• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    亞洲百合及東方百合 AGPase 酶活性及表達(dá)量與淀粉含量的相關(guān)性

    2023-03-31 07:47:28李蓮蓮莫江玲張超超吳學(xué)尉王麗花
    關(guān)鍵詞:鱗莖鱗片亞基

    張 達(dá),李蓮蓮,莫江玲,李 緣,張超超,吳學(xué)尉,王麗花

    (1.云南大學(xué)農(nóng)學(xué)院, 昆明 650504; 2.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院花卉研究所, 昆明 650205)

    【研究意義】百合是百合科百合屬(Lilium)球根花卉植物,是重要的鮮切花[1],中國(guó)切花生產(chǎn)用百合種球主要依賴進(jìn)口,每年需向荷蘭進(jìn)口約3億粒百合種球[2]。中國(guó)從20世紀(jì)90年代開(kāi)始研究百合種球國(guó)產(chǎn)化,目前已取得一定成果[3],但在百合種球繁育周期長(zhǎng)及采后處理技術(shù)等方面還有進(jìn)一步研究和進(jìn)步的空間[4]。通常百合鱗莖需要培育到一定圍徑規(guī)格才能開(kāi)花,不同類型百合鱗莖培育膨大速率不同[5-8]。鱗莖的膨大及植株發(fā)育受淀粉合成代謝的影響[9-12],離不開(kāi)相關(guān)酶的調(diào)控,相關(guān)酶的活性及表達(dá)會(huì)影響淀粉的合成與累積[12]。在淀粉生物合成的相關(guān)酶中,腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(AGPase)作為淀粉合成限速酶調(diào)控淀粉生物合成的第一步,其活性及表達(dá)量對(duì)淀粉的生物合成至關(guān)重要[13-16]。因此,對(duì)AGPase酶活性及其基因的表達(dá)量與淀粉含量的相關(guān)性進(jìn)行研究,探索出的其相關(guān)性可作為前期優(yōu)良品種的鑒定及為后續(xù)分子實(shí)驗(yàn)提供理論基礎(chǔ),有利于促進(jìn)百合種球國(guó)產(chǎn)化?!厩叭搜芯窟M(jìn)展】在東方百合種球鱗莖中,AGPase酶活性與淀粉積累量表現(xiàn)為正相關(guān)[17]。百合AGPase基因RNAi載體構(gòu)建也已有報(bào)道[18]。已有使用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的方法對(duì)蘭州百合籽鱗莖形成發(fā)育過(guò)程中不同時(shí)期淀粉合成相關(guān)酶的基因的研究,結(jié)果表明,與淀粉合成方向相關(guān)的酶,如ADPG焦磷酸化酶(AGPase)、可溶性淀粉合成酶(SSS)、淀粉分支酶(SBE)和顆粒結(jié)合型淀粉合成酶(GBSS)在鱗莖形成和膨大期表現(xiàn)為母鱗片中活性減少,小鱗莖中基因表達(dá)量增加,而裂解方向的淀粉去分支酶(SDBE)在母鱗片中的基因表達(dá)量高于小鱗莖,這說(shuō)明淀粉合成相關(guān)酶與鱗莖的膨大密切相關(guān),并在分子水平上證明了碳水化合物代謝在小鱗莖發(fā)生和發(fā)育中的重要性[19]。針對(duì)食用百合蘭州百合的3個(gè)淀粉合成相關(guān)酶(AGPase、SSS、GBSS)的基因克隆,表達(dá)量分析也已見(jiàn)報(bào)道,研究結(jié)果表明淀粉合成酶對(duì)于百合淀粉積累以及種球膨大發(fā)育具有重要作用[20]?!颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】不同種類百合的AGPase表達(dá)量與淀粉含量的相關(guān)性、不同種類百合的AGPase酶活性與淀粉含量的相關(guān)性以及直接針對(duì)切花種球的相關(guān)研究尚未見(jiàn)報(bào)道?!緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究從AGPase的大小亞基基因AGPS及AGPL作為出發(fā)點(diǎn),克隆并預(yù)測(cè)其結(jié)構(gòu)與功能,并通過(guò)研究其基因表達(dá)的模式,測(cè)定淀粉酶活性,使用皮爾遜相關(guān)性分析最終得出淀粉含量,AGPase酶活性,AGPase亞基基因表達(dá)量之間的相關(guān)性,從而更好的了解百合中淀粉合成的影響因素,若AGPase基因與淀粉合成及淀粉含量正相關(guān),則可作為篩選高淀粉含量百合種質(zhì)的標(biāo)記,為早期快速鑒定百合新種質(zhì)提供新途徑,也可為后續(xù)基因編輯等分子實(shí)驗(yàn)提供理論基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 樣品采集

