CRISPR/Cas系統(tǒng)的核酸檢測及其在食品安全快速檢測中的應(yīng)用

翟百強(qiáng)，程 楠，王洪濤，徐瑗聰

（1 北京工業(yè)大學(xué)環(huán)境與生命學(xué)部 北京 100024 2 河南省鐵路食品安全管理工程技術(shù)研究中心 鄭州 450052 3 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院 北京 100083）

食品安全關(guān)乎民生，快速、精準(zhǔn)的檢測能夠為食品安全事件提供有效的科學(xué)預(yù)警。生物傳感器檢測技術(shù)能夠?qū)⑽粗袠?biāo)有效轉(zhuǎn)化成可測量的信號，成為食品安全快速檢測領(lǐng)域的佼佼者。核酸傳感器依托核酸中間體承載信號的識別、放大和轉(zhuǎn)導(dǎo)的作用，在食源性致病菌、農(nóng)藥殘留、重金屬檢測、生物摻偽等[1-3]檢測中表現(xiàn)優(yōu)異，有效縮短了檢測時間，提高了檢測特異性及靈敏度。2020年諾貝爾化學(xué)獎揭曉后，CRISPR/Cas（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR；CRISPR-associated protein，Cas）系統(tǒng)因優(yōu)異的基因編輯能力、獨(dú)特的靶點(diǎn)識別方式、極高的酶活力等特性廣為人知，在核酸檢測領(lǐng)域表現(xiàn)出巨大的應(yīng)用價值[4-6]。由其構(gòu)建的核酸傳感器也成為食品安全快速檢測平臺的研究熱點(diǎn)。本文就基于CRISPR/Cas系統(tǒng)的研究進(jìn)行綜述，分析不同CRISPR/Cas 系統(tǒng)結(jié)合核酸技術(shù)在不同靶標(biāo)檢測中的應(yīng)用情況，展望CRISPR/Cas 核酸傳感器在食品安全快速檢測領(lǐng)域的未來研究方向，以促進(jìn)其在食品安全檢測中的進(jìn)一步應(yīng)用。

1 CRISPR/Cas 系統(tǒng)概述

CRISPR-Cas 系統(tǒng)即成簇規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列以及CRISPR 相關(guān)蛋白系統(tǒng)，是一種獲得性免疫系統(tǒng)，存在于眾多古細(xì)菌和細(xì)菌中[7]。根據(jù)系統(tǒng)依賴的Cas 蛋白的不同可以分成2 大類[8]：第1 類Cas 蛋白是多亞基蛋白復(fù)合物，發(fā)揮活性需要依靠多個效應(yīng)蛋白協(xié)同作用，第2 類Cas 蛋白是獨(dú)立蛋白，發(fā)揮活性僅依靠單一效應(yīng)蛋白。根據(jù)Cas 蛋白的基因結(jié)構(gòu)及重復(fù)間隔序列結(jié)構(gòu)不同可以分為6 類（Ⅰ～Ⅵ型），其中Ⅰ型、Ⅲ型和Ⅳ型屬于第1 類系統(tǒng)，Ⅱ型、Ⅴ型和Ⅵ型屬于第2 類系統(tǒng)[8-9]。CRISPR/Cas系統(tǒng)的作用機(jī)制包括3 個階段：獲取、表達(dá)和干擾。首先將外源基因整合到CRISPR 基因座2 個重復(fù)序列中間，獲得間隔序列；其次基因座轉(zhuǎn)錄成前體crRNA，隨后加工為成熟crRNA（CRISPR RNA）；最后crRNA 與Cas 蛋白復(fù)合，發(fā)揮核酸酶活性對外源基因進(jìn)行切割[9]。基于CRISPR/Cas系統(tǒng)的檢測技術(shù)則是依據(jù)作用機(jī)制，根據(jù)檢測靶標(biāo)序列設(shè)計向?qū)NA（Singleguide RNA，sgRNA），當(dāng)其與特異性靶標(biāo)識別配對后，激活Cas 蛋白的切割活性，通過切割產(chǎn)物的分析實(shí)現(xiàn)靶標(biāo)的檢測。目前的研究主要集中在Cas9、Cas12、Cas13 以及Cas14 這4 種蛋白（圖1），其中基于Cas9 的檢測側(cè)重于sgRNA 的設(shè)計，通過特異性識別靶序列實(shí)現(xiàn)多重檢測；基于Cas12、Cas13 及Cas14 的檢測則重點(diǎn)依賴Cas 蛋白激活后的切割活性。

