曲霉、酵母菌和乳酸菌固態(tài)發(fā)酵對無花果多酚和黃酮類化合物抗氧化活性的影響

廖 穎，尹禮國，斯朝金，帖 余，蔣楊丹，趙甲元

(1.固態(tài)發(fā)酵資源利用四川省重點實驗室，四川 宜賓 644000; 2.四川師范大學，成都 610101)

【研究意義】無花果(FicuscaricaL.)是桑科落葉喬木，自公元前3000年起就因其食用價值而被栽培[1-2]。無花果具有抗氧化、抗菌、抗癌、降糖、保肝、利尿和抗炎等作用，因此也被用于傳統(tǒng)藥物[3-5]。無花果的藥理特性主要歸因于無花果中的多酚和黃酮類化合物[6]。目前，針對無花果的研究主要集中于多酚和黃酮類化合物的組成、化學特性、抗氧化活性和分離方法等[7]，微生物固態(tài)發(fā)酵對無花果中多酚和黃酮類化合物的影響研究較少。【前人研究進展】發(fā)酵是一種由微生物驅(qū)動的過程。研究顯示，微生物發(fā)酵可以將食物中的初始多酚和黃酮類化合物轉(zhuǎn)化為更具生物活性的化合物[8-10]。張云娟等[11]研究發(fā)現(xiàn)，魯氏毛霉(Mucorrouxianus)可以提高辣木葉的營養(yǎng)成分含量以及抗氧化能力。不僅如此，多項研究證實霉菌、酵母菌和乳酸菌可以改變水果和蔬菜中多酚和黃酮類化合物的組成和抗氧化活性[12-14]。米根霉(Rhizopusoryzae)、木霉(Trichodermasp.)、黑曲霉HT4(AspergillusnigerHT4)和黑曲霉GH1(AspergillusnigerGH1)可增加水果和蔬菜中的總多酚含量[7-8,10,15-16]；釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)發(fā)酵會改變食物中多酚和黃酮類化合物的含量和組成[17]?！颈狙芯壳腥朦c】現(xiàn)有研究傾向單一菌株發(fā)酵引起底物成分的變化，卻很少有研究集中比較曲霉、酵母菌和乳球菌發(fā)酵引起的果蔬中多酚和黃酮類化合物含量和抗氧化活性變化的差異。因此，研究曲霉、酵母菌和乳球菌發(fā)酵對無花果多酚和黃酮類化合物含量及抗氧化活性的影響的區(qū)別十分重要?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究分別用米曲霉(Aspergillusoryzae)、黑曲霉(Aspergillusniger)、釀酒酵母、紅酵母NY5(RhodotorulaglutinisNY5)和乳球菌(Lactococcusgarvieae)對無花果進行固態(tài)發(fā)酵，并對其多酚和黃酮類化合物的含量、組成和抗氧化活性進行分析，研究曲霉、酵母菌和乳酸菌在提高無花果中多酚和黃酮類化合物含量和抗氧化活性的效率及發(fā)酵后的成分差異。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

凍干無花果購自威海市金寶食品科技有限公司(中國威海市)，切成直徑0.3～0.5 cm的小塊。

菌種：分別從醬油曲、大豆糊、酒曲、酸奶和胡蘿卜素的發(fā)酵液中分離出米曲霉、黑曲霉、釀酒酵母、紅酵母NY5和乳球菌，菌株由四川師范大學食品功能及加工應(yīng)用研究所分離、純化、鑒定和保藏。