    本實(shí)驗(yàn)所采取的研究對(duì)象為亞洲百合川百合及東方百合‘白佩琪’。本實(shí)驗(yàn)所采取的百合鱗片均采集自云南大學(xué)農(nóng)學(xué)院溫室。鱗片分為3個(gè)發(fā)育階段取樣:花期即第1朵花開(kāi)后的2 d進(jìn)行采集;倒苗期即地上莖完全枯萎后的第5天進(jìn)行采集;出苗期即第2年鱗莖出芽后的第5天進(jìn)行采集,所有鱗片均采集鱗莖內(nèi)部鱗片。本實(shí)驗(yàn)所采取的葉片為花期的葉片,采集時(shí)間為花開(kāi)后的2 d進(jìn)行采集。采樣時(shí)每個(gè)樣品采集3份百合組織作為生物學(xué)重復(fù)材料。

    1.2 樣品的總RNA提取及cDNA合成

    使用北京擎科生物科技有限公司的多糖多酚植物總RNA提取試劑盒在液氮冷凍的研缽中進(jìn)行RNA的提取,提取鱗片時(shí)使用100 mg材料;提取葉片時(shí),使用200 mg材料。使用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)核酸純度,使用微量紫外分光光度計(jì)測(cè)量濃度,提取后的RNA置于-80 ℃冰箱保存。取1000 ng RNA,使用北京擎科生物科技有限公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行基因組DNA的去除以及反轉(zhuǎn)錄。

    1.3 基因克隆

    以各個(gè)組織的混合樣品提取cDNA作為模板,根據(jù)云南大學(xué)農(nóng)學(xué)院花卉產(chǎn)業(yè)研究中心所測(cè)的轉(zhuǎn)錄組Unigene序列,通過(guò)Blast的方法在nr/nt數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)得到兩類百合的AGPase基因序列信息,設(shè)計(jì)特異性引物(表1)進(jìn)行擴(kuò)增。使用KOD FX酶進(jìn)行克隆,PCR擴(kuò)增體系為20 μL。PCR產(chǎn)物使用1.2%瓊脂糖凝膠電泳,將目的片段膠回收后連接于T載體上,再轉(zhuǎn)化于DH5α大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中,涂布于含卡那霉素抗性的LB平板上。培養(yǎng)24 h后進(jìn)行陽(yáng)性克隆篩選,將陽(yáng)性菌液送到北京擎科生物昆明分公司進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)序所得結(jié)果在NCBI上進(jìn)行CD-search保守結(jié)構(gòu)域分析,在其保守結(jié)構(gòu)域內(nèi)設(shè)計(jì)qPCR引物。

    1.4 qPCR及分析

    使用Primer6軟件(http://www.premierbiosoft.com)進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。設(shè)計(jì)的引物由北京擎科生物科技有限公司進(jìn)行合成(表1)。對(duì)克隆得到的AGPase1 個(gè)小亞基、2 個(gè)大亞基序列進(jìn)行引物設(shè)計(jì),使用設(shè)計(jì)的引物,使用 Takara TB Green?Premix ExTaqTMII 試劑盒(RR820A),以EIF為內(nèi)參基因,對(duì)所有樣品進(jìn)行 qPCR。得到的結(jié)果使用2-ΔΔCT的方法計(jì)算結(jié)果,數(shù)值使用 GraphPad Prism 8.0.1 進(jìn)行分析及作圖。

    表1 引物序列

    1.5 淀粉含量及酶活性的測(cè)定

    使用索萊寶的淀粉含量檢測(cè)試劑盒(BC0700),對(duì)所有材料進(jìn)行淀粉含量的測(cè)定;使用索萊寶的AGP活性檢測(cè)試劑盒(BC0430),對(duì)所有材料進(jìn)行AGPase酶活性的測(cè)定,U為酶活單位,定義為每克組織在反應(yīng)體系中每分鐘催化產(chǎn)生1 nmol 還原型輔酶Ⅱ(NADPH)定義為一個(gè)酶活單位(U)。

    1.6 相關(guān)性分析

    借助R語(yǔ)言,使用R包Hmisc下的rcorr命令進(jìn)行皮爾遜相關(guān)性分析(Pearson correlation analysis),再使用R包c(diǎn)orrplot進(jìn)行可視化展示。對(duì)所有時(shí)期鱗片的AGPase基因相對(duì)表達(dá)量,酶活性及淀粉含量進(jìn)行相關(guān)性分析;葉片由于不是淀粉的貯藏器官,故采用AGPase基因相對(duì)表達(dá)量,酶活性與同時(shí)期的鱗片淀粉含量進(jìn)行相關(guān)性分析。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 AGPase基因克隆

    AGPase是由2個(gè)小亞基基因和2個(gè)大亞基基因組成的異源四聚體,由不同的基因編碼。本次實(shí)驗(yàn)克隆測(cè)序后得到AGPase小亞基基因序列1個(gè),命名為AGPS;大亞基基因2個(gè),分別命名為AGPL1及AGPL2,所得保守結(jié)構(gòu)域見(jiàn)圖1。本次克隆到的2類百合各3個(gè)基因都具有PLN02241超級(jí)家族中的PLN02241家族蛋白結(jié)構(gòu)特征。

