蘆薈大黃素通過激活Caspase-3/GSDME焦亡通路發(fā)揮抗膠質(zhì)瘤作用

方興剛，汪嫚，陳卓，張思思，羅杰*（. 湖北中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)臨床學(xué)院，武漢 40065；. 胚胎干細(xì)胞研究湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北醫(yī)藥學(xué)附屬太和醫(yī)院，湖北 十堰 44000；. 湖北醫(yī)藥學(xué)院藥護(hù)學(xué)院，湖北 十堰 44000）

神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤，簡稱膠質(zhì)瘤，是顱內(nèi)最常見的惡性腫瘤，約占全部顱內(nèi)惡性腫瘤的 80%[1]。其中膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（glioblastoma，GBM）為第Ⅳ級膠質(zhì)瘤，約占膠質(zhì)瘤總數(shù)的54%，具有高發(fā)病率、高復(fù)發(fā)率、高病死率和低治愈率的特點(diǎn)[1]。GBM的浸潤性生長方式?jīng)Q定其惡性生物學(xué)行為，手術(shù)難以完全切除。由于血腦屏障（bloodbrain barrier，BBB）以及腦-腫瘤細(xì)胞屏障（brain tumor cell barrier，BTB）的存在以及化療抗性，化療的療效也不盡理想[2-5]，且因GBM免疫抑制的微環(huán)境，目前蓬勃發(fā)展的PD-1等免疫檢查點(diǎn)抑制劑效果欠佳[6-8]。因此，從治療的角度來看，需要其他治療途徑和治療靶點(diǎn)來改善預(yù)后。

焦亡是由GSDM家族（GSDMs）介導(dǎo)的具有免疫原性的程序性的細(xì)胞死亡，在活化的Caspase家族及顆粒酶B的作用下，GSDMs被活化，釋放具有細(xì)胞膜成孔功能的N端結(jié)構(gòu)域，誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)外滲透壓失衡，導(dǎo)致細(xì)胞腫脹、死亡[9]。由于GSDME途徑的焦亡會誘導(dǎo)乳酸脫氫酶（LDH）和HMGB1細(xì)胞外釋放而和適應(yīng)性免疫相聯(lián)系，在抗腫瘤治療中日益受到重視。GSDME途徑的焦亡依賴于GSDME在組織中的表達(dá)水平，TCGA數(shù)據(jù)庫（http：//ualcan.path.uab.edu/analysis.html）顯示，GBM特異性高表達(dá)GSDME，故我們認(rèn)為GSDME是抗GBM治療的良好靶點(diǎn)。而激活GBM高表達(dá)的GSDME，促進(jìn)GSDME途徑的焦亡進(jìn)而激活適應(yīng)性免疫，可能為GBM治療提供新的策略。

蘆薈大黃素（aloe-emodin，AE）是一種蒽醌衍生物，是從大黃、虎杖、何首烏、蘆薈、決明子等傳統(tǒng)中藥中提取的有效成分，具有較好的血腦屏障通透性。近年來，AE已被證明具有廣泛的藥理作用，如抗病毒、抗菌、抗過敏、抗骨質(zhì)疏松、抗糖尿病、免疫抑制、神經(jīng)保護(hù)和肝保護(hù)活性以及抗腫瘤作用[10]。既往研究顯示AE通過多種機(jī)制作用于腫瘤細(xì)胞，如誘導(dǎo)DNA損傷[11]，阻滯細(xì)胞周期[12-14]，抑制腫瘤細(xì)胞遷徙[15]。AE可以通過誘導(dǎo)線粒體功能障礙及激活Caspase-9/3/GSDME軸誘導(dǎo)Hela細(xì)胞焦亡，顯示AE具有誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞焦亡的潛力[16]。本研究以AE作為候選藥物，應(yīng)用于GSDME特異性高表達(dá)的GBM細(xì)胞（U87MG、GL261），以明確AE對GBM細(xì)胞的抑制作用及焦亡誘導(dǎo)作用。目前，AE通過激活CASP3/GSDME通路促進(jìn)GBM細(xì)胞焦亡發(fā)揮抗膠質(zhì)瘤作用的研究尚未見任何報(bào)道。本研究可能為臨床膠質(zhì)瘤的治療提供一種新的選擇。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞株與試藥

