枸杞多糖對(duì)DEACMP 大鼠海馬NF-κB 蛋白表達(dá)的影響

楊 平，張俊飛，肖紅科，胡小東，康向飛

（寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院急診科，寧夏 銀川 750000）

一氧化碳（carbon monoxide，CO）是一種有毒氣體，當(dāng)機(jī)體吸入一定量后會(huì)出現(xiàn)中毒癥狀，嚴(yán)重者甚至危及生命[1]。據(jù)報(bào)道[2]，約有12%的患者治愈后會(huì)出現(xiàn)CO 中毒后遲發(fā)性腦?。╠elayed encephalophthy after acute carbon monoxide poisoning，DEACMP），表現(xiàn)為一系列神經(jīng)、精神障礙等癥狀，給患者及家庭帶來(lái)嚴(yán)重的負(fù)擔(dān)，并會(huì)產(chǎn)生一系列社會(huì)危害，不利于社會(huì)治安。我地區(qū)為經(jīng)濟(jì)相對(duì)落后的省份，冬季采暖期是DEACMP 的高發(fā)期。如何有效降低DEACMP 發(fā)生率，尋找臨床治療方法，提高其救治效果是臨床工作中的一項(xiàng)巨大挑戰(zhàn)。核因子-κB（nuclear factor kappa B，NF-κB）蛋白幾乎在所有細(xì)胞中均有表達(dá)[3]。研究表明[4，5]，NF-κB 蛋白在DEACMP 的發(fā)生中扮演重要角色，通過(guò)抑制NF-κB 表達(dá)可以達(dá)到治療DEACMP 作用。枸杞是我國(guó)傳統(tǒng)名貴中藥，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究已表明其具有多種藥理作用和活性功效[6，7]。其中，枸杞多糖（Lyciumbarbarum polysaccharides，LBP）作為枸杞主要成分，具有抗氧化、抗衰老、抗腫瘤及免疫調(diào)節(jié)等多種藥理作用[8]。由于LBP 可以自由通過(guò)并調(diào)節(jié)血腦屏障，因此其對(duì)神經(jīng)損傷性疾病具有潛在的治療作用[9]。基于此，本研究主要探討LBP 對(duì)DEACMP 大鼠海馬NF-κB 蛋白表達(dá)的影響，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF 級(jí)健康雄性Wistar 大鼠108 只，體重為200～240 g。實(shí)驗(yàn)前大鼠在動(dòng)物室內(nèi)自由飲食飲水，光照12 h 明暗交替，保持室溫22 ℃～26 ℃，濕度50%～60%，適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周，實(shí)驗(yàn)前隔夜禁食。本研究獲得了寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（2019-518）。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組 采用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為空白組、DEACMP 組和LBP 組（40 mg/kg，連續(xù)灌胃治療）。對(duì)照組6 只，DEACMP 組和LBP 組各36 只。其中DEACMP 組和LBP 組根據(jù)時(shí)間點(diǎn)不同分為染毒第1、3、7、14、21 和28 天6 個(gè)亞組，每組6 只。

1.3 EACMP 大鼠模型制備 采用改良式腹腔注射CO 法建立DEACMP（首次注射99.99% CO 純品氣體120 ml/kg，后連續(xù)注射3 次，每次按照首次劑量的2/3，間隔4 h）。空白組大鼠用相同方法注射同等比例空氣。EACMP 造模成功判斷：初期從大鼠急性CO 中毒癥狀、動(dòng)脈血COHb 濃度判斷，隨后利用Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測(cè)大鼠認(rèn)知及記憶障礙，綜合判斷大鼠是否發(fā)生DEACMP。

1.4 Morris 水迷宮行為學(xué)實(shí)驗(yàn) ①定向航行實(shí)驗(yàn)：Morris 水迷宮是由自動(dòng)錄像、分析系統(tǒng)和圓形水池組成，其中圓形水池又分為4 個(gè)象限，命名為1、2、3、4。在1 象限固定有站臺(tái)，且站臺(tái)低于水面1 cm。大鼠隨機(jī)從2、3、4 象限入水，自動(dòng)錄像系統(tǒng)記錄每只大鼠的逃避潛伏期。染毒前，連續(xù)訓(xùn)練2 d，4 次/d，對(duì)各組大鼠在第1、3、7、14、21 和28 天時(shí)各進(jìn)行4次實(shí)驗(yàn)，4 次結(jié)果的平均值為當(dāng)日大鼠的結(jié)果[10]；②空間探索實(shí)驗(yàn)：第21 天撤除平臺(tái)，記錄各組大鼠在60 s 內(nèi)經(jīng)過(guò)1 象限的游泳時(shí)間[10]。