圖1 CRISPR/Cas9（a）、Cas12（b）、Cas13（c）及Cas14（d）基本組成及作用原理圖Fig.1 Fundamental components and mechanism of CRISPR/Cas99（a），Cas12（b），Cas13（c），and Cas14（d）systems

1.1 CRISPR-Cas9

Cas9 蛋白是最為典型的2 類Ⅱ型CRISPR 系統(tǒng)效應(yīng)蛋白，是RNA 引導(dǎo)和dsDNA（Doublestrand DNA）靶向的核酸內(nèi)切酶，含有HNH 和RuvC 2 個核酸酶結(jié)構(gòu)域，其中HNH 只有1 個核酸酶區(qū)域，RuvC 含有3 段核酸酶區(qū)域[10]。CRISPRCas9 系統(tǒng)需要Cas9、crRNA 和tracrRNA（Transactivating RNA）協(xié)同發(fā)揮作用，其中crRNA 與tracrRNA 合并設(shè)計形成一條sgRNA，當(dāng)Cas9 與crRNA 部分結(jié)合后，能夠識別含有PAM（Protospacer adjacent motif）位點(diǎn)（5'-NGG）的靶標(biāo)dsDNA，crRNA 與靶標(biāo)dsDNA 中的互補(bǔ)鏈形成RNADNA 異源雙鏈結(jié)構(gòu)，隨后Cas9 的兩個核酸酶結(jié)構(gòu)域活性被激活，進(jìn)而切斷靶標(biāo)dsDNA[11]。后有研究發(fā)現(xiàn)單獨(dú)添加小段PAMmer 序列，與ssDNA 靶標(biāo)形成含有PAM 序列的部分dsDNA 后，Cas9 依然能夠發(fā)揮切割活性對ssDNA 靶標(biāo)進(jìn)行切割[12]。此外研究通過對Cas9 的HNH 和RuvC 結(jié)構(gòu)域進(jìn)行突變，得到?jīng)]有活性的dCas9（Nuclease-deactivated Cas9）蛋白，雖能夠識別靶標(biāo)dsDNA，但是沒有核酸酶切割活性[13]。

1.2 CRISPR-Cas12

Cas12 蛋白屬于2 類Ⅴ型CRISPR 系統(tǒng)效應(yīng)蛋白，也是RNA 引導(dǎo)和DNA 靶向的核酸內(nèi)切酶，只含有RuvC 核酸酶結(jié)構(gòu)域[8]。CRISPR-Cas12 系統(tǒng)中，Cas12 蛋白能夠在crRNA 的引導(dǎo)下識別含有PAM 位點(diǎn)（5'-TTTN）的靶標(biāo)dsDNA，或者識別不需要PAM 位點(diǎn)的ssDNA（Single-strand DNA）靶標(biāo)序列，形成三鏈或者雙鏈復(fù)合體，隨后激活RuvC 的核酸內(nèi)切酶活性，切割特異性靶標(biāo)dsDNA或者靶標(biāo)ssDNA（也稱作cis 切割），同時還激活了反式切割活性，能夠切割其它非特異性ssDNA（也稱作trans 切割）。其中反式切割活性的激活需要一個必備條件，就是要求靶標(biāo)模板序列中至少有15 個堿基與crRNA 互補(bǔ)。由于dsDNA 靶標(biāo)中非互補(bǔ)鏈有助于提升“互補(bǔ)鏈/crRNA/Cas12 蛋白”的穩(wěn)定性，因此dsDNA 靶標(biāo)激活的反式切割能力要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于ssDNA 靶標(biāo)。Cas12 蛋白的家族成員包括Cas12a～Cas12f，但研究多集中在Cas12a 和Cas12b。Cas12a 又稱為Cpf1 蛋白，Cas12b 又稱為C2c1 蛋白，兩者的區(qū)別在于前者的crRNA 成熟不需要tracrRNA 參與，而后者需要，但是兩者都同時具備核酸內(nèi)切酶活性和反式切割活性[14-16]。