實驗試劑：馬鈴薯葡萄糖肉湯、馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)、De Man Rogosa Sharpe(MRS)肉湯、MRS瓊脂購自北京歐博思生物科技有限公司。1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH≥97%)購自格爾默生物技術(shù)有限公司(美國賓夕法尼亞州)。Folin-Ciocalteu試劑，沒食子酸和蘆丁購自西格瑪奧德里奇(美國密蘇里州美國密蘇里州圣路易斯)。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌懸液制備 將米曲霉、黑曲霉、釀酒酵母、紅酵母NY5和乳球菌活化后，米曲霉和黑曲霉分別接種到馬鈴薯葡萄糖瓊脂斜面，30 ℃培養(yǎng)5 d，收集孢子，將其懸浮在無菌的0.9% NaCl溶液中，制備1.0×107cfu/mL的孢子懸液備用。將釀酒酵母、紅酵母NY5和乳球菌分別接種到裝有30 mL馬鈴薯葡萄糖肉湯和MRS肉湯的100 mL錐形瓶中，在30 ℃、180 r/min培養(yǎng)24 h，10 000 r/min、4 ℃離心10 min后，收集菌株細胞并將其懸浮在無菌NaCl溶液(0.9%)中，配制成濃度為1.0×107cfu/mL的菌懸液備用。

1.2.2 固態(tài)發(fā)酵 采用Buenrostro等[16]報道的方法發(fā)酵凍干無花果。將2 mL米曲霉、黑曲霉、釀酒酵母、紅酵母NY5和乳球菌的菌或孢子懸液分別接種至10 g凍干無花果(已滅菌)中，用無菌水浸潤使其含有70%的水分。每組設(shè)置3個生物學重復，在30 ℃恒溫發(fā)酵7 d[18]。以接種2 mL無菌NaCl溶液(0.9%)為對照組。分別取0、1、3、5、7 d發(fā)酵產(chǎn)物，冷凍干燥備用。

1.2.3 樣品制備 參照Slatnar等[3]的方法進行樣品制備。取各組中1 g凍干的發(fā)酵產(chǎn)物和適量的乙醇(95%，v/v)轉(zhuǎn)移到200 mL棕色錐形燒瓶中，40 ℃超聲處理(40 kHz和400 W)30 min，用95%乙醇在25 ℃條件下定容至200 mL。將混合物以8000 r/min離心20 min后，收集上清液，并通過0.45 μm膜濾器過濾得到無花果發(fā)酵后提取物。每組提取物均分為兩部分，一部分用于測定多酚和黃酮類化合物的含量及抗氧化活性，另一部分運用液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(LC-MS)測定提取物中多酚和黃酮類物質(zhì)的成分。

1.2.4 總酚含量測定 采用Folin Ciocalteu法[6]測定提取物中的總酚含量?？偡雍恳悦靠藘龈蔁o花果中所含沒食子酸當量表示g。以沒食子酸濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制標準曲線，獲得標準曲線方程為y=0.4507x-0.0042，R2=0.9987，在測定范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，可用于多酚含量的測定。

1.2.5 總黃酮含量測定 采用三氯化鋁法[6]測定提取物中的總黃酮含量?？傸S酮含量以每克凍干無花果中蘆丁當量表示。以蘆丁濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，獲得標準曲線方程：y=0.013x-0.0042，R2=0.9987，在測定范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，可用于黃酮含量的測定。

1.2.6 DPPH自由基清除能力的測定 使用DPPH自由基清除法[2]測定提取物清除自由基的能力。以甲醇為空白溶液，DPPH溶液為對照，在517 nm(Schimadzu-UV-2401PC)處測量吸光值。用以下公式計算不同實驗組提取物的自由基清除能力。

式中，OD對照為DPPH溶液的吸光度，OD空白為純甲醇溶液的吸光度，OD樣品為添加不同濃度提取物的DPPH溶液吸光度。

1.2.7 還原力測定 使用鐵氰化物還原法測定提取物的還原能力[12]。以反應(yīng)混合物在700 nm處的吸光值表示其還原能力(Schimadzu-UV-2401PC)。