    A:亞洲百合川百合小亞基基因AGPS;B:亞洲百合川百合大亞基基因AGPL1;C:亞洲百合川百合大亞基基因AGPL2;D:東方百合‘白佩琪’小亞基基因AGPS;E:東方百合‘白佩琪’大亞基基因AGPL1;F:東方百合‘白佩琪’大亞基基因AGPL2。

    2.2 AGPase相對(duì)表達(dá)量

    通過(guò)對(duì)AGPase的3個(gè)基因序列在兩類百合不同時(shí)期的內(nèi)層鱗片中的表達(dá)量分析表明,大亞基基因在不同百合中表達(dá)趨勢(shì)總體是相似的,但相同的發(fā)育階段,兩類百合的表達(dá)量也呈現(xiàn)出一定差異。小亞基基因在東方百合‘白佩琪’中倒苗期表達(dá)量最高,另外兩個(gè)時(shí)期表達(dá)量較低,但亞洲百合川百合倒苗期表達(dá)量最低,另外兩個(gè)時(shí)期都高于倒苗期且另外兩個(gè)時(shí)期表達(dá)量差異不大??傮w上來(lái)看,大亞基基因的表達(dá)量要高于小亞基基因(圖2~3)。

    bc:出苗期;bh:花期;bd:倒苗期,圖中同一基因不同小寫(xiě)字母表示有顯著性差異(P<0.05),下同。

    cc:出苗期;ch:花期;cd:倒苗期。

    此外,本研究還測(cè)定了花期時(shí)葉片的3個(gè)AGPase亞基基因相對(duì)表達(dá)量,發(fā)現(xiàn)葉片中的大亞基基因表達(dá)量遠(yuǎn)低于內(nèi)層鱗片,亞洲百合川百合及東方百合‘白佩琪’的AGPL1在內(nèi)層鱗片中的表達(dá)量都約為葉片中的3倍;AGPL2在亞洲百合川百合鱗片中約為葉片的40倍,東方百合‘白佩琪’則約為36倍。但小亞基基因的表達(dá)量?jī)深惏俸铣尸F(xiàn)不同的趨勢(shì),亞洲百合川百合小亞基基因的表達(dá)量鱗片中約為葉片的一半,而東方百合‘白佩琪’鱗片則是葉片的2倍左右。

    2.3 兩類百合的淀粉含量

    由圖4可知,不同種類的百合鱗片在發(fā)育過(guò)程中的變化趨勢(shì)一致,但是東方百合‘白佩琪’僅花期含量比亞洲百合川百合高,其余時(shí)期都是亞洲百合川百合淀粉含量更高。同一時(shí)期(花期)不同組織的淀粉含量(圖5)表明,葉片的淀粉含量相對(duì)鱗片低很多,且在該時(shí)期,東方百合‘白佩琪’的葉片及鱗片淀粉含量都高于亞洲百合川百合。

    圖5 兩種百合葉片和鱗片在同一時(shí)期(花期)的淀粉含量

    2.4 兩類百合AGPase酶活性

    由圖6可知,不同種類的百合鱗片在發(fā)育過(guò)程中的酶活性變化趨勢(shì)一致,但是東方百合‘白佩琪’僅倒苗期活性比亞洲百合川百合高,其余時(shí)期均是亞洲百合川百合酶活性更高。

    圖6 兩類百合不同時(shí)期內(nèi)層鱗片中的AGPase酶活性

    由圖7可知,葉片的酶活性相對(duì)鱗片都很高,且在該時(shí)期,東方百合‘白佩琪’的葉片及鱗片的酶活性都高于亞洲百合川百合。

    圖7 兩種百合葉片和鱗片在同一時(shí)期(花期)的AGPase酶活性

    2.5 百合淀粉含量與AGPase酶活性、AGPase基因表達(dá)間的相關(guān)性分析

    2.5.1 百合鱗莖的AGPase基因、酶活性、淀粉含量的相關(guān)性 相關(guān)性分析(圖8)表明,百合鱗莖的淀粉含量與AGPase酶活性及AGPS基因表達(dá)量高度線性正相關(guān),相關(guān)系數(shù)分別為0.90及0.71。由此可以得出,酶活性及AGPS表達(dá)量都與淀粉含量正相關(guān)。

    圖中*表示有顯著性差異(P<0.05),下同。

    2.5.2 百合葉片的AGPase基因、酶活性、同時(shí)期鱗片淀粉含量的相關(guān)性 葉片相關(guān)性分析(圖9)表明,葉片中3個(gè)AGPase基因之間都高度線性正相關(guān),相關(guān)系數(shù)分別為0.96,0.89,0.92,這與鱗片中的3個(gè)基因的相關(guān)性模式不同,說(shuō)明這3個(gè)基因在葉片中與在鱗片中可能存在不同的協(xié)同表達(dá)模式。此外,葉片中AGPase基因表達(dá)量與鱗片淀粉含量相關(guān)性不顯著。