1.5 組織取材與指標(biāo)檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后對(duì)各組大鼠進(jìn)行腹腔注射水合氯醛（300 mg/kg）麻醉動(dòng)物，迅速經(jīng)腹主動(dòng)脈采血，所有血液均置于肝素抗凝采血管中，血樣經(jīng)3500 r/min 離心5 min，收集上清血漿并按整體積分裝于凍存管中，血清樣本經(jīng)液氮迅速冷凍后儲(chǔ)存于-80 ℃冰箱中待檢，血清樣本進(jìn)行IL-1β、IL-6 和TNF-α 表達(dá)水平檢測(cè)。腦組織取材固定后進(jìn)行免疫組化研究，嚴(yán)格按照NF-κB 試劑（圣克魯斯生物技術(shù)公司，中國(guó)）說(shuō)明書(shū)染色步驟進(jìn)行，結(jié)果用半定量人工計(jì)數(shù)法進(jìn)行分析，方法參照呂霞等[11]研究。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以（）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析方法；以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3 組炎性指標(biāo)比較 DEACMP 組與LBP 組大鼠血清中IL-1β、IL-6 和TNF-α 表達(dá)水平高于空白組，但LBP 組大鼠血清中IL-1β、IL-6 和TNF-α 表達(dá)水平低于DEACMP 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表1。

表1 3 組炎性指標(biāo)比較（）

表1 3 組炎性指標(biāo)比較（）

注：與空白組比較，*P＜0.05；與DEACMP 組比較，#P＜0.05

2.2 3 組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)平均潛伏期比較 3 組染毒前、染毒第1、7 天平均潛伏期比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；DEACMP 組與LBP 組染毒第14、21、28天平均潛伏期長(zhǎng)于空白組，而LBP 組大鼠平均潛伏期短于DEACMP 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表2。

表2 3 組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)平均潛伏期比較（，s）

表2 3 組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)平均潛伏期比較（，s）

注：與空白組比較，*P＜0.05；與DEACMP 組比較，#P＜0.05

2.3 3 組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)NF-κB 表達(dá)情況比較DEACMP組與LBP組染毒第1、7、14、21、28 天NF-κB 蛋白表達(dá)高于空白組，且LBP 組低于DEACMP 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），見(jiàn)表3。

表3 3 組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)NF-κB 表達(dá)情況（）

表3 3 組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)NF-κB 表達(dá)情況（）

注：與空白組比較，*P＜0.05；與DEACMP 組比較，#P＜0.05

3 討論

CO 中毒后由于氧氣供應(yīng)發(fā)生障礙，導(dǎo)致機(jī)體發(fā)生嚴(yán)重的缺氧，其中腦組織由于對(duì)缺氧耐受性最差往往會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的缺氧性損傷，在這個(gè)過(guò)程中機(jī)體會(huì)發(fā)生一系列改變，包括血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷、血小板聚集和炎癥因子增加，進(jìn)一步加重腦損傷[12]。TNF-α 和IL-6 等炎癥因子會(huì)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)（central nervous system，CNS）中大量聚集，從而激活相關(guān)信號(hào)通路，如NF-κB 信號(hào)通路，并進(jìn)一步促進(jìn)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞釋放大量炎性因子，形成惡性循環(huán)，加重CNS 的損傷[13]。有研究表明[13]，炎癥因子會(huì)增加血腦屏障的通透性，改變細(xì)胞內(nèi)外微環(huán)境，進(jìn)而加重神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡與壞死。另研究表明[13]，NF-κB 信號(hào)通路的激活會(huì)加重神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的損傷，并進(jìn)一步促進(jìn)如IL-6 和TNF-α 等炎癥因子的釋放，形成惡性循環(huán)。辜剛鳳等[14]研究表明，CO 中毒后可能通過(guò)上調(diào)NF-κB 表達(dá)，引起神經(jīng)元細(xì)胞死亡、海馬突觸重塑，從而加重?fù)p傷損傷引起DEACMP，而給予藥物治療后可以通過(guò)降低NF-κB 表達(dá)，達(dá)到保護(hù)神經(jīng)損傷作用。此外，在DEACMP 患者中，IL-6、IL-8 和IL-18 炎癥因子表達(dá)增加，而藥物治療后通過(guò)降低炎癥因子表達(dá)后可以有效改善患者神經(jīng)損傷癥狀[15]。齊玲等[16]研究也表明，降低DEACMP 患者血清中炎癥因子IL-6、IL-10、IL-18、超敏C 反應(yīng)蛋白和TNF-α 后可以有效改善患者的神經(jīng)損傷。本研究結(jié)果顯示，DEACMP 組與LBP 組染毒第1、7、14、21、28 天NF-κB 蛋白表達(dá)高于空白組，且LBP 組低于DEACMP 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），表明CO 中毒后發(fā)生DEACMP 的過(guò)程中會(huì)導(dǎo)致海馬區(qū)NF-κB 蛋白的表達(dá)增加，同時(shí)血清中IL-1β、IL-6和TNF-α 表達(dá)水平也明顯升高，這表明炎癥因子與NF-κB 蛋白表達(dá)在DEACMP 發(fā)生中發(fā)揮了重要作用。