U87MG、GL261細(xì)胞均來源于本實(shí)驗(yàn)室（胚胎干細(xì)胞湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，凍存細(xì)胞）；蘆薈大黃素（規(guī)格：100 mg，純度：98%，成都埃法生物科技有限公司，結(jié)構(gòu)式見圖1）；重組Anti-Cleaved Caspase-3抗體、重組Anti-DFNA5/GSDME抗體[EPR19859]-N-terminal、重組Anti-cleavedN-terminal GSDMD抗體（Abcam公司）；ABScriptⅡReverse Transcriptase（ABclonal）；蛋白酶和磷酸酶抑制劑混合液、高敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒（新賽美）；MTT細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測試劑盒、2×PCR Master Mix、SDSPAGE凝膠配制試劑盒、LDH釋放檢測試劑盒、β-Tubulin Rabbit Monoclonal Antibody、辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG（H+L）、FITC標(biāo)記山羊抗兔IgG（H+L）、順鉑（Cisplatin）、NAC、Caspase抑制劑Z-VAD-FMK（碧云天）；PageRuler 預(yù)染蛋白Marker（賽默飛）；DCFHDA 活性氧（ROS）熒光探針細(xì)胞檢測試劑盒（索萊寶）；Taq-HS Probe qPCR Premix、線粒體膜電位檢測試劑盒（JC-1）（蘭博利德）。

圖1 蘆薈大黃素分子結(jié)構(gòu)式Fig 1 Molecular formula of aloe-emodin

1.2 儀器

生物安全柜、CO2恒溫培養(yǎng)箱、多功能酶標(biāo)儀（美國Thermo Fisher 公司）；倒置顯微鏡（德國Leica 公司）；超速低溫離心機(jī)（德國Eppendorf公司）；熒光定量PCR儀（美國BIO-RAD公司）；流式細(xì)胞分析儀（美國Beckman公司）。

2 方法和結(jié)果

2.1 AE對GBM細(xì)胞活力的影響

選擇GBM細(xì)胞系U87MG（人）、GL261（鼠）作為實(shí)驗(yàn)對象，以濃度梯度的AE作用于膠質(zhì)瘤細(xì)胞系48 h，MTT實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞存活率：復(fù)蘇U87MG、GL261細(xì)胞，傳代至96孔板中，預(yù)設(shè)每個梯度濃度5孔重復(fù)，每孔4000個/100 μL，12 h后給予包含梯度濃度（6.25、12.5、25、50、75、100 μmol·L-1）AE的培養(yǎng)基共培養(yǎng)，其中0.2%DMSO作為對照組（Con），48 h后每孔加入10 μL MTT 液（5 mg·mL-1）避光孵育 4 h，離心，棄上清液，每孔加入100 μL Formazan（甲瓚）溶解液，適當(dāng)混勻，在細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)再繼續(xù)孵育3 h。光學(xué)顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)甲瓚全部溶解。用酶標(biāo)儀于 490 nm波長處測量各孔的光密度（OD）并計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率，使用Graphpad軟件統(tǒng)計(jì)細(xì)胞存活率。結(jié)果顯示：AE以濃度依賴的方式抑制U87MG（見圖 2A）及GL261（見圖2B）的活性，其對U87MG細(xì)胞的半抑制濃度（IC50）為24.76 μmol·L-1，對GL261細(xì)胞的IC50為43.38μmol·L-1，提示AE對膠質(zhì)瘤細(xì)胞有明確的抑制作用。

圖2 AE對U87MG細(xì)胞（A）和GL261細(xì)胞（B）活性的影響（ ±s，n＝5）Fig 2 Effect of AE on the viability of U87MG cell（A）and GL261 cell（B）detected（ ±s，n＝5）

2.2 AE對GBM細(xì)胞焦亡的影響

為明確AE對GBM細(xì)胞的作用方式，對AE處理的U87MG、GL261細(xì)胞在倒置顯微鏡下進(jìn)行形態(tài)學(xué)動態(tài)觀察：U87MG、GL261細(xì)胞鋪至24孔板中，每孔4000個/100 μL，細(xì)胞貼壁后給予50μmol·L-1的AE共孵育，分別于2、6、12、24、36、48、60 h時間點(diǎn)進(jìn)行細(xì)胞拍照，記錄細(xì)胞形態(tài)。60 h后AE處理的U87MG及GL261（見圖 3）細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞腫脹、吐泡等焦亡特異性細(xì)胞外觀（藍(lán)色箭頭標(biāo)識），提示AE可以促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞焦亡。

