鈦表面不同去污方式的體外效果比較

葛曉彤，葉慶元，王津津，張曦戈，王埡錚，王曉雨，冀吉昀，王勤濤

1.軍事口腔醫(yī)學國家重點實驗室，國家口腔疾病臨床醫(yī)學研究中心，陜西省口腔生物工程技術研究中心，空軍軍醫(yī)大學口腔醫(yī)院牙周病科，陜西西安（710032）；2.軍事口腔醫(yī)學國家重點實驗室，國家口腔疾病臨床醫(yī)學研究中心，陜西省口腔疾病臨床醫(yī)學研究中心，空軍軍醫(yī)大學口腔醫(yī)院數(shù)字化口腔醫(yī)學中心，陜西西安（710032）

隨著口腔種植修復治療技術的不斷發(fā)展，影響種植體長期穩(wěn)定性的生物學并發(fā)癥成為當代口腔醫(yī)學的一個重要課題［1］。種植體生物學并發(fā)癥主要指種植體周圍病，包括種植體周圍黏膜炎和種植體周圍炎。種植體周圍黏膜炎是指沒有支持骨或沒有持續(xù)性邊緣骨喪失的種植體周圍軟組織的炎癥性病變［2］，是程度較輕的種植體周圍疾?。欢N植體周圍炎以種植體周圍結(jié)締組織的炎癥及支持骨組織的進行性吸收為特征［3］，往往導致種植體預后不佳；一項meta 分析顯示，種植體周圍黏膜炎的患病率為23.9% ～ 88.0%，種植體周圍炎患病率為8.9%～45%［4］，這一方面表明種植體周圍病的患病率較高，另一方面也表明因不同人群、檢測標準、主客觀條件等影響其差異較大。Monje 等［5］的一項橫斷面研究發(fā)現(xiàn)，在種植后平均46 個月的治療隨訪期中，堅持進行維護治療的患者比依從性差的患者被診斷為種植體周圍炎的可能性更小。因此，菌斑控制是預防和治療種植體周圍病的關鍵［6］。

種植體周的菌斑主要由革蘭陽性需氧菌和革蘭陰性厭氧菌等組成，當種植體周圍組織存在炎癥時，厭氧菌明顯增多［7］。此外，細菌定植主要與種植體表面特性有關［8］，因此，探索種植體表面清潔去污方式是否會改變種植體表面特性從而影響細菌黏附對于控制種植體早期黏膜炎癥以及加強日常定期維護尤為重要。目前治療種植體周圍病的方法主要分為非手術治療和手術治療，非手術治療包括機械清創(chuàng)、噴砂處理、激光治療、光動力療法等。然而，上述治療方式是否改變種植體表面特性及后續(xù)細菌黏附數(shù)量仍需要更多研究，目前種植體周圍病的處理仍缺乏公認的標準化治療方案。本實驗擬通過評估光動力療法、齦下噴砂以及鈦刮匙3 種目前常用的去污清潔方式對種植體鈦材表面特性的影響，并進行細菌清除效率及后期細菌再次黏附的比較，為臨床預防及治療種植體周圍病提供實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 主要試劑及儀器

牙齦卟啉單胞菌（Porphyromonas gingivalis，Pg）（ATCC33277，空軍軍醫(yī)大學口腔醫(yī)院微生物實驗室）；具核梭桿菌（Fusobacterium nucleatum，F(xiàn)n）（ATCC10953，空軍軍醫(yī)大學口腔醫(yī)院微生物實驗室）；純鈦試件（10 mm × 10 mm × 1.5 mm，弘森，中國）；厭氧產(chǎn)氣袋（MGC，日本）；腦心浸出液（BHI）培養(yǎng)基（海博，中國）；脫纖維羊血（鴻泉，中國）；氯化血紅素（海博，中國）；維生素K1（海博，中國）；活/死菌染色試劑盒（LIVE/DEAD BacLightTML7012，Invitrogen，美國）。恒溫培養(yǎng)箱（IFA-32-8，ESCO，新加坡）；生物安全柜（CB 800 V，蘇潔，蘇州）；原子力顯微鏡（5500，Keysight，中國），接觸角測量儀（DSA25，Kruss，德國）；場發(fā)射掃描電鏡（S4800，日立，日本）；激光共聚焦顯微鏡（FV3000，Olympus，日本）；酶標儀（Infinite200，Tecan，瑞士）；光動力儀（HHL-1000，Periowave，中國）；噴砂機（FT-200，EMS，瑞士）；鈦刮匙（IMPLG1/2T，Hu-Friedy，美國）。

