PKMYT1在乳腺癌中表達(dá)的生物信息學(xué)分析及實驗用細(xì)胞系篩選

安彥榕 賈永峰

乳腺癌(breast cancer,BC)是一種在臨床特征和分子特征上均具有異質(zhì)性的惡性腫瘤，仍是全球女性中最普遍的疾病且是和腫瘤相關(guān)死亡最主要的原因。全球每年新發(fā)病例近170萬，死亡人數(shù)超過52萬[1,2]。乳腺癌是癌癥導(dǎo)致死亡的第二大原因，約占女性診斷腫瘤的30%[2,3]。雖然手術(shù)為主的治療方法可以提高早期乳腺癌患者的遠(yuǎn)期生存率，但由于缺乏有效的治療手段，晚期乳腺癌患者的5年生存率較低，因此迫切需要研究乳腺癌的分子調(diào)控機(jī)制，尋找新的且合適的治療靶點[4]。PKMYT1是WEE家族的成員，最早被報道為一種能夠有效磷酸化Thr14和Tyr15的激酶[5]。據(jù)報道，PKMYT1通過抑制細(xì)胞周期相關(guān)蛋白(如Cyclin A、CDK1和CDK2)的活性來抑制細(xì)胞周期的進(jìn)程[6]。在最近的報道中，PKMYT1也被發(fā)現(xiàn)驅(qū)動多種腫瘤的進(jìn)展[7]。然而，PKMYT1在乳腺癌進(jìn)展中的作用和機(jī)制尚不清楚。在本研究中，分析了PKMYT1在乳腺癌進(jìn)展中的重要作用及影響，并驗證了PKMYT1在乳腺癌各細(xì)胞系中的表達(dá)情況，提示其可能在乳腺癌發(fā)生和惡化等過程中起到重要作用。

材料與方法

1.數(shù)據(jù)處理及分析：從TCGA數(shù)據(jù)庫中下載乳腺癌RNA轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和臨床數(shù)據(jù)，并使用R語言軟件(Rx64 4.0.2版本)對其進(jìn)行分析，其中包括113例正常樣本和1109例腫瘤樣本。采用Limma包進(jìn)行差異基因表達(dá)分析、GSEA及KEGG富集分析以及生存分析。差異表達(dá)基因(DEGs)的閾值設(shè)為|fold-change|>2和錯誤發(fā)現(xiàn)率(FDR)<0.05，富集結(jié)果的FDR閾值設(shè)置為0.05[8]。

2.生物信息學(xué)分析：除利用TCGA數(shù)據(jù)庫進(jìn)行分析外，還通過其他數(shù)據(jù)庫進(jìn)行驗證。基因表達(dá)譜和交互分析工具(GEPIA 2)是一個在線工具，可提供腫瘤和正常組織中差異基因表達(dá)的信息、相關(guān)分析以及基于廣泛的RNA測序數(shù)據(jù)患者的生存分析。此外，使用包含54675個基因和10461個癌癥樣本(包括4929個乳腺癌樣本)的Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫來評估PKMYT1對乳腺癌患者生存率的影響。TIMER 2.0可對PKMYT1在泛癌中的差異表達(dá)進(jìn)行分析。HPA數(shù)據(jù)庫收集了基因在泛癌細(xì)胞系中的表達(dá)情況，可對PKMYT1進(jìn)行分析。

3.細(xì)胞培養(yǎng)：人類正常乳腺上皮細(xì)胞系MCF10A和乳腺癌細(xì)胞系MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-468、HCC1937以及小鼠乳腺癌細(xì)胞系C127、4T1、EMT6、E0771均購自武漢普諾賽(Procell)生命科技有限公司。DMEM培養(yǎng)基、1640培養(yǎng)基、胰酶及牛胎血清(FBS)購自美國Gibco公司。MCF10A采用專用培養(yǎng)基購自武漢普諾賽(Procell)生命科技有限公司；MDA-MB-231、HCC1937、EMT6細(xì)胞均采用1640培養(yǎng)基(90%1640培養(yǎng)基+10%FBS)，其他細(xì)胞均采用DMEM培養(yǎng)基(90%DMEM培養(yǎng)基+10%FBS)，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱(37℃、5%CO2)內(nèi)培養(yǎng)[9]。當(dāng)細(xì)胞匯合度為80%～90%時進(jìn)行傳代，保持細(xì)胞良好的生長狀態(tài)，取對數(shù)增長的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)研究。