1.3 CRISPR-Cas13

Cas13 蛋白屬于2 類Ⅵ型CRISPR 系統(tǒng)效應(yīng)蛋白，是RNA 引導(dǎo)和RNA 靶向的核酸內(nèi)切酶，含有兩個HEPN 核酸酶結(jié)構(gòu)域[8]。CRISPR-Cas13 系統(tǒng)中，Cas13 蛋白本身能夠?qū)rRNA 的成熟進(jìn)行加工處理，不需要tracrRNA 參與，隨后在crRNA的引導(dǎo)下識別含有PFS（protospacer-flanking sequence）位點(diǎn)的（3'-A 或U 或C）的RNA，形成雙鏈RNA 復(fù)合物促使HEPN1 和HEPN2 兩個結(jié)構(gòu)域相互靠近，從而激活HEPN 核酸酶的核酸內(nèi)切酶活性，切割特異性靶標(biāo)RNA，同時還激活了反式切割活性，能夠非特異性切割其它非靶標(biāo)RNA[17-18]。Cas13 蛋白的家族成員包括Cas13a～Cas13d，其中關(guān)于Cas13a 的研究較多，不同的Cas13 對切割探針具有不同的偏好性。Cas13a 又稱為C2c2 蛋白，通過對核酸酶區(qū)域的殘基突變可得到?jīng)]有核酸酶活性dCas13a，能夠結(jié)合靶標(biāo)RNA 卻沒有切割性能[19]。

1.4 CRISPR-Cas14

Cas14 蛋白屬于2 類Ⅴ型CRISPR 系統(tǒng)效應(yīng)蛋白，是RNA 引導(dǎo)和ssDNA 靶向的核酸內(nèi)切酶，含有RuvC 核酸酶結(jié)構(gòu)域。CRISPR-Cas14 系統(tǒng)與Cas9 系統(tǒng)相似，需要Cas 蛋白、crRNA 和tracr-RNA 協(xié)同發(fā)揮作用，不同的是Cas14 的識別不需要PAM 位點(diǎn)。其切割特性與Cas12 相似，與Cas13的區(qū)別在于識別的靶標(biāo)不同，Cas14 專一識別靶標(biāo)ssDNA 后激活RuvC 核酸酶的核酸內(nèi)切酶活性，切割特異性靶標(biāo)ssDNA，同時還激活了反式切割活性，能夠非特異性切割其它非靶標(biāo)ssDNA[20]。由于CRISPR/Cas14 系統(tǒng)對crRNA 和ssDNA 靶標(biāo)的錯配容忍度很低，成功突破了ssDNA 靶標(biāo)精準(zhǔn)識別的短板，成為了CRISPR 系統(tǒng)巨大的進(jìn)步。其家族成員包括Cas14a～Cas14c，是目前最小的第2 類CRISPR 效應(yīng)蛋白[21]。后有研究報道，Cas14 是屬于Cas12f 的亞類，其中Cas14a 屬于Cas12f1，Cas14b屬于Cas12f2，而Cas14c 屬于Cas12f3[22]。

2 CRISPR/Cas 系統(tǒng)與核酸擴(kuò)增技術(shù)的結(jié)合應(yīng)用

不同的CRISPR/Cas 系統(tǒng)識別不同類型的靶標(biāo)，在檢測過程中直接識別則存在靶標(biāo)濃度低，基質(zhì)干擾等問題，一般需要通過核酸擴(kuò)增技術(shù)對靶標(biāo)進(jìn)行放大，再利用產(chǎn)物作為新的靶標(biāo)與CRISPR/Cas 系統(tǒng)結(jié)合建立相應(yīng)的核酸傳感器檢測平臺。不同的核酸擴(kuò)增技術(shù)能夠生產(chǎn)不同類型的靶標(biāo)產(chǎn)物，兩者之間的組合能夠充分發(fā)揮CRISPR/Cas系統(tǒng)的檢測功能，目前已組裝成多種類型的CRISPR/Cas 核酸檢測平臺并廣泛應(yīng)用于各大檢測領(lǐng)域。各平臺之間的差異和改進(jìn)多集中在5 個方面：操作步驟（擴(kuò)增和檢測兩步反應(yīng)的合并）、特異性（堿基突變的識別）、過程污染（閉管反應(yīng)避免交叉污染）、檢測通量（單重升級到多重檢測）以及結(jié)果輸出（實(shí)現(xiàn)裸眼可視化）。核酸擴(kuò)增技術(shù)根據(jù)溫度依賴程度可以分為恒溫擴(kuò)增和變溫擴(kuò)增，根據(jù)產(chǎn)物類型可以分為雙鏈產(chǎn)物擴(kuò)增和單鏈產(chǎn)物擴(kuò)增，其中能夠生成雙鏈產(chǎn)物的恒溫擴(kuò)增技術(shù)應(yīng)用較多，典型代表是重組聚合酶擴(kuò)增技術(shù)（Recombinase polymerase amplification，RPA），有經(jīng)典的SHERLOCK、DETECTR 等檢測平臺。

