從沉默CNNM4后鎂離子積累分析NAFLD的治療方向*

蔣康偉 聶紅明

1.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院肝病科 (上海市，200000) 2.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬上海市中醫(yī)院肝病科

近20年來(lái)，隨著人們生活方式的巨大變化，非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)已成為我國(guó)最常見(jiàn)的肝臟疾病，但尚未引起人們足夠的重視。來(lái)自武漢大學(xué)人民醫(yī)院的研究團(tuán)隊(duì)使用系統(tǒng)性回顧和Meta分析方法揭示了我國(guó)1999～2018年的NAFLD流行病學(xué)特征。該研究表明2018年我國(guó)NAFLD患病率32.9%，且與美國(guó)相比，中國(guó)的低BMI水平人群患有NAFLD的風(fēng)險(xiǎn)更高，并呈年輕化趨勢(shì)[1]。NAFLD患病率在不斷升高，其發(fā)病機(jī)制也在不斷更新。本文將結(jié)合最新的學(xué)術(shù)進(jìn)展，重點(diǎn)論述細(xì)胞周期蛋白M4(CNNM4)通過(guò)對(duì)Mg2+的調(diào)控實(shí)現(xiàn)對(duì)NAFLD的治療作用，以期為進(jìn)一步的科研研究方向及臨床診療提供新思路。

1 NAFLD的形成

肝細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過(guò)度積聚是NAFLD發(fā)展的第一步，通常與代謝綜合征密切相關(guān)。從病理學(xué)角度出發(fā)，機(jī)體內(nèi)肝臟脂質(zhì)累積過(guò)多至少有3種機(jī)制可以解釋：患者自身攝入過(guò)多的高熱量和(或)高脂肪飲食；體內(nèi)脂肪組織脂肪分解增加；肝細(xì)胞過(guò)度攝取體循環(huán)和(或)門(mén)靜脈循環(huán)中的游離脂肪酸(FFA)，引起肝臟從頭脂肪合成(DNL)增加[2]。體內(nèi)脂肪組織分解增加是肝細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過(guò)度積累的主要原因，約占59%。生理狀態(tài)下，胰島素可以抑制脂肪組織的分解，防止肝細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過(guò)度積累。當(dāng)發(fā)生胰島素抵抗(IR)時(shí)，胰島素抑制脂肪分解的能力減弱，脂肪組織大量水解，形成FFA和甘油，其中FFA被肝臟大量吸收，肝細(xì)胞內(nèi)甘油三酯(TG)累積加快[3]。在肝細(xì)胞內(nèi)，DNL也是促進(jìn)肝細(xì)胞內(nèi)TG累積的重要路徑，約占總合成的26%。DNL主要受固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1c(SREBP-1c)和碳水化合物反應(yīng)元件結(jié)合蛋白兩種轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控。IR可以通過(guò)刺激這兩種轉(zhuǎn)錄因子，進(jìn)而促進(jìn)DNL，加快葡萄糖轉(zhuǎn)化為FFA的進(jìn)程[4,5]，使得FFA酯化形成的TG也隨之上漲，TG合成增多與極低密度脂蛋白(VLDL)合成不足或分泌能力下降加劇了肝細(xì)胞內(nèi)脂肪的累積，進(jìn)而激發(fā)了負(fù)反饋即脂肪變性，加劇了高血糖和高胰島素血癥，進(jìn)一步惡化脂肪變性。

高熱量和(或)高脂肪飲食引起的脂肪堆積雖然只占總體的15%，但對(duì)NAFLD的發(fā)展起著至關(guān)重要的作用。臨床研究也表明，生活方式的改變可以顯著改善機(jī)體代謝異常及肝臟內(nèi)脂肪堆積變性[6]。

2 Mg2+的功能及其動(dòng)態(tài)平衡

鎂是一種必需的微量元素，在人體內(nèi)以離子化和生物活性的形式存在，參與各種重要的代謝過(guò)程，包括依賴于腺苷三磷酸(ATP)的生化反應(yīng)、DNA與RNA的表達(dá)合成、肌肉和神經(jīng)中的信號(hào)傳遞以及血糖和血壓的控制。