    圖9 葉片3個(gè)AGPase基因表達(dá)量及酶活性與同時(shí)期鱗片淀粉含量間的相關(guān)性分析

    3 討 論

    本次克隆得到的亞洲百合川百合和東方百合‘白佩琪’的3個(gè)AGPase基因序列相似度都在95%以上。此外,本次克隆得到的AGPase基因序列均用Blast進(jìn)行了驗(yàn)證,結(jié)果表明,所克隆到的基因與前人在蘭州百合中所克隆基因序列相似度在90%以上[19]。由此可見(jiàn),不同百合中AGPase相同亞基基因相對(duì)比較穩(wěn)定保守。

    本次所測(cè)淀粉含量及酶活性表明,不同類型百合的淀粉含量雖然有差異,但總體差別不大,與蘭州百合及亞洲百合各發(fā)育時(shí)期總碳水化合物變化的趨勢(shì)大體上也是一致的[21]。新鐵炮百合的研究結(jié)果表示,在開(kāi)花前植株鱗莖的淀粉積累達(dá)到最大值,而后淀粉含量開(kāi)始下降[13],然而本實(shí)驗(yàn)均在倒苗期淀粉含量最高,這一點(diǎn)契合孫紅梅等[21]在之前研究中提出的不同種類百合鱗莖發(fā)育過(guò)程中淀粉積累及轉(zhuǎn)化的趨勢(shì)不完全相同這一結(jié)論。

    本次表達(dá)量分析中發(fā)現(xiàn)兩類百合小亞基基因AGPS的表達(dá)量相較于大亞基基因AGPL1和AGPL2更低,這與蘭州百合的小鱗莖發(fā)過(guò)程中這3個(gè)基因的表達(dá)量結(jié)果相一致[19]。水稻在不同溫度處理下的相對(duì)表達(dá)量結(jié)果也表明,大部分時(shí)期小亞基基因的表達(dá)量都要低于大亞基基因[23]。根據(jù)本次相關(guān)性分析,小亞基基因AGPS表達(dá)量與淀粉累積正相關(guān),故猜測(cè)這種現(xiàn)象或許是因?yàn)樾喕蛑苯有惺勾x功能而大亞基基因承擔(dān)小亞基基因代謝活性的調(diào)控[24],所以在淀粉合成旺盛的時(shí)期小亞基基因才高度表達(dá),而大亞基基因每個(gè)時(shí)期都在表達(dá)。造成表達(dá)量差異的具體原因是否與猜測(cè)想符合,還需要進(jìn)一步研究證實(shí)。

    相關(guān)性分析結(jié)果表明,AGPase小亞基基因的表達(dá)量與百合淀粉含量及酶活性都表現(xiàn)出正相關(guān),說(shuō)明小亞基基因是影響AGPase活性及淀粉合成的關(guān)鍵因子。此外,葉片的酶活性也可以直接影響鱗片淀粉含量,這說(shuō)明鱗莖作為庫(kù)器官,其貯藏的淀粉除了自身合成外,還有很重要的一部分來(lái)自其他源器官。鱗片和葉片中AGPase基因之間的相關(guān)性呈現(xiàn)較大差異,這與玉米中同一AGPase基因不同部位,不同時(shí)間的表達(dá)差異性很大這一結(jié)果一致[25];與小麥中不同亞基基因存在組織特異性表達(dá)這一結(jié)果也一致[26],故可以推測(cè)百合AGPase不同亞基基因可能也存在組織特異性表達(dá)。

    綜上所述,本研究說(shuō)明亞洲百合川百合和東方百合‘白佩琪’的AGPase基因序列,表達(dá)模式、AGPase酶活性、鱗片淀粉含量等除了小亞基基因表達(dá)模式存在差異外都很相似,故不同類型的百合在對(duì)AGPase進(jìn)行研究時(shí)應(yīng)可參考或直接使用一些其他百合中的相關(guān)結(jié)論。此外,AGPase大小亞基基因表達(dá)量差異及二者的相互作用等在百合中研究較少,值得進(jìn)行深入研究以探明AGPase調(diào)控淀粉合成從而影響種球膨大的基因機(jī)理。另外,相關(guān)性分析的結(jié)果為鱗莖的繁育提供了可通過(guò)調(diào)節(jié)淀粉合成限速酶小亞基基因表達(dá)及調(diào)節(jié)其酶活性以促進(jìn)百合鱗莖膨大的實(shí)踐思路。

    4 結(jié) 論

    本研究通過(guò)對(duì)東方百合‘白佩琪’及亞洲百合川百合的AGPase基因的克隆及qPCR、淀粉含量及酶活性的測(cè)定得到這兩類百合AGPase基因序列,表達(dá)量,不同時(shí)期淀粉含量及AGPase酶活性以及在兩類百合中的異同。兩類百合不同時(shí)期的淀粉含量及酶活性變化趨勢(shì)相同,但同一發(fā)育時(shí)期不同類型百合的淀粉含量及酶活性存在差異。兩類百合大小亞基基因的表達(dá)量在鱗莖不同時(shí)期的表達(dá)模式是相似的,但同一發(fā)育時(shí)期不同類型百合的表達(dá)量存在差異。AGPase小亞基基因的表達(dá)量與淀粉含量正相關(guān)。