1.2.8 多酚類和黃酮類化合物的測定 使用LC-MS(Agilent, Santa Clara, CA, USA)分析提取物中多酚和黃酮類物質(zhì)。色譜條件：WatersXSelectRHSST3柱(2.5 μm,100 mm×2.1 mm)，流動相為0.1%甲酸的水溶液(A)，流動相為0.1%甲酸的乙腈溶液(B)，流速為0.35 mL/min，柱溫為25 ℃，進樣量為2 μL，梯度洗脫條件優(yōu)化為0～2 min，5% B；2～13 min，5%～95% B；13～15 min，95% B，處理時間為5 min。質(zhì)譜在正負離子模式下進行。優(yōu)化參數(shù)：毛細管電壓為正模式4 kV，負模式3.5 kV；干燥氣體流量為10 L/min；氣體溫度為325 ℃；噴霧器壓力為20 psi；破碎器電壓為120 V；撇沫器電壓為45 V；質(zhì)量范圍為m/z=100～1700。在質(zhì)譜采集過程中使用參考離子以確保質(zhì)量精度。正離子模式下的參考離子為121.0509922.0098；負離子模式為112.98561033.9981。

1.2.9 多酚黃酮類物質(zhì)主成分分析 使用SIMCA-P14.1軟件和主成分分析法(PCA)對提取物中的多酚和黃酮類的成分進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 微生物發(fā)酵對凍干無花果總酚含量的影響

如表1所示，與0 d相比，米曲霉、黑曲霉、釀酒酵母、紅酵母NY5和乳球菌發(fā)酵均能顯著提高凍干無花果中的多酚類物質(zhì)含量(P<0.05)。其中米曲霉和黑曲霉發(fā)酵7 d后，總酚含量較0 d分別提高3.59和4.01 mg/g(P<0.05)。釀酒酵母發(fā)酵7 d后，總多酚含量較0 d增加1.77 mg/g(P<0.05)。紅酵母NY5發(fā)酵0～7 d，從第3天開始才與對照組具有顯著差異(P<0.05)，發(fā)酵結(jié)束后總多酚含量較0 d提高1.24 mg/g(P<0.05)。乳球菌發(fā)酵7 d后，總酚含量較0 d提高4.30 mg/g(P<0.05)。說明,在受試時間范圍內(nèi)的所有實驗組中，提高凍干無花果中總多酚含量能力的菌株排序為乳球菌>黑曲霉>米曲霉>釀酒酵母>紅酵母NY5。

表1 微生物發(fā)酵對凍干無花果總多酚含量的影響

2.2 微生物發(fā)酵對凍干無花果總黃酮含量的影響

通過檢測提取物中的總黃酮含量來表征發(fā)酵后凍干無花果中的總黃酮含量(表2)。與0 d相比，米曲霉、黑曲霉、釀酒酵母、紅酵母NY5和乳球菌發(fā)酵均能顯著增加凍干無花果中時黃酮類物質(zhì)的含量(P<0.05)。米曲霉發(fā)酵7 d時，總黃酮含量較0 d增加3.99 mg/g(P<0.05)。黑曲霉發(fā)酵7 d時，總黃酮含量較0 d增加2.60 mg/g(P<0.05)。釀酒酵母發(fā)酵7 d時，總黃酮含量較0 d增加3.12 mg/g(P<0.05)。紅酵母NY5發(fā)酵7 d時，總黃酮含量較0 d增加2.20 mg/g(P<0.05)。乳球菌和發(fā)酵7 d時，總黃酮含量較0 d提高2.39 mg/g(P<0.05)。說明，在受試時間范圍內(nèi)的所有實驗組中，提高凍干無花果中總黃酮含量能力的菌株排序為米曲霉>釀酒酵母>黑曲霉>乳球菌>紅酵母NY5。

表2 微生物發(fā)酵對凍干無花果總黃酮含量的影響

2.3 微生物發(fā)酵對凍干無花果DPPH自由基清除能力的影響

DPPH是一種常用的體外抗氧化能力評價的自由基。通過檢測提取物的DPPH清除能力來表征發(fā)酵后凍干無花果的DPPH清除能力(表3)。與0 d相比，米曲霉、黑曲霉、釀酒酵母、紅酵母NY5和乳球菌發(fā)酵均能顯著增加凍干無花果的DPPH清除能力(P<0.05)。米曲霉發(fā)酵7 d時，對DPPH的清除率較0 d提高33.74%(P<0.05)；黑曲霉發(fā)酵7 d時，對DPPH的清除率較0 d提高33.76%(P<0.05)；釀酒酵母發(fā)酵7 d時，對DPPH的清除率較0 d提高27.95%(P<0.05)；紅酵母NY5發(fā)酵7 d時,對DPPH的清除率較0 d提升26.15%(P<0.05)。乳球菌發(fā)酵7 d時，對DPPH的清除率較0 d增加37.63%(P<0.05)。說明，在受試時間范圍內(nèi)的所有實驗組中，提高凍干無花果DPPH清除能力的菌株排序為乳球菌>黑曲霉>米曲霉>釀酒酵母>紅酵母NY5。