圖3 AE處理的U87MG和GL261細(xì)胞外觀（藍(lán)色箭頭指向焦亡細(xì)胞，比例尺：×200）Fig 3 Appearance of U87MG and GL261 cells treat with AE（The blue arrows pointed to pyroptosis cells，scale bar：×200）

焦亡的另一特征是細(xì)胞膜成孔，細(xì)胞內(nèi)容物如LDH從細(xì)胞內(nèi)釋放，為此我們開展了LDH釋放實(shí)驗(yàn)。U87MG細(xì)胞鋪至96孔板中，每孔4000 個/100μL，待其密度生長至90%左右，加入梯度濃度AE共孵育24 h，收集各孔上清至新的96孔板中，采用通過乳酸脫氫酶釋放檢測試劑盒（LDH Release Assay Kit，碧云天）對LDH含量進(jìn)行檢測，采用SpectraMax 190酶標(biāo)儀檢測上清液在490 nm的吸光度進(jìn)而計(jì)算LDH釋放水平。結(jié)果顯示，LDH以濃度依賴的方式實(shí)現(xiàn)細(xì)胞外釋放（見圖 4）。結(jié)果顯示AE對膠質(zhì)瘤細(xì)胞具有明確的抑制作用，這種抑制作用是通過介導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞焦亡實(shí)現(xiàn)的。

圖4 AE對U87MG細(xì)胞中LDH釋放的影響（ ±s，n＝3）Fig 4 Effect of AE on the LDH release of U87MG cells（ ±s，n＝3）

2.3 AE對CASP3/GSDME焦亡通路活化的影響

焦亡的發(fā)生主要是通過經(jīng)典的CASP1/GSDMD通路及非經(jīng)典的CASP3/GSDME通路，為了明確AE通過哪種通路介導(dǎo)GBM細(xì)胞焦亡，我們開展了Western blot實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)了這兩條通路的關(guān)鍵蛋白GSDME-N和GSDMD-N：U87MG細(xì)胞在6孔板中與濃度梯度AE（按實(shí)驗(yàn)需求合用或單用caspase抑制劑Z-VAD-FMK，CASP3途徑焦亡陽性對照藥物順鉑，抗氧化劑NAC）共孵育48 h，以包含1%PMSF的RIPA裂解液裂解后提取蛋白，BCA法分析蛋白濃度，通過SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上，以5%脫脂奶粉封閉2 h，裁膜后分別給予CASP3、GSDMD-N、GSDME-N、β-tubulin一抗4℃孵育過夜，TBST洗膜3次，每次10 min，加入對應(yīng)二抗，室溫孵育1 h，TBST洗膜3次，每次10 min，ECL顯影液顯影，運(yùn)用Image J軟件對條帶進(jìn)行灰度分析。結(jié)果顯示：AE處理的U87MG細(xì)胞出現(xiàn)了CASP3、GSDME蛋白活化（C-CASP3、GSDME-N）表達(dá)水平上升，而GSDMD蛋白未受影響（未見GSDMD-N表達(dá)）（見圖5A），這提示AE活化了CASP3/GSDME焦亡通路而非GSDMD通路。為進(jìn)一步驗(yàn)證這一結(jié)果，我們給予CASP3/GSDME焦亡通路陽性對照藥順鉑和caspase阻斷劑（Z-VAD-FMK）進(jìn)行處理，結(jié)果顯示，AE處理組出現(xiàn)和順鉑組類似的GSDME-N的表達(dá)，而AE處理組（100 μmol·L-1AE）給予Z-VAD-FMK共處理，GSDME-N的表達(dá)明顯減少（見圖5B），這進(jìn)一步證明AE可以引起焦亡關(guān)鍵蛋白GSDME的活化，且這種活化依賴于caspase的表達(dá)。

圖5 AE激活U87MG細(xì)胞CASP3/GSDME焦亡通路（ ±s，n＝3）Fig 5 AE activate CASP3/GSDME pyroptosis pathway on U87MG cells（ ±s，n＝3）