Mg2+是腺嘌呤核苷酸的輔助因子，而腺嘌呤核苷酸是糖酵解過(guò)程中許多酶的重要調(diào)節(jié)因子；此外，Mg2+-ATP或Mg2+是許多酶激活的必需品，這意味著 Mg2+對(duì)DNA復(fù)制、RNA轉(zhuǎn)錄、氨基酸合成和蛋白質(zhì)合成是必不可少的[7]。Mg2+也是DNA二、三級(jí)結(jié)構(gòu)的重要組成部分，因?yàn)樗Y(jié)合了多核苷酸鏈內(nèi)帶負(fù)電荷的氧和氮原子，以此來(lái)穩(wěn)固天然DNA的結(jié)構(gòu)，保護(hù)DNA免受氧自由基的損害[8]。Mg2+還在鈣和鉀離子跨細(xì)胞膜的主動(dòng)運(yùn)輸中發(fā)揮關(guān)鍵作用，這一過(guò)程對(duì)維持神經(jīng)沖動(dòng)傳導(dǎo)、肌肉收縮、血管舒張性和正常心律非常重要。

作為天然的鈣拮抗劑，Mg2+是N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受體復(fù)合體的有效拮抗劑，參與抑郁癥的病理生理過(guò)程，一些抗抑郁藥與NMDA受體拮抗劑的藥效可以與Mg2+聯(lián)合給藥而加強(qiáng)[9]。

Mg2+的動(dòng)態(tài)平衡是由腸道、骨骼和腎臟共同維持的。雖然小腸是鎂元素吸收的主要場(chǎng)所，但是腸道吸收與鎂的攝入量不成正比，且影響吸收的主要因素是鎂元素的狀態(tài)，礦物質(zhì)中Mg2+含量越低，礦物質(zhì)在腸道中的吸收率越高，因此攝入量低時(shí)，Mg2+的相對(duì)吸收率就高，反之亦然。Mg2+的排泄主要由腎中完成。血清Mg2+被腎小球過(guò)濾后，被腎單位重吸收。然而，重吸收的方式和效率在每一段都是不同的。近端小管和Henle′s環(huán)的粗大升支是細(xì)胞通過(guò)被動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)實(shí)現(xiàn)對(duì)Mg2+重吸收的部位，而遠(yuǎn)端曲管(DCT)是細(xì)胞通過(guò)主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)對(duì)Mg2+重吸收的主要部位[10]。其中，Mg2+大部分(>60%)被Henle′s環(huán)的粗大升支重吸收；相比之下，只有不到5%的Mg2+在DCT中被重新吸收，但這對(duì)于微調(diào)血清中Mg2+的濃度有著關(guān)鍵性的作用[10]。骨骼是Mg2+的主要儲(chǔ)存場(chǎng)所，人體中50%～60%的Mg2+儲(chǔ)存于骨骼中，還有一部分殘留在軟組織中，僅有1%的Mg2+駐留在細(xì)胞外，骨骼中Mg2+并不是一成不變的，它可以通過(guò)與外界其他陽(yáng)離子的置換，來(lái)達(dá)到血清Mg2+的穩(wěn)態(tài)[11]。

3 Mg2+在NAFLD中的作用

低鎂血癥存在于NAFLD的幾種共病中，如IR、2型糖尿病、心血管并發(fā)癥及肥胖，且Mg2+的缺乏與炎癥反應(yīng)、線粒體功能障礙和抗氧化系統(tǒng)活性減低等病理變化密切相關(guān)，這些變化都是肝病的特征[12]。