表3 微生物發(fā)酵對凍干無花果DPPH清除能力的影響

2.4 微生物發(fā)酵對凍干無花果還原能力的影響

通過檢測提取物的還原能力來表征發(fā)酵后凍干無花果的還原能力(表4)。與0 d相比，米曲霉、黑曲霉、釀酒酵母、紅酵母NY5和乳球菌發(fā)酵均顯著提升凍干無花果的還原能力(P<0.05)。其中，提升還原能力最強的是乳球菌組，A700較0 d提升12.50倍(P<0.05)。其次是米曲霉和黑曲霉組，A700較0 d均提升10.50倍(P<0.05)。相對而言，對A700提升能力較差的是釀酒酵母組和紅酵母NY5組，提升率分別為0 d的6.00和5.00倍(P<0.05)。說明，在受試時間范圍內(nèi)的所有實驗組中，提高凍干無花果還原能力的菌株排序為乳球菌>米曲霉=黑曲霉>釀酒酵母>紅酵母NY5。

表4 微生物發(fā)酵對凍干無花果還原能力的影響

2.5 發(fā)酵提取物中多酚和黃酮類物質(zhì)的成分分析

通過LC-MS測定經(jīng)米曲霉、黑曲霉、釀酒酵母、紅酵母NY5和乳球菌發(fā)酵的凍干無花果提取物中的多酚和黃酮類成分，所有實驗組中均檢測到47種相同的化合物(表5)。對照組中檢測出了除匙羹藤酸I之外的其余46種化合物。與對照組相比，在米曲霉組中檢測出包括對羥基苯甲醇在內(nèi)的27種含量升高的化合物，包括4-庚基苯酚在內(nèi)的20種含量降低的化合物；在黑曲霉組中檢出出包括對羥基苯甲醇在內(nèi)的18種含量升高的化合物，包括4-庚基苯酚在內(nèi)的29種含量降低的化合物；在釀酒酵母組中檢測出包括對羥基苯甲醇在內(nèi)的22種含量升高的化合物，包括3-羥基肉桂酸在內(nèi)的25種含量降低的化合物；在紅酵母NY5組中檢測出包括對羥基苯甲醇在內(nèi)的15種含量升高的化合物，包括3-羥基肉桂酸在內(nèi)的32種含量降低的化合物；在乳球菌組中檢測出包括對羥基苯甲醇在內(nèi)的27種含量升高的化合物，包括4-丙基-2,6-二甲氧基苯酚在內(nèi)的20種含量降低的化合物。說明，不同菌株發(fā)酵時，消耗底物與產(chǎn)生的產(chǎn)物具有較大的差異。除此之外，不同的菌株發(fā)酵凍干無花果后的提取物具有不同的自由基清除能力和還原能力是由不同的化合物組成所導致的。

表5 發(fā)酵7 d后無花果提取物中的主要多酚和黃酮類化合物

2.6 主成分分析

從圖1可知，米曲霉組、黑曲霉組、釀酒酵母組、紅酵母NY5組和乳球菌組發(fā)酵的樣品彼此能夠明顯區(qū)分，相同處理的生物學重復組能夠聚集。米曲霉組、黑曲霉組、釀酒酵母組和乳球菌組的樣品位于陽性PC1區(qū)域，紅酵母NY5組和對照組位于陰性PC1區(qū)域。說明，相比其余各組，紅酵母NY5組與對照組之間相對差異較小，預(yù)示著紅酵母NY5組的提取物可能具有相對較差的自由基清除能力與還原能力。