1.2 試樣處理及制備

將純鈦鈦片依次使用800、1 200、1 500、2 000、3 000、5 000、7 000 目砂紙逐級打磨拋光至光滑鏡面，使用丙酮、無水乙醇、去離子水依次超聲蕩洗15 min，干燥消毒備用。

1.3 細菌培養(yǎng)和菌液準備

將Pg和Fn分別接種于BHI培養(yǎng)基中（每100 mL培養(yǎng)基中含BHI 5.2 g，脫纖維羊血10 mL，氯化血紅素0.5 mL，維生素K 100 μL），37 ℃厭氧培養(yǎng)48 h，利用比濁儀測定細菌光密度值，倍比稀釋至107CFU/mL。將無菌鈦試樣放入24 孔板中，分別將稀釋后的Pg菌液和Fn菌液接種于材料表面（1 mL/孔），置于37 ℃恒溫箱中厭氧培養(yǎng)48 h。

1.4 實驗分組

將24 孔板中鈦試樣使用PBS 緩沖液沖洗3 次，隨機分為4 組，每組每種菌12 個試樣，處理組按以下方式進行清潔和器械處理，所有操作均由同一名實驗員進行。①鈦刮匙組（titanium curette，TiC）：使用鈦刮匙刮除鈦片表面細菌，力量與去除天然牙表面牙石相當（約20 ～ 25 g），作用60 s；②光動力組（photodynamic，PTD）：鈦片表面注射光敏劑1.5 μL，導光頭呈15 °照射60 s；③噴砂組（sandblasting，SB）：使用perio 模式，功率及水位調(diào)節(jié)至“Max”，距離鈦片表面約2 mm，作用30 s［9-10］；④對照組（NC）：表面不作任何去污處理。

1.5 鈦試樣表征

1.5.1 原子力顯微鏡測量粗糙度 每組每種菌任選3 個試樣臨界點干燥，利用原子力顯微鏡測量試樣表面粗糙度，每個試樣任取3 個測試點，結(jié)果取均值。

1.5.2 接觸角測量儀測量接觸角 每組每種菌任選3 個試樣臨界點干燥，濕度45%條件下，每次滴加2 μL 超純水于試樣上，待液滴形態(tài)趨于穩(wěn)定，利用接觸角測量儀測量水滴與試樣表面間的接觸角。每個試樣任取3 個測試點，結(jié)果取均值。

1.6 細菌黏附檢測

1.6.1 掃描電鏡觀察去污后的鈦表面形貌和細菌黏附形態(tài) 每組每種菌任選3 個試樣移至無菌24 孔板，2.5%戊二醛溶液固定4 h，PBS 沖洗，梯度乙醇（30%、50%、70%、90%、95%、100%）脫水，每個梯度7 min。干燥、噴金后置于掃描電鏡下觀察。1.6.2 活/死菌染色法觀察細菌活性 每組每種菌任選3 個試樣移至無菌24 孔板，參照微生物細胞活性檢測試劑盒說明書，配制檢測試劑，將試劑加入放置試樣的24 孔板中避光孵育15 min 后吸出，即刻置于激光共聚焦顯微鏡下拍攝熒光圖像，使用Image J 軟件將熒光圖像轉(zhuǎn)換成灰度圖，設定分析參數(shù)后獲得Mean（熒光強度）值。