已有充分的研究表明Mg2+與IR密切相關(guān)。Mg2+是細(xì)胞攝取葡萄糖并將其轉(zhuǎn)化為能量所必須的礦物質(zhì)，尤其在肌肉和脂肪組織中其中關(guān)鍵性作用。Mg2+通過(guò)增加酪氨酸激酶的活性來(lái)增加ATP受體的敏感性；同時(shí)影響葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性4向質(zhì)膜的轉(zhuǎn)運(yùn)。從而降低了血糖濃度[13]。Mg2+低水平導(dǎo)致酪氨酸激酶活性缺陷、胰島素作用的受體損害、細(xì)胞葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)方式改變和細(xì)胞葡萄糖利用率降低，從而促進(jìn)外周IR[13]。臨床研究表明，口服鎂補(bǔ)充劑可以降低2型糖尿病患者的IR,改善血糖控制指標(biāo)[14]。

一般來(lái)說(shuō)，脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)是通過(guò)調(diào)節(jié)脂肪生成和脂肪分解來(lái)維持的，實(shí)驗(yàn)研究表明，Mg2+治療后可以降低肝臟脂質(zhì)含量，這可能歸因于脂解的上調(diào)和脂生成的下調(diào)。過(guò)氧化物增殖活體受體α(PPARα)可以通過(guò)上調(diào)控制脂肪酸動(dòng)員和氧化的梯度從而促進(jìn)脂解，而Mg2+濃度增加與PPARα表達(dá)呈正相關(guān)[13]。因此，缺乏Mg2+可能會(huì)抑制PPARα的表達(dá)，減少脂肪分解，進(jìn)而促進(jìn)肝臟脂質(zhì)沉積。此外，有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，補(bǔ)充Mg2+可以降低SREBP-1c水平[15]。

Mg2+還通過(guò)阻斷脂肪細(xì)胞對(duì)鈣的吸收來(lái)控制L型鈣通道的開(kāi)放，從而抗氧化。然而，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)Mg2+濃度降低時(shí)，Mg2+對(duì)鈣通道阻斷功能受到損害，脂肪細(xì)胞中Ca2+進(jìn)入的增加可促進(jìn)氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，引起IR；同樣，Mg2+還負(fù)責(zé)抑制Ca2+流入神經(jīng)元細(xì)胞的NMDA[16]。因此，在Mg2+缺乏的情況下，受體阻斷功能減弱，從而允許細(xì)胞內(nèi)Ca2+不斷積累，促進(jìn)炎癥遞質(zhì)釋放，加劇細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激。

4 CNNM家族

2003年CNNM首次被學(xué)者作為一類結(jié)構(gòu)域的膜蛋白而發(fā)現(xiàn)，且這些結(jié)構(gòu)域從細(xì)菌進(jìn)化以來(lái)，至今仍舊未明確其特征，其最初被命名為“古代保守結(jié)構(gòu)域蛋白”，但現(xiàn)在通常被稱為“CNNM”，但在細(xì)胞周期中沒(méi)有觀察到CNNM蛋白水平的周期性波動(dòng)[17]。目前，在人體內(nèi)CNNM4家族包括4個(gè)成員(CNNM1～CNNM4)，其各自的確切功能還在進(jìn)一步的研究中。其中最為被接受的有兩種功能學(xué)說(shuō)，其一為它們可能不牽涉到膜的直接轉(zhuǎn)運(yùn)體，不僅可以作為細(xì)胞內(nèi)Mg2+的感受器，還可以成為其他目前還未被發(fā)現(xiàn)或確認(rèn)的轉(zhuǎn)運(yùn)體Mg2+的動(dòng)態(tài)平衡遞質(zhì)；另一種說(shuō)法則認(rèn)為CNNM是通過(guò)與Na+交換將Mg2+從細(xì)胞中排出的直接轉(zhuǎn)運(yùn)體[18]。