4.總RNA提取及實時熒光定量PCR：根據(jù)制造商的說明，使用碧云天RNAeasyTM動物RNA抽提試劑盒(離心柱式)提取總RNA?；パa(bǔ)DNA (cDNA)通過TIANGEN Fastking一步法除基因組cDNA第一鏈合成預(yù)混試劑反轉(zhuǎn)錄總RNA獲得，并用于TRANS PerfectStartTMGreen qPCR SuperMix的實時定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)實驗。人細(xì)胞系采用GAPDH作為內(nèi)參，鼠細(xì)胞系采用ACTB作為內(nèi)參。人類PKMYT1上游引物：5′-CATGGCTCCTACGGAGAGGT-3′，下游引物：5′-ACATGGAACGCTTTACCGCAT-3′。人類GAPDH上游引物：5′-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3′，下游引物：5′-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3′。小鼠PKMYT1上游引物：5′-GTACCCCCATCCCAGTTCCA-3′，下游引物：5′-TCTGAGGTCTCACACAGGAAA-3′。小鼠ACTB上游引物：5′-GTGCTATGTTGCTCTAGACTTCG-3′，下游引物：5′-ATGCCACAGGATTCCATACC-3′。PKMYT1相對表達(dá)量用 2-ΔΔCt表示，ΔΔCt = CtPKMYT1-CtGAPDH/ACTB，ΔΔCt=ΔCt樣本-ΔCt參考樣本[10]。

結(jié) 果

1.PKMYT1在乳腺癌中高表達(dá)且可能成為新型腫瘤標(biāo)志物：通過TCGA數(shù)據(jù)庫下載的乳腺癌轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，對其1222例乳腺樣本(N:113/T:1109)進(jìn)行差異分析及配對差異分析。經(jīng)差異分析發(fā)現(xiàn)，P<0.001說明PKMYT1在正常和腫瘤樣本中的表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義，且在腫瘤樣本中高表達(dá)(圖1A)；經(jīng)配對差異分析可知，P≤2×10-16說明PKMYT1對于同一個樣本癌旁組織和癌組織中的表達(dá)是有差異的，且在癌組織中表達(dá)更高(圖1B)；同時PKMYT1在乳腺癌中的差異表達(dá)在GEPIA 2(圖1C)及TIMER2.0(圖1D)數(shù)據(jù)庫中加以驗證，其結(jié)果一致，PKMYT1均在乳腺癌中高表達(dá)，提示PKMYT1可能在乳腺癌發(fā)生和惡化等過程中起到重要作用。其中TIMER2.0數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)PKMYT1在多種腫瘤中均為高表達(dá)且具有差異，提示PKMYT1可能成為新型腫瘤標(biāo)志物。

圖1 PKMYT1在乳腺癌中的差異表達(dá)A.PKMYT1在TCGA數(shù)據(jù)庫中的差異分析;B.PKMYT1在TCGA數(shù)據(jù)庫中的配對差異分析;C.PKMYT1在GEPIA 2數(shù)據(jù)庫中的差異分析;D.PKMYT1在TIMER 2.0數(shù)據(jù)庫中的差異分析

2.PKMYT1在乳腺癌中影響腫瘤分期及原發(fā)腫瘤直徑：將TCGA獲取的1222例乳腺樣本的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)及臨床數(shù)據(jù)應(yīng)用Perl軟件及R語言軟件的Limma及Ggpubr包對數(shù)據(jù)進(jìn)行合并及臨床相關(guān)性分析。PKMYT1在乳腺癌中與年齡、腫瘤分期(Ⅰ～Ⅱ期及Ⅰ～Ⅲ期)及原發(fā)腫瘤直徑(T、T1～2、T1～3、T1～4)相關(guān)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，而與性別、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移(M)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)(N)，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05，圖2)。

