。其中C-Kit+和CD133+細(xì)胞注射量較大。小鼠唾液量明顯增加。放射損傷后，將C-Kit+細(xì)胞及CD24和(或)CD49聯(lián)合標(biāo)記陽性干細(xì)胞注入大鼠頜下腺，驗(yàn)證干細(xì)胞移植對損傷腺的修復(fù)作用。T.Nagamura等[26]從正常大鼠唾液腺中分離獲得側(cè)群(SP)細(xì)胞，未經(jīng)培養(yǎng)就移植到輻射損傷大鼠唾液腺中。受損唾液腺功能在2個(gè)月內(nèi)恢復(fù)正常，但恢復(fù)后唾液腺均在顯微鏡下觀察。在移植部位未見腺泡及導(dǎo)管樣結(jié)構(gòu)。本研究證實(shí)了體外培養(yǎng)SGSC以及應(yīng)用標(biāo)記蛋白改善和加強(qiáng)放射損傷后唾液腺的恢復(fù)的重要性。D.Andreadis等[27]利用人頜下腺培養(yǎng)人頜下腺干細(xì)胞(hSGSCS)，將其移植到輻射損傷大鼠的唾液腺中，研究發(fā)現(xiàn)，干細(xì)胞可分化為腺泡和導(dǎo)管結(jié)構(gòu)，有效修復(fù)受損的唾液腺功能，恢復(fù)唾液腺形態(tài)。I.Lombaert等[25]利用人腮腺內(nèi)分泌管上皮細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)記物(Lgr+CD90+)培養(yǎng)SGSC，其多能性在大鼠唾液腺輻射損傷模型實(shí)驗(yàn)中得到證實(shí)。K.Mishim等[28]為研究SGSC功能及與供體的年齡相關(guān)性，分別從幼年(8～12周)與老年大鼠(22～26個(gè)月)中分離培養(yǎng)，同時(shí)通過流式細(xì)胞儀得到CD24+、CD29+、SGSC，并通過體外培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，雖然年齡較大大鼠模型原代干細(xì)胞形成細(xì)胞集落能力要低于幼年大鼠，但兩組經(jīng)細(xì)胞傳代后擴(kuò)增能力無明顯差異。由此看出，人SGSC的作用可能與供體的年齡不無相關(guān)性，此項(xiàng)研究為老年人自體SGSC的治療應(yīng)用提供可能。

C.Y.Lin等[29]研究報(bào)道，對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)進(jìn)行納米粒子標(biāo)記后，其直接與腺泡的細(xì)胞一起培養(yǎng)，對于標(biāo)記腺泡樣細(xì)胞在分化后獲得，獲得兩個(gè)標(biāo)記細(xì)胞移植到小鼠的唾液腺分離與重度聯(lián)合免疫缺陷癥X射線輻照下，結(jié)果表明，干細(xì)胞療法可減小輻照的唾液腺損傷，進(jìn)而恢復(fù)小鼠唾液分泌和腺體的量，腺泡樣細(xì)胞有更好治療潛力。D.Andreads等[30]通過免疫組化分析小鼠頜下腺組織，發(fā)現(xiàn)表達(dá)干細(xì)胞標(biāo)記物的唾液腺細(xì)胞通常位于唾液腺較大的導(dǎo)管中。將這些細(xì)胞移植到輻射損傷的頜下腺后，發(fā)現(xiàn)小鼠唾液腺細(xì)胞中表達(dá)了不同的干細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志物。干細(xì)胞標(biāo)志物可特異性恢復(fù)唾液腺分泌功能。被輻射損傷唾液腺可通過干細(xì)胞移植再生。唾液的數(shù)量會顯著增加，這說明這些細(xì)胞可以改善被輻射損傷的唾液腺的分泌功能。S.Pringle等[31]研究了脂肪源性基質(zhì)細(xì)胞(ADSCs)在唾液腺輻射損傷上的再生和修復(fù)，研究結(jié)果顯示，相比對照組，研究組小鼠的唾液流量顯著改善。兩組均有腺泡細(xì)胞損傷，但實(shí)驗(yàn)組血管增生，腺泡細(xì)胞增多，纖維化程度降低。免疫熒光觀察脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞向血管內(nèi)皮細(xì)胞和導(dǎo)管細(xì)胞的分化?；诖送茰y，ADSCs參與了唾液腺生理功能的恢復(fù)過程。

5 結(jié) 語

當(dāng)前，雖有諸多研究探討了唾液腺放射性損傷發(fā)生機(jī)制，但確切體機(jī)制仍不完全清楚，在很大程度上增加了唾液腺輻射損傷防治困難，但防治損傷仍需擺在重要的位置上。已有多種來源的干細(xì)胞應(yīng)用導(dǎo)致再生醫(yī)學(xué)中。研究報(bào)道，SGSC移植是治療放射性唾液腺損傷的一種有效方法，但當(dāng)前處于動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)階段，尚未開展臨床實(shí)踐研究，因而后續(xù)要加大此方面的研究力度，以便盡早應(yīng)用到臨床，提高臨床防治效果。