但不同種類的CNNM在分布和表達(dá)模式上存在一定差異性。CNNM1主要分布在睪丸和腦，在神經(jīng)細(xì)胞中作為一種銅儲(chǔ)存蛋白；在睪丸中則僅表達(dá)精原干細(xì)胞或早期精原細(xì)胞，提示其作為生殖細(xì)胞分裂和分化的調(diào)節(jié)因子[19]。CNNM2是被研究最多的成員之一，不僅可以在腦、腎、肝和心臟中表達(dá)，在牙本質(zhì)細(xì)胞、小腸、結(jié)腸、肺、脾以及睪丸中也可以檢測(cè)到CNNM2。有較多報(bào)道揭示CNNM2在DCT中充分表達(dá)，并通過(guò)建立了腎臟特異性CNNM2缺陷小鼠，證明腎臟中的CNNM2在維持Mg2+穩(wěn)態(tài)基礎(chǔ)上，進(jìn)一步影響鈉轉(zhuǎn)運(yùn)體的功能，從而參與對(duì)血壓的控制[20]。CNNM3的功能仍待進(jìn)一步研究，其被證實(shí)能與再生肝磷酸酶-2-2結(jié)合調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)Mg2+水平，來(lái)控制腫瘤的生長(zhǎng)，且在人類乳腺癌組織的數(shù)據(jù)中進(jìn)一步證實(shí)CNNM3水平與PRL-2表達(dá)和腫瘤增殖指數(shù)呈正相關(guān)[21]。CNNM4可能通過(guò)交換細(xì)胞內(nèi)Mg2+和細(xì)胞外Na+從而排出 Mg2+[22]。且CNNM4是CNNM家族中對(duì)Mg2+外流活性影響最大的一種亞型[23]。

5 CNNM4通過(guò)Mg2+對(duì)NAFLD進(jìn)行調(diào)控

目前對(duì)CNNM4研究大多聚焦于CNNM4通過(guò)調(diào)節(jié)精子Ca2+穩(wěn)態(tài)，對(duì)生殖產(chǎn)生影響[24]或CNNM4基因突變引起的一種名為賈利里綜合征的常染色體隱性遺傳病[25]或家族性低鎂血癥等相關(guān)疾病。較少有研究針對(duì)于其在肝臟中的生理作用。目前已有研究表明，CNNM4是肝細(xì)胞內(nèi)Mg2+穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，也可能是未來(lái)NAFLD的潛在治療靶點(diǎn)[12]。

首先，下調(diào)CNNM4表達(dá)后，可以降低Mg2+的外流，增加肝細(xì)胞內(nèi)Mg2+的濃度[12,22]。進(jìn)而減弱由細(xì)胞內(nèi)低Mg2+誘導(dǎo)的IR、脂肪堆積及氧化應(yīng)激。此外，CNNM4自身也具體有降低微粒體甘油三酯轉(zhuǎn)移蛋白(MTP)活性，抑制VLDL分泌的功效。MTP是一種繼載脂蛋白B(ApoB)之后出現(xiàn)，與脂質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)密切相關(guān)的一種主要在肝細(xì)胞和腸上皮細(xì)胞表達(dá)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)蛋白。其介導(dǎo)ApoB與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的TG結(jié)合形成脂蛋白VLDL，并轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞外[26]。對(duì)CNNM4進(jìn)行沉默后，嚙齒動(dòng)物非酒精性脂肪性肝炎模型中可見(jiàn)肝內(nèi)脂質(zhì)堆積減少，血清VLDL水平下降[12]。

綜上所述，CNNM4、肝細(xì)胞內(nèi)Mg2+水平及CNNM4對(duì)Mg2+的調(diào)控作用可能在NAFLD發(fā)病機(jī)制上具有重要地位，也表明了從基因水平上控制NAFLD發(fā)生發(fā)展的可能性，有望成為未來(lái)診治NAFLD的新靶點(diǎn)。沉默CNNM4可以減少肝內(nèi)Mg2+的外流，減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)，同時(shí)提高M(jìn)TP的活性，促進(jìn)VLDL的分泌。沉默CNNM4后，補(bǔ)充鎂制劑是否可協(xié)助NALFD患者的診療及預(yù)后評(píng)價(jià)仍不明確，國(guó)內(nèi)外仍缺乏相關(guān)的臨床研究，需要通過(guò)大范圍臨床調(diào)查及進(jìn)一步的臨床試驗(yàn)來(lái)探索其推廣的可能性。