2.1 CRISPR/Cas 系統(tǒng)結(jié)合NASBA

NASBACC（NASBA/CRISPR cleavage）檢測平臺是CRISPR/Cas 系統(tǒng)與核酸擴(kuò)增技術(shù)的首次結(jié)合應(yīng)用。核酸序列依賴擴(kuò)增（Nucleic acid sequence-based amplification，NASBA）是以RNA為模板，依賴AMV 反轉(zhuǎn)錄酶、Rnase H 酶和T7RNA 聚合酶的等溫擴(kuò)增技術(shù)，其中間產(chǎn)物為DNA 雙鏈。NASBACC 方法中，以寨卡病毒的RNA為靶標(biāo)進(jìn)行NASBA 擴(kuò)增，中間產(chǎn)物DNA 轉(zhuǎn)錄得到RNA，然后通過小立足點(diǎn)置換激活傳感器上的顏色反應(yīng)，通過黃色和紫色的區(qū)分實(shí)現(xiàn)基因分型。方法的巧妙之處在于，CRISPR/Cas9 系統(tǒng)中cr-RNA 選取的PAM 序列恰好是兩種寨卡病毒的基因差異片段。美國寨卡病毒通過NASBA 擴(kuò)增后能夠得到含有“CGG”的dsDNA 產(chǎn)物，與crRNA 進(jìn)行和互補(bǔ)配對，并激活Cas9 蛋白的切割活性，將ds-DNA 切斷，隨后轉(zhuǎn)錄只能得到小段RNA，無法激發(fā)后續(xù)反應(yīng)而呈現(xiàn)出黃色結(jié)果。非洲寨卡病毒存在堿基突變，擴(kuò)增后得到的是含有“CAG”的dsDNA 產(chǎn)物，由于PAM 序列的突變，無法激活Cas9的切割活性，此時dsDNA 能夠轉(zhuǎn)錄得到完整的RNA，通過小立足點(diǎn)置換反應(yīng)激活后續(xù)的生化反應(yīng)呈現(xiàn)紫色結(jié)果，從而實(shí)現(xiàn)對寨卡病毒的精準(zhǔn)分型鑒定[23]。

2.2 CRISPR/Cas 系統(tǒng)結(jié)合RPA

SHERLOCK（Specific high-sensitivity enzymatic reporter unlocking）[24]和DETECTR（DNA endonuclease targeted CRISPR trans reporter）[14]是CRISPR/Cas 系統(tǒng)結(jié)合RPA 擴(kuò)增技術(shù)的2 個經(jīng)典平臺。RPA 是以DNA 為模板，依賴重組聚合酶、單鏈結(jié)合蛋白和鏈置換DNA 聚合酶的等溫擴(kuò)增技術(shù)，其擴(kuò)增產(chǎn)物是DNA 雙鏈。