枸杞為茄科Solanaceae 枸杞屬落葉灌木植物，是我國(guó)傳統(tǒng)的名貴中藥材，我國(guó)有7 個(gè)種和2 個(gè)變種，其中寧夏枸杞分布最為廣泛，也是唯一被載入《中國(guó)藥典》的枸杞物種。枸杞主要有效成分為L(zhǎng)BP，其在抗氧化、抗腫瘤、降血糖和血脂、免疫調(diào)節(jié)和神經(jīng)保護(hù)方面具有很好的治療效果。研究表明[17]，LBP 可以通過(guò)減少機(jī)體氧自由基含量，從而達(dá)到保護(hù)缺氧后受損的神經(jīng)元。腦部缺氧時(shí)可以抑制PI3K/Akt/GSK3β 信號(hào)通路促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞凋亡，而LBP 可以通過(guò)減少氧化應(yīng)激和激活PI3K/Akt 信號(hào)通路，從而抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡達(dá)到神經(jīng)保護(hù)作用[18]。線粒體功能與形態(tài)在腦缺血缺氧損傷中發(fā)揮重要的作用，同時(shí)LBP 可通過(guò)降低氧自由基數(shù)量，緩解氧化應(yīng)激損傷，抑制炎癥因子釋放而降低腦缺血缺氧性損傷，并抑制神經(jīng)細(xì)胞中線粒體的凋亡來(lái)改善腦損傷。溫靜等[19]研究發(fā)現(xiàn)，LBP 可以減輕錳中毒小鼠神經(jīng)損傷，縮短錳中毒小鼠的逃避潛伏期，增加穿環(huán)次數(shù)，提高學(xué)習(xí)記憶能力，通過(guò)增加海馬區(qū)SOD 活性，降低LPO 含量，促進(jìn)海馬神經(jīng)發(fā)生，從而影響小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，對(duì)神經(jīng)毒性損傷具有很好的保護(hù)作用。也有研究表明[20]，LBP 可以降低放射性腦損傷海馬神經(jīng)元的凋亡，并且降低海馬神經(jīng)元中MDA含量，升高SOD 和GSH-Px 活性，通過(guò)PI3K/Akt/mTOR 信號(hào)通路和氧化應(yīng)激有關(guān)通路降低神經(jīng)細(xì)胞凋亡率，從而達(dá)到神經(jīng)保護(hù)作用。本研究結(jié)果顯示，三組染毒前、染毒第1、7 天平均潛伏期比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；DEACMP 組與LBP 組染毒第14、21、28 天平均潛伏期長(zhǎng)于空白組，而LBP 組大鼠平均潛伏期短于DEACMP 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；且LBP 組大鼠血清中IL-1β、IL-6 和TNF-α 表達(dá)水平低于DEACMP 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），提示給予LBP 治療后可以明顯降低大鼠海馬區(qū)NF-κB 蛋白的表達(dá)，此外也降低了大鼠的平均潛伏期；同時(shí)，LBP 可以降低DEACMP 大鼠血清中的炎癥因子表達(dá)情況，對(duì)DEACMP 大鼠的神經(jīng)損傷具有很好的保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能與調(diào)控NF-κB 信號(hào)通路有關(guān)，并通過(guò)降低炎癥因子的表達(dá)進(jìn)一步減輕損傷有關(guān)。

綜上所述，LBP 對(duì)DEACMP 大鼠神經(jīng)損傷具有較好的治療作用，其作用可能與調(diào)控NF-κB 信號(hào)通路有關(guān)。