    猜你喜歡
    鱗莖鱗片亞基
    百合
    心臟鈉通道β2亞基轉(zhuǎn)運(yùn)和功能分析
    金錢龍
    沒(méi)有腳也能走路的蛇
    鱗片辨年齡
    小布老虎(2016年18期)2016-12-01 05:47:34
    百合小鱗莖抽薹的差異蛋白質(zhì)組學(xué)分析
    2種百合科植物離體鱗莖誘導(dǎo)
    胰島素通過(guò)mTORC2/SGK1途徑上調(diào)肺泡上皮鈉通道α亞基的作用機(jī)制
    快樂(lè)為什么那么快
    江南詩(shī)(2015年3期)2015-06-01 17:24:36
    伊犁貝母鱗莖中非生物堿化學(xué)成分的研究
    中成藥(2014年9期)2014-02-28 22:28:55
    日韩视频在线欧美| 亚洲国产欧美一区二区综合| 亚洲美女黄色视频免费看| 亚洲一码二码三码区别大吗| 十分钟在线观看高清视频www| 男女国产视频网站| av电影中文网址| 欧美日韩亚洲高清精品| 人妻 亚洲 视频| 国产在线视频一区二区| 国产 一区精品| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 国产精品三级大全| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 精品一区二区三区av网在线观看 | 精品人妻一区二区三区麻豆| 精品少妇黑人巨大在线播放| 街头女战士在线观看网站| √禁漫天堂资源中文www| 91精品伊人久久大香线蕉| 亚洲国产精品成人久久小说| 欧美黑人精品巨大| 中文字幕人妻丝袜制服| 亚洲伊人久久精品综合| 91精品三级在线观看| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 男女边吃奶边做爰视频| 黄色视频在线播放观看不卡| 国产一区有黄有色的免费视频| 国产成人精品福利久久| 一区在线观看完整版| 中文字幕色久视频| 老司机影院成人| 久久久久久久国产电影| 国产一卡二卡三卡精品 | 午夜日本视频在线| 日韩av免费高清视频| 欧美人与性动交α欧美软件| 97在线人人人人妻| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 国产一区二区三区av在线| svipshipincom国产片| av女优亚洲男人天堂| 高清在线视频一区二区三区| 国产精品香港三级国产av潘金莲 | 伊人亚洲综合成人网| 国产一区二区在线观看av| 我的亚洲天堂| xxxhd国产人妻xxx| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 欧美精品av麻豆av| 亚洲欧美一区二区三区国产| 欧美黄色片欧美黄色片| 黄片无遮挡物在线观看| 日日爽夜夜爽网站| 免费看av在线观看网站| 亚洲精华国产精华液的使用体验| 日本色播在线视频| 精品少妇久久久久久888优播| 超碰97精品在线观看| 欧美黑人精品巨大| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 青青草视频在线视频观看| 久久久久精品性色| 乱人伦中国视频| 天天影视国产精品| 新久久久久国产一级毛片| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 亚洲精品国产区一区二| 欧美亚洲日本最大视频资源| 99热全是精品| 在现免费观看毛片| 五月天丁香电影| 国产精品熟女久久久久浪| 精品久久久精品久久久| 久久精品久久精品一区二区三区| 夫妻午夜视频| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 看非洲黑人一级黄片| 日韩精品有码人妻一区| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 国产亚洲午夜精品一区二区久久| 91精品国产国语对白视频| 国产精品一二三区在线看| 亚洲少妇的诱惑av| 午夜福利,免费看| 国产精品久久久久久人妻精品电影 | 人人妻人人澡人人看| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 国产精品三级大全| 亚洲精品久久午夜乱码| 狂野欧美激情性bbbbbb| 免费黄网站久久成人精品| 国产乱人偷精品视频| 自线自在国产av| 18禁国产床啪视频网站| 女性生殖器流出的白浆| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 免费av中文字幕在线| 少妇 在线观看| 精品一区二区三卡| 黄片无遮挡物在线观看| 99香蕉大伊视频| 18在线观看网站| 最近中文字幕2019免费版| 国产在线免费精品| 欧美激情高清一区二区三区 | 制服诱惑二区| 久久韩国三级中文字幕| av在线app专区| 免费看不卡的av| 交换朋友夫妻互换小说| 男女国产视频网站| 丝袜在线中文字幕| 欧美日韩综合久久久久久| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 国产免费一区二区三区四区乱码| 伊人久久国产一区二区| 亚洲七黄色美女视频| 欧美少妇被猛烈插入视频| 九色亚洲精品在线播放| 亚洲男人天堂网一区| 久久99精品国语久久久| 一级片'在线观看视频| 亚洲欧美一区二区三区国产| kizo精华| 美女主播在线视频| 99热网站在线观看| 黄色视频在线播放观看不卡| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 欧美精品av麻豆av| 