圖2 PKMYT1在乳腺癌中的臨床相關(guān)性分析

3.GSEA功能富集分析提示PKMYT1在乳腺癌中與腫瘤生長、增殖相關(guān)：利用GSEA(GSEA_4.0.3版本)分析PKMYT1在乳腺癌中的功能及通路，進(jìn)而了解PKMYT1在乳腺癌中發(fā)揮的作用。分析結(jié)果顯示當(dāng)PKMYT1高表達(dá)時，經(jīng)554例樣本的功能富集分析顯示與細(xì)胞周期、DNA復(fù)制、同源重組等功能性關(guān)系較高，則說明PKMYT1在乳腺癌中可能對癌細(xì)胞的生長、增殖相關(guān)(圖3A)；低表達(dá)時則與胞外基質(zhì)受體相互作用、TGF-β信號通路、MAPK信號通路等相關(guān)(圖3中B和C)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，表1，表2)。

表1 PKMYT1高表達(dá)功能富集結(jié)果(554個樣本)

表2 PKMYT1低表達(dá)功能富集結(jié)果(555個樣本)

圖3 PKMYT1在乳腺癌中的功能富集分析A.PKMYT1高表達(dá)時GSEA多通路富集圖; B.PKMYT1低表達(dá)時GSEA多通路富集圖; C.PKMYT1參與重要通路的KEGG詳情

4.PKMYT1為乳腺癌的高風(fēng)險因素且與其生存相關(guān)：通過Kaplan-Meier Plotter來評估PKMYT1對乳腺癌患者生存率的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PKMYT1顯著影響乳腺癌患者的生存，其HR=1.22提示為高風(fēng)險因素，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001,圖4)。PKMYT1低表達(dá)組的生存率更高，說明當(dāng)PKMYT1高表達(dá)時對乳腺癌是有促進(jìn)作用的。

圖4 PKMYT1在乳腺癌中的生存分析

5.PKMYT1在乳腺癌各細(xì)胞系中的表達(dá)情況：經(jīng)在線工具HPA數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)PKMYT1在泛癌各細(xì)胞系之間的差異表達(dá)，其中以MCF-7的表達(dá)量是最高的，其nTPM值可達(dá)127.5，證明PKMYT1在乳腺癌中高表達(dá)(圖5A)。為此選取了5種人乳腺細(xì)胞系及4種小鼠乳腺癌細(xì)胞系做驗證，為選擇PKMYT1高表達(dá)的細(xì)胞系進(jìn)行后續(xù)的功能驗證。經(jīng)前期的差異分析及細(xì)胞系表達(dá)分析，通過qRT-PCR技術(shù)檢測了1種人類正常乳腺上皮細(xì)胞系MCF10A和4種人類乳腺癌細(xì)胞系MCF-7、MDA-MB-231、MDA-MB-468、HCC1937以及4種小鼠乳腺癌細(xì)胞系C127、4T1、EMT6、E0771中PKMYT1的相對表達(dá)水平。結(jié)果驗證了PKMYT1在人乳腺癌細(xì)胞系中以正常乳腺細(xì)胞系為參照表達(dá)由高到低的細(xì)胞系依次為MDA-MB-231、MDA-MB-468、MCF-7、HCC1937(圖5B)；PKMYT1在小鼠乳腺癌細(xì)胞系中的表達(dá)由高到低依次為4T1、E0771、C127、EMT6(圖5C)。

圖5 qRT-PCR檢測PKMYT1mRNA在乳腺癌細(xì)胞系中的相對表達(dá)量A.PKMYT1在泛癌細(xì)胞系中的表達(dá)情況;B.PKMYT1在人類乳腺癌細(xì)胞系中的相對表達(dá)量。與MCF10A比較，*P<0.05;C.PKMYT1在小鼠乳腺癌細(xì)胞系中的相對表達(dá)量