圖1 提取物中多酚類和黃酮類成分的主成分分析

3 討 論

隨著發(fā)酵時間的延長，與對照相比，米曲霉、黑曲霉、釀酒酵母、紅酵母NY5和乳球菌處理的凍干無花果樣品中酚類化合物含量增加，說明這5個菌株均能提高凍干無花果中酚類化合物的含量，這與前人的研究類似[3,8,12]。米曲霉和黑曲霉能顯著增加凍干無花果中的多酚含量，原因可能是在發(fā)酵時絲狀真菌可以通過產(chǎn)生淀粉酶、糖苷酶和木聚糖酶從而水解糖苷鍵，使結(jié)合狀態(tài)的多酚得以釋放和游離[24-25]。釀酒酵母和紅酵母NY5也能增加凍干無花果中的總酚含量，原因可能是酵母的代謝會產(chǎn)生分解植物細胞壁的解聚酶，例如酯酶、糖苷酶、多糖降解酶等。據(jù)報道，番石榴葉茶經(jīng)釀酒酵母發(fā)酵后，總酚含量顯著增加[26]。同時也有研究表明，酵母可以導致葡萄酒中酚類含量降低[27]。這可能是因為酵母在酒精發(fā)酵和食品發(fā)酵中的代謝不同。根據(jù)Sirilin等[19]的研究，通過副干酪乳桿菌(Syzygiumcumini)發(fā)酵6個月后，紅豆果實中總酚含量增加了85.71%。主要原因是，很多乳酸菌物種能夠?qū)ι攀撤宇惢衔镞M行去糖基化、去酯化、去羧化和去甲基化[20]，因此，乳酸菌發(fā)酵后水果和蔬菜的總酚含量可增加1.5～8.0倍[21-23]。綜上，米曲霉、黑曲霉、釀酒酵母、紅酵母NY5和乳球菌均能顯著增加凍干無花果中的總多酚含量，但結(jié)合實驗結(jié)果，乳球菌是增加總酚含量的最有效菌株。這是因為生物轉(zhuǎn)化酚類化合物的酶在霉菌、酵母菌和乳酸菌中有所不同[28]。酵母菌可以有效地降解沒食子鞣質(zhì)，但對于高分子量化合物，這種能力會大大減弱[14,28-29]。而細菌和霉菌可以降解沒食子鞣質(zhì)和鞣花單寧[5,28-29]，所以乳球菌可能比黑曲霉和米曲霉更有效。

圖2 微生物發(fā)酵后提取物中的主要化合物

米曲霉、黑曲霉、釀酒酵母、紅酵母NY5和乳球菌發(fā)酵過程中無花果中的總黃酮含量都隨著時間的推移而增加，因為一些微生物可以將復雜的化合物水解成更簡單、更具生物活性的黃酮類化合物[21]，一些微生物可以合成異黃酮和苷元異黃酮[15,28]。此前也有類似的報道，Lee等[15]指出乳酸菌合成了異黃酮和苷元異黃酮。Wang等[26]報道顯示霉菌和酵母菌可顯著增加可溶性黃酮類含量。本研究中，米曲霉和釀酒酵母在提高黃酮類含量方面比其他菌株更有效，這可能歸因于不同的活性酶作用的效果。乳酸菌主要由β-葡萄糖苷酶合成黃酮類，而霉菌和酵母菌則通過產(chǎn)生單寧?；饷?、β-葡萄糖苷酶、木聚糖酶和半纖維素將黃酮類苷元轉(zhuǎn)化為黃酮苷元[8,13,15,26]。