蛋白免疫熒光是檢測蛋白表達(dá)水平的另一種手段，為了進(jìn)一步證實(shí)AE對GSDME活化的影響，我們開展了GSDME-N免疫熒光實(shí)驗(yàn)：細(xì)胞鋪至12孔板中，梯度濃度AE共孵育48 h，去上清，PBS清洗后加入免疫熒光固定液，室溫固定30 min，去固定液，PBS清洗三次，每次5 min，加入免疫熒光封閉液，室溫封閉30 min，清洗三次。加入1∶200 GSDME-N一抗，4℃搖床過夜，回收一抗，清洗三次；加入FIFC標(biāo)記山羊抗兔IgG（H+L）二抗，室溫避光孵育2 h，回收二抗，清洗3遍；加入DAPI染色液，室溫孵育10 min，去染色液，PBS清洗三次，于熒光顯微鏡下檢測GSDME-N的表達(dá)。結(jié)果顯示，AE增強(qiáng)了GSDME-N在U87MG細(xì)胞的熒光強(qiáng)度（見圖6），這進(jìn)一步證明AE能增強(qiáng)GSDME蛋白的活化。

圖6 AE對U87MG細(xì)胞GSDME-N蛋白表達(dá)的影響（比例尺：×200）Fig 6 Effect of AE on the expression of GSDME-N in U87MG cells（scale bar：×200）

2.4 AE對GSDME在膠質(zhì)瘤細(xì)胞mRNA水平的影響

為明確AE對GSDME mRNA表達(dá)水平的影響，我們進(jìn)行了qPCR實(shí)驗(yàn)：梯度濃度AE處理U87MG、GL261 細(xì)胞48 h，Trizol提取總RNA，測定總RNA濃度及純度，使用ABScript Ⅱ Reverse Transcriptase（RK21400）試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，使用Taq-HS Probe qPCR Premix預(yù)混液進(jìn)行qPCR實(shí)驗(yàn)。條件如下：95℃：2 min，94℃：20 s，58℃：20 s，72℃：20 s，40個循環(huán)，最后在72℃下延伸4 min。以β-actin作為內(nèi)參計(jì)算GSDME的相對表達(dá)水平，實(shí)驗(yàn)相關(guān)引物列表如表1，結(jié)果采用2-ΔΔCt法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

表1 引物序列Tab 1 Primers used in the experiment

結(jié)果顯示，無論是在U87MG細(xì)胞，還是在GL261細(xì)胞中，AE均可促進(jìn)GSDME在mRNA水平的表達(dá)，在U87MG細(xì)胞中其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（見圖7）。

圖7 AE對U87MG（A）、GL261（B）細(xì)胞GSDME在mRNA水平的表達(dá)影響（ ±s，n＝3）Fig 7 Effect of AE on the expression of GSDME in U87MG（A）and GL261（B）cells at the mRNA level（x±s，n＝3）