討 論

在生理條件下PKMYT1作為一個周期蛋白調(diào)節(jié)激酶，主要負(fù)責(zé)當(dāng)CDK1與細(xì)胞周期蛋白復(fù)合時，通過磷酸化CDK1激酶作為有絲分裂(G2期到M期轉(zhuǎn)變)的負(fù)調(diào)節(jié)因子，主要介導(dǎo)CDK1在Thr14 上的磷酸化，可能在較小程度上參與了CDK1在Tyr15上的磷酸化[11]。PKMYT1是WEE蛋白激酶家族的一員，WEE家族包括WEE1、PKMYT1、WEE2[12]。在非惡性真核體細(xì)胞中，它們作為腫瘤抑制因子，主要生物學(xué)功能是防止在細(xì)胞復(fù)制時發(fā)生DNA改變,也作為G2檢查點維持復(fù)制的穩(wěn)定。而在腫瘤細(xì)胞中，又類似于癌基因，其升高與腫瘤進(jìn)展和更具侵襲性疾病以及不良預(yù)后相關(guān)[13]。一旦惡性轉(zhuǎn)化過程被誘導(dǎo)，WEE家族上調(diào)通過確保癌細(xì)胞的基因組不穩(wěn)定性達(dá)到可容忍水平而發(fā)揮促進(jìn)腫瘤的功能[7]。

在乳腺癌中PKMYT1是WEE家族唯一過表達(dá)的基因，可見PKMYT1對乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展起著重要的作用，具體機(jī)制還有待研究[11]。肝細(xì)胞癌和結(jié)腸癌中，PKMYT1通過激活β-連環(huán)蛋白/TCF調(diào)節(jié)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，這是一個與腫瘤進(jìn)展、侵襲、轉(zhuǎn)移和耐藥性相關(guān)的過程[14，15]。PKMYT1已被報道在非小細(xì)胞肺癌中控制Notch通路，特別是該途徑的關(guān)鍵成分包括Notch1、p21和Hes1，通過PKMYT1的化學(xué)抑制下調(diào)后可抑制其增殖、遷移、侵襲及促進(jìn)凋亡[13]。神經(jīng)母細(xì)胞腫瘤中，PKMYT1是穩(wěn)定MYCN蛋白所必需的，MYCN蛋白是這種癌癥類型的關(guān)鍵原癌基因[16]。食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系和原代細(xì)胞中，PKMYT1的表達(dá)與Akt/mTOR通路的激活相關(guān)并對其進(jìn)行調(diào)節(jié)[17]。胃癌中PKMYT1表達(dá)增加可激活MAPK從而促進(jìn)其惡性生物學(xué)行為[18]。卵巢癌中PKMYT1高表達(dá)，敲低PKMYT1可抑制其增殖、遷移、侵襲及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[19]。

目前迫切需要新的、更有效的乳腺癌治療靶點，像TCGA和GEPIA這樣的公共數(shù)據(jù)庫提供了大量有價值的高通量數(shù)據(jù)。挖掘這樣的公共數(shù)據(jù)庫可以幫助識別乳腺癌的生物學(xué)標(biāo)志物和治療靶點，并為乳腺癌的發(fā)展和機(jī)制研究提供見解。本研究中筆者對乳腺癌RNA轉(zhuǎn)錄組及其臨床數(shù)據(jù)進(jìn)行了多方面的分析，并確定了一個新的基因PKMYT1。PKMYT1是乳腺癌數(shù)據(jù)集中腫瘤和正常樣本之間的一個差異基因，經(jīng)分析PKMYT1的表達(dá)顯著影響乳腺癌患者的生存期且通過GSEA功能富集分析發(fā)現(xiàn)與癌細(xì)胞的生長增殖密切相關(guān)。最后通過細(xì)胞實驗驗證PKMYT1無論是在人乳腺癌細(xì)胞系中還是小鼠乳腺癌細(xì)胞系均呈高表達(dá)，在后續(xù)研究中將會挑選表達(dá)量較高的細(xì)胞系進(jìn)行功能驗證。

綜上所述，本研究通過基因差異表達(dá)分析、臨床相關(guān)性分析、GSEA富集分析及生存分析發(fā)現(xiàn)了一個新的乳腺癌驅(qū)動基因PKMYT1，且證明了PKMYT1在多種乳腺癌細(xì)胞系中高表達(dá)。因此PKMYT1或可成為乳腺癌中一個很有前途的治療靶點，但PKMYT1影響乳腺癌發(fā)生、發(fā)展的具體機(jī)制有待于進(jìn)一步開展實驗研究予以證實。