国产深夜福利视频在线观看| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 精品久久久久久电影网| www日本在线高清视频| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 亚洲第一青青草原| 街头女战士在线观看网站| 制服人妻中文乱码| a 毛片基地| 青春草视频在线免费观看| 久久国产精品大桥未久av| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 美女国产高潮福利片在线看| 久久久精品免费免费高清| 亚洲国产欧美一区二区综合| 国产成人av激情在线播放| 99久久综合免费| 久久久国产欧美日韩av| 欧美激情高清一区二区三区 | 97精品久久久久久久久久精品| 老汉色∧v一级毛片| 亚洲久久久国产精品| 亚洲av国产av综合av卡| 午夜激情久久久久久久| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 热99国产精品久久久久久7| 热99久久久久精品小说推荐| 亚洲精品,欧美精品| 男女边吃奶边做爰视频| 亚洲专区中文字幕在线 | 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 亚洲精品国产av蜜桃| av有码第一页| 大片电影免费在线观看免费| 男人舔女人的私密视频| 男女之事视频高清在线观看 | 婷婷色麻豆天堂久久| 激情五月婷婷亚洲| 婷婷成人精品国产| 国产在线免费精品| 18在线观看网站| 少妇人妻久久综合中文| 天美传媒精品一区二区| 日韩制服丝袜自拍偷拍| 久久精品国产亚洲av高清一级| 亚洲国产中文字幕在线视频| 亚洲av成人不卡在线观看播放网 | 天天影视国产精品| 免费在线观看黄色视频的| 卡戴珊不雅视频在线播放| 熟妇人妻不卡中文字幕| 亚洲国产欧美一区二区综合| 久久综合国产亚洲精品| 欧美 日韩 精品 国产| 久久女婷五月综合色啪小说| www.精华液| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 国产成人精品久久久久久| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 国产免费一区二区三区四区乱码| 妹子高潮喷水视频| av在线app专区| 久久久欧美国产精品| 国产精品一区二区在线观看99| 欧美最新免费一区二区三区| 国产成人精品无人区| 街头女战士在线观看网站| 国产麻豆69| 亚洲成国产人片在线观看| xxxhd国产人妻xxx| 日本欧美国产在线视频| 一区二区三区激情视频| 极品少妇高潮喷水抽搐| 大香蕉久久网| svipshipincom国产片| 性色av一级| 伦理电影大哥的女人| 亚洲av中文av极速乱| 久久热在线av| 亚洲欧美色中文字幕在线| av网站免费在线观看视频| av天堂久久9| 18禁观看日本| 中文天堂在线官网| 美女福利国产在线| 1024香蕉在线观看| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 国产成人精品福利久久| 欧美精品一区二区免费开放| 国产精品99久久99久久久不卡 | 啦啦啦中文免费视频观看日本| 日日啪夜夜爽| 欧美日韩福利视频一区二区| 欧美国产精品va在线观看不卡| tube8黄色片| 中文天堂在线官网| 丝袜美足系列| 久久精品国产亚洲av涩爱| 最新在线观看一区二区三区 | 啦啦啦啦在线视频资源| 亚洲av日韩精品久久久久久密 | 国产精品一国产av| 热99国产精品久久久久久7| kizo精华| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 老司机在亚洲福利影院| 叶爱在线成人免费视频播放| 夫妻午夜视频| 熟妇人妻不卡中文字幕| 婷婷色麻豆天堂久久| 天美传媒精品一区二区| 国产成人系列免费观看| 国产精品无大码| av国产久精品久网站免费入址| 丝袜喷水一区| 欧美日韩一级在线毛片| 热99国产精品久久久久久7| 黄片小视频在线播放| 国产成人精品久久二区二区91 | 一级a爱视频在线免费观看| 国产精品久久久人人做人人爽| 亚洲av中文av极速乱| 看免费av毛片| 日韩精品免费视频一区二区三区| 亚洲免费av在线视频| 黄色视频在线播放观看不卡| 亚洲人成77777在线视频| 成人三级做爰电影| 韩国精品一区二区三区| 欧美日韩成人在线一区二区| 国产 精品1| www.av在线官网国产| 久久久精品94久久精品| 在线观看人妻少妇| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 国产片内射在线| 又黄又粗又硬又大视频| 亚洲av日韩精品久久久久久密 | 国产欧美亚洲国产| 色精品久久人妻99蜜桃| 少妇的丰满在线观看| 亚洲精品国产av成人精品| 韩国高清视频一区二区三区| 亚洲,欧美,日韩| 日本av免费视频播放| 91精品国产国语对白视频| 在线亚洲精品国产二区图片欧美| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀 | 九九爱精品视频在线观看| 十八禁网站网址无遮挡| 久久精品亚洲av国产电影网| 久久久久国产一级毛片高清牌| 日韩欧美精品免费久久| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 国产爽快片一区二区三区| 国产伦理片在线播放av一区| 精品免费久久久久久久清纯 | 美女福利国产在线| 欧美精品高潮呻吟av久久| 国产av精品麻豆| 