1.7 細菌再黏附實驗

將實驗1.4 中去污處理后的鈦試樣放入2 mL PBS 中使用震蕩機震蕩5 min，丙酮、無水乙醇、去離子水依次超聲蕩洗15 min，高壓滅菌后分組放入24 孔板中，再次接種Pg菌液和Fn菌液（1 mL/孔），濃度為107CFU/mL，置于37 ℃恒溫箱中厭氧培養(yǎng)48 h 后按方法1.6 進行實驗，每組每種菌任選3 個試樣，重復3 次。

1.8 統(tǒng)計學分析

使用SPSS19.0 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析，檢測各組數(shù)據(jù)均符合正態(tài)性，采用單因素方差分析比較不同組間整體差異，經(jīng)Levene’s 方差齊性檢驗，方差齊性者采用Bonferroni 進行兩兩分析比較，若方差不齊者，采用Tamhane’s T2 進行兩兩分析比較，檢測水準為雙側(cè)α=0.05。

2 結(jié) 果

2.1 鈦試樣經(jīng)去污處理后表面粗糙度及接觸角比較

原子力顯微鏡觀測結(jié)果顯示，鈦刮匙組表面刮痕明顯，粗糙度顯著高于對照組、光動力組及噴砂組（P＜0.05），對照組、光動力組及噴砂組組間差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）（圖1）。接觸角測量結(jié)果顯示，各處理組表面接觸角均小于對照組，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（圖2）。

Figure 1 Surface roughness change of titanium surfaces observed under atomic force microscopy after different decontamination treatments圖1 原子力顯微鏡下觀測經(jīng)不同去污處理后鈦試樣表面粗糙度改變

2.2 鈦試樣經(jīng)去污處理后掃描電鏡及熒光染色分析

掃描電鏡結(jié)果顯示，對照組鈦試樣表面細菌數(shù)量較多，且細菌相對集中，光動力組、噴砂組、鈦刮匙組表面細菌散落分布，數(shù)量較少，且光動力組表面大部分細菌菌體破裂（圖3a）。在激光共聚焦顯微鏡下觀察各組鈦試樣表面黏附活菌量、死菌量及黏附總量用平均熒光強度，對照組表面視野內(nèi)有大片被熒光標記的活菌，光動力組表面死菌比例顯著高于對照組及噴砂組、鈦刮匙組，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），噴砂組和鈦刮匙組表面剩余細菌以活菌為主，噴砂組表面細菌黏附量與對照組及光動力組、鈦刮匙組相比顯著減少，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（圖3b～3d）。

Figure 3 Comparison of the remaining bacterial adhesion morphology and the number of live/dead bacteria on the titanium surfaces after different decontamination treatments圖3 經(jīng)不同去污處理后鈦試樣表面剩余細菌黏附形態(tài)及活/死菌數(shù)量比較

2.3 鈦試樣表面細菌再黏附的掃描電鏡及熒光染色分析

掃描電鏡結(jié)果顯示，鈦刮匙組表面牙齦卟啉單胞菌有聚集現(xiàn)象（圖4a）。在激光共聚焦顯微鏡下觀察，鈦刮匙組表面細菌黏附量顯著高于對照組及其余處理組，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），光動力組表面黏附死菌比例顯著高于對照組及其余處理組，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（圖4b～4d）。

Figure 4 Comparison of bacterial re-adhesion morphology and the number of live/dead bacteria on the titanium surfaces after different decontamination treatments圖4 經(jīng)不同去污處理后鈦試樣表面細菌再黏附形態(tài)及活/死菌數(shù)量比較