酚類和黃酮類化合物作為重要的抗氧化劑，可以防止食物的自氧化，并中和人體中產(chǎn)生的大量自由基[30-31]。本研究中，通過DPPH自由基清除實驗和鐵氰化物還原2種不同的分析方法測量了由米曲霉、黑曲霉、釀酒酵母、紅酵母NY5和乳球菌發(fā)酵凍干無花果得到的提取物中的多酚和黃酮類化合物的抗氧化活性。經(jīng)米曲霉、黑曲霉、釀酒酵母、紅酵母NY5和乳球菌發(fā)酵7 d后，均能顯著提升DPPH的清除率，表明這些菌株的發(fā)酵可以改善提取物的DPPH清除能力。其中，經(jīng)乳球菌發(fā)酵的提取物清除DPPH的能力最強，同時乳球菌也是最有效的A700改良菌株。而米曲霉組和黑曲霉組的DPPH自由基清除能力與還原能力則相對釀酒酵母組和紅酵母NY5組更有效。造成這種情況的可能原因是，乳球菌組中的總酚含量最高，而2種曲霉組產(chǎn)生的總酚含量也相對多于2種酵母菌組。因此，與其他4種菌株相比，凍干無花果經(jīng)乳球菌發(fā)酵后的提取物的抗氧化活性更高。與Mousavi等[32]的研究類似，植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)和嗜酸乳桿菌(L.acidophilus)發(fā)酵石榴汁后的DPPH清除力顯著增加，抗氧化能力(A700)也顯著增強。這主要歸因于乳酸菌發(fā)酵后酚類和黃酮類化合物[8,13,16,27]的含量和活性明顯增加。

米曲霉組、黑曲霉組、釀酒酵母組、紅酵母NY5組、乳球菌組的LC-MS結(jié)果均檢測出相同的47種化合物，對照組中也檢測出除匙羹藤酸I外的其余46種化合物。與對照組相比，所有實驗組的提取物中多酚和黃酮類成分的峰面積變大。說明凍干無花果經(jīng)受試菌株發(fā)酵后的提取物中多酚和黃酮類化合物的總含量增加。將所有受試組中經(jīng)LC-MS檢測出的多酚和黃酮類物質(zhì)進行PCA分析，米曲霉組、黑曲霉組、釀酒酵母組、紅酵母NY5組和乳球菌組進行了明顯區(qū)分，表明不同種類的微生物導致每個樣品中多酚和黃酮類化合物特征不同。用米曲霉、黑曲霉、釀酒酵母和乳球菌發(fā)酵的樣品位于陽性PC1區(qū)域，紅酵母NY5和對照組位于陰性PC1區(qū)域，表明紅酵母NY5無法形成復雜的多酚和黃酮類物質(zhì)。在本研究中，從化合物的含量來看，經(jīng)米曲霉、黑曲霉、釀酒酵母、紅酵母NY5和乳球菌發(fā)酵的樣品中的主要化合物完全不同。本研究中，米曲霉和黑曲霉組中，提取物的主要化合物是異沙糖苷、2,6-二甲氧基-4-甲基苯酚、5-甲氧基補骨脂素、4′-羥基-3,5,8,3′-四甲氧基-7-異戊氧基黃酮、蘆丁、丁香酸、5-羥基-7,2′,3′,4′,5′-五甲氧基黃酮、3,5,6-三甲氧基-3′,4′-亞甲基二氧基呋喃黃酮。槲皮素3-O-6′-丙二酰基-葡糖苷、4-正庚基苯酚、4-正己基苯酚、5,5′-二羥基-3,6,7,2′,4′-五甲氧基黃酮和5′-葡糖苷則在釀酒酵母組和紅酵母NY5組的樣品中含量較多。經(jīng)乳球菌發(fā)酵后，提取物中的主要化合物有對羥基苯甲醇、7-異戊烯氧基-3′-羥基-4′-甲氧基異黃酮、黃芪素、5,7,3′,5′-四羥基-3,6,8,4′-四甲氧基黃酮和3′-葡糖苷。綜上說明，乳酸菌和曲霉在提高無花果中多酚和黃酮類化合物的含量和抗氧化活性比酵母菌更有效。

4 結(jié) 論

選擇微生物固態(tài)發(fā)酵的方式來提高凍干無花果中的總多酚和總黃酮類物質(zhì)含量以及抗氧化活性是可行的，為利用無花果開發(fā)功能性食品或配料提供依據(jù)和數(shù)據(jù)參考。