2.5 AE對膠質(zhì)瘤細(xì)胞線粒體功能及ROS的影響

有研究顯示線粒體功能障礙及ROS和CASP3/GSDME 途徑的焦亡密切相關(guān)[17-18]，為了明確AE介導(dǎo)GBM過程中是否發(fā)生線粒體功能障礙，我們對AE處理的U87細(xì)胞線粒體膜電位和ROS水平進(jìn)行檢測。U87細(xì)胞鋪入6孔板中，細(xì)胞生長至70%～80%分別給予含0.2%DMSO，50 μmol·L-1和100 μmol·L-1AE 的培養(yǎng)液共孵育24 h，除去培養(yǎng)液，PBS洗滌細(xì)胞一次，加入1 mL含血清細(xì)胞培養(yǎng)液。再加入1 mL JC-1 染色工作液，充分混勻，細(xì)胞培養(yǎng)箱中37℃孵育20 min。在孵育期間，按照每 1 mL JC-1 染色緩沖液（5×）加入4 mL蒸餾水的比例，配制適量的JC-1染色緩沖液（1×），并放置于冰浴。37℃孵育結(jié)束后，吸除上清，用JC-1染色緩沖液（1×）洗滌2次。再加入2 mL含血清細(xì)胞培養(yǎng)液，用熒光顯微鏡進(jìn)行觀察。結(jié)果顯示（見圖8）：未經(jīng)AE處理的U87MG細(xì)胞線粒體膜電位處于正常高電位（紅色熒光標(biāo)識），而經(jīng)AE處理的線粒體膜電位降低（綠色熒光標(biāo)識）。熒光顯微鏡活性氧檢測顯示（見圖9A）：經(jīng)AE處理后U87MG細(xì)胞ROS熒光明顯增強(qiáng)；應(yīng)用DCFH-DA 活性氧ROS熒光探針對細(xì)胞ROS標(biāo)記，通過熒光顯微鏡及流式細(xì)胞術(shù)檢測ROS水平。U87細(xì)胞鋪入6孔板中，細(xì)胞生長至70%分別給予含0.2%DMSO，50 μmol·L-1和100 μmol·L-1的培養(yǎng)基共孵育24 h，除去培養(yǎng)基，加入DCFH-DA濃度為5 μmol·L-1的培養(yǎng)基1 mL，37℃培養(yǎng)箱孵育30 min，除去含探針培養(yǎng)基，PBS清洗三次，分別進(jìn)行熒光拍照及流式細(xì)胞分析。結(jié)果顯示（見圖9B），DCFH-DA標(biāo)識的陽性細(xì)胞數(shù)量明顯增多，這說明AE可提高U87細(xì)胞ROS水平。為進(jìn)一步明確ROS的表達(dá)是否會影響GSDME的活化，AE處理的U87MG細(xì)胞與抗氧化劑NAC共孵育，顯示NAC可以顯著減輕AE（100μmol·L-1）所誘導(dǎo)的GSDME的活化（P＜0.0001）（見圖9C），這提示AE誘導(dǎo)ROS介導(dǎo)了GSDME的活化及細(xì)胞焦亡。

圖8 線粒體膜電位檢測（比例尺：×200）Fig 8 Detection of mitochondrial membrane potential（scale bar：×200）

圖9 AE誘導(dǎo)U87MG細(xì)胞ROS產(chǎn)生及抗氧化劑NAC對GSDME活化的影響Fig 9 AE induced ROS production in GBM cells and the effect of antioxidants NAC on GSDME activation

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有定量數(shù)據(jù)均以算術(shù)平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。采用雙尾獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比較兩組平均值，使用單因素方差分析與Bonferroni的事后分析比較兩組以上的平均值。其余數(shù)據(jù)均采用非參數(shù)單向Kruskal-Wallis檢驗(yàn)，再進(jìn)行Dunnett多重比較。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討論

膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見、惡性程度最高、預(yù)后最差的惡性腫瘤[2]。Westphal等[19]認(rèn)為，癌癥相關(guān)凋亡誘導(dǎo)和執(zhí)行缺陷是治療失敗的重要原因[20-21]。AE作為一種從天然中草藥中提取的單體化合物，可通過多種途徑發(fā)揮抗腫瘤作用，而AE應(yīng)用于抗GBM的治療尚不多見。我們的研究首次發(fā)現(xiàn)AE通過激活CASP3/GSDME通路誘導(dǎo)GBM焦亡發(fā)揮抗膠質(zhì)瘤作用，可能為膠質(zhì)瘤的治療提供新的策略。

焦亡是新發(fā)現(xiàn)的程序性細(xì)胞死亡方式，而GSDME途徑的焦亡被認(rèn)為具有良好的抗腫瘤應(yīng)用前景，是GBM的一個重要的預(yù)后預(yù)測因子[22]?；熕幬锉徽J(rèn)為是誘導(dǎo)焦亡發(fā)生的重要途徑之一，其誘發(fā)焦亡是通過激活凋亡關(guān)鍵蛋白CASP3來實(shí)現(xiàn)的[23-24]。CASP3是天冬氨酸特異酶切的半胱氨酸蛋白酶，正常狀況下以無活性的酶原形式存在于細(xì)胞質(zhì)中，既往研究認(rèn)為CASP3是凋亡相關(guān)關(guān)鍵蛋白，CASP3激活后，細(xì)胞進(jìn)入凋亡途徑，近年研究表明CASP3的剪切和活化，可進(jìn)一步剪切和活化焦亡關(guān)鍵蛋白GSDME，釋放的GSDME-N端片段具有細(xì)胞膜及線粒體成孔功能，細(xì)胞膜的成孔會導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)容物如LDH、HMGB1的釋放，細(xì)胞內(nèi)外滲透壓失衡，誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡[25-27]。而HMGB1等抗原物質(zhì)的釋放能激活抗原遞呈細(xì)胞，進(jìn)而激活殺傷性T細(xì)胞，同時引起腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞的活化及浸潤，起到免疫放大作用，擴(kuò)大抗腫瘤效應(yīng)[28-29]。故GSDME途徑的焦亡發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)受到直接的細(xì)胞成孔及間接的免疫激活雙重作用。目前的研究顯示乳腺癌、黑色素瘤、胃癌細(xì)胞的焦亡有明顯的腫瘤抑制作用[30-31]。