3 討 論

種植體周圍病是導致種植失敗的重要因素之一，有學者通過20 年隨訪的縱向研究對種植體存活率進行了評估，發(fā)現(xiàn)雖然種植義齒平均累計存活率高達94.6%［11］，但種植體周圍病仍是最常見的生物學并發(fā)癥。種植體周圍黏膜炎表現(xiàn)為探診時出血、紅腫和化膿，但僅累及黏膜而無邊緣骨的丟失，具有可逆性，被認為是種植體周圍炎的前兆；種植體周圍炎除黏膜炎癥還表現(xiàn)為支持骨的喪失［2-3］。大量研究已經(jīng)證實，種植體周圍病很多是由于菌斑生物膜的堆積引起，通過細菌增殖和生物膜的形成導致種植體周圍黏膜發(fā)生炎癥，隨后引起支持骨的逐漸吸收［12］。有研究顯示，沒有進行定期維護的患者患種植體周圍病的風險可能會增加4.25 倍［13］。健康種植體周圍定植的細菌與天然牙類似，大多為革蘭陽性微需氧菌還有少量的革蘭陰性厭氧菌［14］，但當種植體周圍發(fā)生炎癥時，革蘭陰性厭氧菌及產(chǎn)黑色素厭氧菌、螺旋體等數(shù)量開始增多［7］；Sahrmann 等［15］通過比較健康種植體和炎癥種植體周圍微生物圖譜發(fā)現(xiàn)，炎癥種植體周圍菌群中牙齦卟啉單胞菌、具核梭桿菌的檢出率明顯增加，金黃色葡萄球菌在黏膜炎周圍尤其是化膿位點檢出率較高［16］。因此，破壞及清除黏附在種植體表面的菌斑生物膜是治療種植體周圍病的有效方法。

由于種植體周圍病與牙周病相似的臨床特征和病因，治療種植體周圍疾病的方法大多由牙周炎的治療方式遷延而來，臨床常用于治療種植體周圍病的去污方式包括機械清創(chuàng)（如金屬刮匙、鈦刮匙、鈦刷、超聲潔治器等）、噴砂處理、激光治療、光動力治療等，但由于種植體周圍菌群的復雜性和種植體表面特性，理想的治療方式應最大限度清除種植體表面黏附的菌斑生物膜，還要避免破壞種植體表面結(jié)構(gòu)，以期獲得良好的預后效果。大多數(shù)研究都基于對鈦種植體表面黏附生物膜的清除效率來評估去污結(jié)果，并未對后期細菌再次黏附鈦表面后形態(tài)及量的變化進行分析比較，因此，本研究重點在于對不同去污方式是否使鈦表面性能發(fā)生改變，以及對細菌再附著的可能影響來進行對比性評估，使臨床醫(yī)師了解不同去污方式的作用特點及參考選用。

金屬刮匙、超聲潔治器等傳統(tǒng)的機械清創(chuàng)方式被大量研究證實容易對鈦表面造成損傷，且清潔效率較低［17-18］；Larsen 等［19］發(fā)現(xiàn)鈦刷能夠明顯減少種植體表面牙齦卟啉單胞菌的數(shù)量，但也有研究認為鈦刷可能導致種植體表面微形貌發(fā)生顯著改變［20］。Huang 等［21］研究發(fā)現(xiàn)鈦刮匙會在鈦表面產(chǎn)生明顯劃痕，使鈦表面粗糙度及親水性顯著增加，這與本研究結(jié)果一致，這些變化可能有利于細菌黏附。在本研究的細菌再次黏附結(jié)果中顯示，即使是使用與種植體同質(zhì)的鈦刮匙去污處理后，鈦材表面的細菌黏附量仍然是最高的。綜上，機械去污使鈦表面結(jié)構(gòu)發(fā)生改變的幾率最高，可能會影響后期細菌黏附及骨結(jié)合，因此，在常規(guī)臨床治療中，應謹慎應用。