国产成人91sexporn| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 18禁观看日本| 五月开心婷婷网| 中文欧美无线码| 久久久精品94久久精品| 亚洲精品国产区一区二| 在线精品无人区一区二区三| 日本av免费视频播放| 观看美女的网站| 老汉色∧v一级毛片| tube8黄色片| 日韩av在线免费看完整版不卡| 国产精品欧美亚洲77777| 黄色视频在线播放观看不卡| 精品人妻在线不人妻| 中文欧美无线码| 两个人看的免费小视频| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 国产av一区二区精品久久| 日韩人妻精品一区2区三区| 成年女人毛片免费观看观看9 | 久久精品久久久久久久性| 午夜免费男女啪啪视频观看| 美女大奶头黄色视频| 国产精品亚洲av一区麻豆 | 亚洲三区欧美一区| 日本91视频免费播放| 人体艺术视频欧美日本| 午夜老司机福利片| 在现免费观看毛片| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 五月开心婷婷网| 亚洲国产av新网站| 午夜日韩欧美国产| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 看免费成人av毛片| 亚洲天堂av无毛| 中文字幕高清在线视频| 丰满饥渴人妻一区二区三| 国产成人系列免费观看| 欧美激情极品国产一区二区三区| 国产精品国产三级专区第一集| 免费av中文字幕在线| 97精品久久久久久久久久精品| 考比视频在线观看| 国产男女超爽视频在线观看| av又黄又爽大尺度在线免费看| 亚洲综合精品二区| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 99精国产麻豆久久婷婷| 精品午夜福利在线看| 9191精品国产免费久久| 人人妻,人人澡人人爽秒播 | 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 亚洲国产看品久久| 成人亚洲欧美一区二区av| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 久久 成人 亚洲| 久久久久久久国产电影| 国产淫语在线视频| 国产精品一国产av| 看免费av毛片| 熟妇人妻不卡中文字幕| 欧美激情高清一区二区三区 | 热re99久久精品国产66热6| 亚洲男人天堂网一区| 大香蕉久久成人网| 精品第一国产精品| 午夜激情av网站| 91精品三级在线观看| 99香蕉大伊视频| 在线观看免费高清a一片| 国产日韩欧美亚洲二区| 最近中文字幕2019免费版| 电影成人av| 亚洲精品乱久久久久久| 老司机亚洲免费影院| 嫩草影视91久久| 最近最新中文字幕大全免费视频 | 亚洲人成电影观看| 激情五月婷婷亚洲| 久久精品久久久久久久性| 亚洲,欧美,日韩| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o | 亚洲人成电影观看| 久久久久人妻精品一区果冻| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 亚洲人成77777在线视频| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 最近2019中文字幕mv第一页| 99国产精品免费福利视频| 视频区图区小说| 高清欧美精品videossex| 欧美变态另类bdsm刘玥| 91国产中文字幕| 2021少妇久久久久久久久久久| 考比视频在线观看| 91国产中文字幕| 美女福利国产在线| 性色av一级| 欧美激情高清一区二区三区 | 女的被弄到高潮叫床怎么办| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀 | 男女之事视频高清在线观看 | 亚洲av日韩在线播放| 国产男女内射视频| 国产精品一二三区在线看| 国产成人一区二区在线| 交换朋友夫妻互换小说| 国产精品女同一区二区软件| 蜜桃国产av成人99| 亚洲av日韩精品久久久久久密 | 欧美黑人精品巨大| 91国产中文字幕| 一区二区三区乱码不卡18| 国产成人系列免费观看| 美女主播在线视频| 天天躁日日躁夜夜躁夜夜| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 超色免费av| 国产免费视频播放在线视频| 亚洲国产精品国产精品| 天堂中文最新版在线下载| 激情五月婷婷亚洲| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 亚洲人成77777在线视频| 国产视频首页在线观看| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 最近中文字幕2019免费版| 街头女战士在线观看网站| 国产一区二区 视频在线| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 大话2 男鬼变身卡| 伦理电影免费视频| 美女视频免费永久观看网站| 亚洲七黄色美女视频| 天堂8中文在线网| 乱人伦中国视频| 日韩人妻精品一区2区三区| 日韩成人av中文字幕在线观看| 亚洲少妇的诱惑av| 久久久久久久久久久久大奶| 丰满迷人的少妇在线观看| 成年av动漫网址| 久久久久精品人妻al黑| 久久久精品94久久精品| av线在线观看网站| 国产成人精品无人区| 久久97久久精品| 男人舔女人的私密视频| 电影成人av| 久久97久久精品| 精品一区二区三卡| 99国产综合亚洲精品| 国产精品 欧美亚洲| 中文字幕制服av| 精品福利永久在线观看| 