GSDME的表達(dá)可促使細(xì)胞從凋亡向焦亡轉(zhuǎn)變[23]，GSDME在GBM中高表達(dá)，使其成為誘導(dǎo)焦亡抗GBM治療的天然靶點(diǎn)，故篩選合適的焦亡激活藥物尤為重要。目前的研究顯示多種化學(xué)藥物如順鉑、阿霉素等具有GSDME途徑焦亡誘導(dǎo)作用[29]，但血腦屏障的存在及其毒副作用限制了其顱內(nèi)應(yīng)用。AE具有血腦屏障能力[32]，本研究顯示AE具有確切的CASP3、GSDME活化作用及GBM細(xì)胞抑制作用，故AE可以作為誘導(dǎo)GBM焦亡抗腫瘤的良好候選藥物。中等濃度的AE可明顯抑制GBM活性，但未見明顯的CASP3與GSDME的活化，這提示誘導(dǎo)焦亡是AE抑制GBM細(xì)胞的途徑之一，目前有文獻(xiàn)顯示AE可抑制DNA合成、阻滯細(xì)胞周期[11-12]，故認(rèn)為AE抗GBM的機(jī)制為包括誘導(dǎo)焦亡在內(nèi)的多種途徑滲入，其焦亡誘導(dǎo)作用也是有限的。GSDME在正常腦組織及機(jī)體器官有表達(dá)，GSDME的完全激活會引起正常組織損傷，這也被認(rèn)為與多種化療藥物的毒副反應(yīng)相關(guān)[26]，而AE有限的焦亡誘導(dǎo)作用既有利于其發(fā)揮對腫瘤的抑制作用，又可避免焦亡過度激活所引起的正常組織損傷，是一種適合臨床應(yīng)用的理想的焦亡誘導(dǎo)藥物，當(dāng)然其更明確的抗GBM作用及安全性有待體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步明確。

焦亡的發(fā)生與線粒體的功能障礙以及ROS產(chǎn)生密切相關(guān)[17]，Yang等[33]研究顯示：ROS產(chǎn)生可激活JNK/Cytochrome C/CASP9/CASP3通路，而誘導(dǎo)高表達(dá)GSDME的細(xì)胞出現(xiàn)焦亡；An等[18]研究顯示：線粒體ROS的產(chǎn)生可激活CASP3/GSDME，進(jìn)而誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞焦亡。以上研究顯示，線粒體功能障礙和ROS產(chǎn)生是CASP3/GSDME 途徑焦亡的啟動因素之一，我們的研究也顯示AE處理的GBM細(xì)胞在晚期（60 h）出現(xiàn)細(xì)胞焦亡，而在早期（24 h）檢測ROS水平，顯示ROS表達(dá)水平明顯升高，而用抗氧化劑阻斷ROS可抑制AE所誘導(dǎo)的GSDME的活化，說明AE介導(dǎo)GBM細(xì)胞焦亡和誘發(fā)線粒體功能障礙和ROS產(chǎn)生相關(guān)。

綜上，本文以膠質(zhì)瘤細(xì)胞為研究對象，通過體外實(shí)驗(yàn)證明AE以濃度依賴的方式抑制GBM細(xì)胞活性，誘導(dǎo)GBM細(xì)胞出現(xiàn)焦亡特異性外觀及LDH釋放，介導(dǎo)CASP3、GSDME蛋白水平的剪切活化，上調(diào)GSDME在mRNA的表達(dá)，誘導(dǎo)線粒體功能障礙和ROS的產(chǎn)生。證實(shí)激活CASP3/GSDME通路是AE抗GBM的機(jī)制之一，可為膠質(zhì)瘤的治療提供一種新的選擇。