噴砂的清潔效率受到噴砂粉的影響。Matsubara 等［22］對碳酸氫鈉噴砂粉、甘氨酸噴砂粉及赤蘚糖醇噴砂粉的去污能力和對種植體表面粗糙度影響進行了體外評估，結(jié)果顯示碳酸氫鈉噴砂粉清潔能力最強，但會顯著增加鈦種植體表面粗糙度，甘氨酸及赤蘚糖醇噴砂粉對種植體表面粗糙度無明顯影響，但清潔能力有限。本研究選用了最新改進的赤蘚糖醇噴砂粉，結(jié)果顯示赤蘚糖醇噴砂粉處理相對于其他處理組而言，其對鈦表面細菌生物膜清除率最高，且對其表面粗糙度無明顯影響，但會增加其表面親水性，這有利于后期細胞與材料表面結(jié)合［23］，但也可能會使細菌更容易定植。因此本研究同時對細菌再次黏附在材料表面進行了探討，結(jié)果顯示，黏附量與對照組相比無明顯差異。這一現(xiàn)象可能與種植體結(jié)構(gòu)有關，鈦種植體的螺紋結(jié)構(gòu)可能使清潔效率降低，但新型齦下噴砂嘴能夠深入袋內(nèi)進行清潔，這對種植體周圍疾病的治療將具有積極意義。

光動力作為一種新穎的光化學療法，通過激光與光敏劑發(fā)生的光化學反應，產(chǎn)生的活性氧（reactive oxygen species，ROS）具有殺滅細菌，滅活細菌內(nèi)毒素等效果［24］，已被用于牙周病和種植體周圍病的治療。一項使用光動力療法作為機械去污的輔助治療種植體周圍炎的臨床研究結(jié)果顯示，光動力療法能夠有效改善種植體周圍菌斑評分、探診深度、探診出血和臨床附著喪失，減輕種植體周圍炎癥，其中牙齦卟啉單胞菌的數(shù)量顯示出明顯下降［25］，本研究同樣發(fā)現(xiàn)光動力對于牙齦卟啉單胞菌和具核梭桿菌的殺滅作用顯著，這與Sayar等［26］的研究結(jié)果相同，Huang 等［27］解釋為在病變的種植體周圍部位加入光敏劑有助于通過靶向細菌的細菌膜來減少細菌含量，這表明光動力療法是一種有效的種植體周感染輔助治療手段。

本研究對光動力、噴砂、鈦刮匙三種常用的去污清潔方式對細菌定植的鈦表面形貌、清除效率及細菌再次黏附能力進行了對比性評價，結(jié)果顯示，噴砂在機械去污方面表現(xiàn)較好，能夠去除鈦表面大部分細菌，但在細菌再次黏附的結(jié)果中，筆者發(fā)現(xiàn)牙齦卟啉單胞菌與具核梭桿菌在鈦材表面的黏附力有一定差異，這提示下一步應深入比較不同細菌間的生物學差異。光動力在殺菌方面具有優(yōu)越性，且細菌再次黏附于鈦表面后發(fā)現(xiàn)為死菌黏附量增多，其內(nèi)在機制值得進一步深入研究探討；鈦刮匙對細菌清除效率較低，并且會使鈦表面性能改變，增加細菌后期黏附效果，同時筆者也注意到了牙齦卟啉單胞菌與具核梭桿菌在各組的表現(xiàn)不盡一致，這可能與不同細菌本身的一些特性有關，后續(xù)計劃下一步從擴大樣本量及不同細菌生物學分析等不同方面進行研究和證實。本實驗結(jié)果提示噴砂處理聯(lián)合光動力療法可能對種植體周圍疾病的治療更為有效，但本研究為體外實驗，未來仍需更多體內(nèi)實驗驗證。

【Author contributions】Ge XT performed the experiments and wrote the article.Ye QY, Wang JJ, Zhang XG, Wang YZ, Wang XY and Ji JY performed the experiments and revised the article.Wang QT designed the study and revised the article.All authors read and approved the final manuscript as submitted.