久久99热这里只频精品6学生| 在线观看人妻少妇| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 少妇被粗大猛烈的视频| 欧美精品亚洲一区二区| 欧美最新免费一区二区三区| 精品国产露脸久久av麻豆| 一级毛片 在线播放| 少妇人妻精品综合一区二区| 欧美黑人欧美精品刺激| 爱豆传媒免费全集在线观看| 久久久久久免费高清国产稀缺| 亚洲欧美精品自产自拍| 中国国产av一级| 丝袜喷水一区| 丝袜人妻中文字幕| 精品少妇内射三级| 精品一品国产午夜福利视频| 日本一区二区免费在线视频| 在线免费观看不下载黄p国产| 丝袜美腿诱惑在线| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 午夜免费观看性视频| 精品国产一区二区久久| 黄色视频在线播放观看不卡| 中文字幕人妻丝袜制服| 校园人妻丝袜中文字幕| 久久狼人影院| 最黄视频免费看| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 久久av网站| 成年女人毛片免费观看观看9 | 99国产精品免费福利视频| 少妇的丰满在线观看| 麻豆乱淫一区二区| 大话2 男鬼变身卡| 国产免费视频播放在线视频| 久久天堂一区二区三区四区| 国产男人的电影天堂91| 高清在线视频一区二区三区| 99热国产这里只有精品6| 另类精品久久| 久久久精品免费免费高清| 精品久久蜜臀av无| 亚洲欧美色中文字幕在线| 国产成人欧美在线观看 | 又黄又粗又硬又大视频| 欧美日韩综合久久久久久| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 啦啦啦 在线观看视频| 色视频在线一区二区三区| 国产精品久久久人人做人人爽| 国产成人啪精品午夜网站| 欧美在线黄色| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 亚洲av在线观看美女高潮| 亚洲av国产av综合av卡| 精品久久久精品久久久| 亚洲男人天堂网一区| 午夜久久久在线观看| 国产日韩欧美在线精品| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 亚洲欧美激情在线| 欧美激情高清一区二区三区 | 丰满饥渴人妻一区二区三| 久久免费观看电影| 午夜福利影视在线免费观看| 国产伦理片在线播放av一区| 国产极品粉嫩免费观看在线| 在线 av 中文字幕| 性高湖久久久久久久久免费观看| 国产99久久九九免费精品| 少妇被粗大的猛进出69影院| 国产成人免费观看mmmm| 日本欧美国产在线视频| 波野结衣二区三区在线| 国产av国产精品国产| 欧美av亚洲av综合av国产av | 天天躁日日躁夜夜躁夜夜| 高清视频免费观看一区二区| 伦理电影免费视频| 国产成人系列免费观看| 少妇人妻 视频| 国产精品久久久久久精品古装| 亚洲av欧美aⅴ国产| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 赤兔流量卡办理| 爱豆传媒免费全集在线观看| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o | 亚洲成国产人片在线观看| 晚上一个人看的免费电影| 在线看a的网站| 黑人猛操日本美女一级片| 欧美变态另类bdsm刘玥| 狂野欧美激情性xxxx| 亚洲av在线观看美女高潮| 一区在线观看完整版| 亚洲精品成人av观看孕妇| 十八禁人妻一区二区| 欧美日韩精品网址| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 青青草视频在线视频观看| 午夜福利一区二区在线看| 国产一区二区在线观看av| 伊人久久国产一区二区| 中文字幕人妻熟女乱码| 天堂俺去俺来也www色官网| 男女下面插进去视频免费观看| 午夜激情av网站| 永久免费av网站大全| 天天躁日日躁夜夜躁夜夜| 久久久久精品人妻al黑| 成人三级做爰电影| 国产精品香港三级国产av潘金莲 | av网站在线播放免费| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 大香蕉久久成人网| 亚洲欧美精品综合一区二区三区| 制服丝袜香蕉在线| 好男人视频免费观看在线| 18禁国产床啪视频网站| 一本色道久久久久久精品综合| 亚洲美女搞黄在线观看| av免费观看日本| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 国产伦人伦偷精品视频| 亚洲综合精品二区| 欧美日韩综合久久久久久| 中文字幕高清在线视频| 亚洲精品美女久久av网站| 夫妻午夜视频| 男女床上黄色一级片免费看| 亚洲色图综合在线观看| 亚洲人成77777在线视频| 日本欧美国产在线视频| 美女大奶头黄色视频| 妹子高潮喷水视频| 又大又爽又粗| 99热全是精品| 国产 一区精品| 日韩中文字幕欧美一区二区 | 久久久久久免费高清国产稀缺| 99香蕉大伊视频| 晚上一个人看的免费电影| 国产精品成人在线| 久久人人爽人人片av| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 少妇的丰满在线观看| 极品少妇高潮喷水抽搐| 免费不卡黄色视频| 91精品伊人久久大香线蕉| 99国产精品免费福利视频| 亚洲av成人精品一二三区| 又黄又粗又硬又大视频| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 天天躁日日躁夜夜躁夜夜| 捣出白浆h1v1| 91精品国产国语对白视频| 亚洲成色77777|