張鋒團(tuán)隊建立的SHERLOCK 平臺，是基于CRISPR/Cas13a 與RPA 進(jìn)行結(jié)合，整體包括2 個步驟。先由RPA 擴(kuò)增生成dsDNA 產(chǎn)物，由于Cas13a 識別的是RNA 靶標(biāo)，因此需要對dsDNA產(chǎn)物進(jìn)行轉(zhuǎn)錄得到RNA 產(chǎn)物，隨后與crRNA 結(jié)合并激活Cas13a 的反式切割活性，切割熒光淬滅的RNA 探針，通過熒光的變化實(shí)現(xiàn)了寨卡病毒和登革病毒的區(qū)別檢測、致病菌的檢測、人類基因組分型以及單堿基突變檢測等。如果靶標(biāo)是RNA，則需要先進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄再完成RPA 擴(kuò)增[24]。不同的Cas13 蛋白對切割探針具有不同的偏好性，該團(tuán)隊基于該特性進(jìn)一步建立了SHERLOCKv2 平臺，通過 PsmCas13b、LwaCas13a、CcaCas13b 和 Cas12a對不同熒光探針的切割，實(shí)現(xiàn)了四重檢測，后續(xù)通過結(jié)合CRISPR 相關(guān)酶Csm6 進(jìn)一步提升靈敏度，并應(yīng)用于側(cè)流層析試紙條實(shí)現(xiàn)可視化檢測[25]。SHERLOCK 中RPA 擴(kuò)增需要對靶標(biāo)進(jìn)行基因組提取，為了簡化核酸的提取步驟，該團(tuán)隊再次建立HUDSON（Heating unextracted diagnostic samples to obliterate nucleases）平臺。通過加熱和化學(xué)處理釋放核酸，并使核糖核酸酶失活，從而實(shí)現(xiàn)寨卡病毒和革登熱病毒的SHERLOCK 快速檢測[26]。Arizti-Sanz 等[27]基于上述研究，組合SHERLOCK和HUDSON 建立了SHINE（SHERLOCK and HUDSON integration to navigate epidemics）平臺，通過體系優(yōu)化實(shí)現(xiàn)了兩步法檢測的一體化，成功用于SARS-CoV-2 的免提取快速精準(zhǔn)檢測。這一系列檢測平臺雖然具有良好的特異性和靈敏度，但是由于依賴的是Cas13 蛋白，因此需要增加反轉(zhuǎn)錄過程，一定程度上增加了操作的繁瑣性。

DETECTR 平臺[14]是基于CRISPR/Cas12a 與RPA 結(jié)合的原理建立，含有PAM 序列的dsDNA產(chǎn)物與crRNA 結(jié)合并激活Cas12a 的反式切割活性，切割熒光淬滅的ssDNA 探針，通過熒光的變化進(jìn)行結(jié)果判定。利用“TTTC”PAM 序列后的6 個堿基差異，成功實(shí)現(xiàn)人乳頭瘤病毒HPV16 和HPV18 的精準(zhǔn)快速檢測。隨后又基于Cas14a 建立了Cas14-DETECTR 平臺，用于人類眼球顏色基因HERC2 中單核苷酸多態(tài)性（Single nucleotide Polymorphism，SNP）的分型鑒定。由于Cas14a 識別的是ssDNA 靶標(biāo)，反應(yīng)中先由硫代磷酸化引物（只有一條引物進(jìn)行標(biāo)記）進(jìn)行RPA 擴(kuò)增生成單標(biāo)記dsDNA 產(chǎn)物，隨后利用T7 核酸外切酶對沒有標(biāo)記的鏈進(jìn)行水解得到ssDNA 產(chǎn)物，隨后與crRNA 結(jié)合并激活Cas14a 的反式切割活性，對熒光淬滅的ssDNA 探針進(jìn)行切割。鑒于CRISPR/Cas14 系統(tǒng)對crRNA 和ssDNA 靶標(biāo)的錯配容忍度很低，能夠在沒有PAM 序列的條件下有效區(qū)分單堿基突變，該方法成功實(shí)現(xiàn)藍(lán)眼球和棕眼球的SNP 檢測，相比之下Cas12a 無法區(qū)分[20]。為了簡化反應(yīng)流程，實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增和檢測一體化，Wang 等[28]合并DETECTR 建立了Cas12aVDet（Cas12a-based visual detection）平臺，將所有試劑整合在一個管中，Cas12a 附著在管壁上，RPA 擴(kuò)增后通過離心將Cas12a 與之混合進(jìn)而完成切割，最后通過藍(lán)光激發(fā)實(shí)現(xiàn)裸眼判定。該方法能夠在與DETECTR保持相同靈敏度的條件下，成功將檢測時間從2 h 縮短至0.5 h，并且全程閉管反應(yīng)有效避免了交叉污染。

除了以上經(jīng)典檢測平臺之外，還有許多關(guān)于CRISPR/Cas 系統(tǒng)和RPA 的聯(lián)合應(yīng)用，大部分致力于特異性、靈敏度及便攜性上的升級。例如基于Cas12b 的CDetection（Cas12b-based DNA detection）用于HPV 檢測，靈敏度優(yōu)于DETECTR。同時利用單堿基錯配的tgRNA（Tuned guide RNA）提高檢測特異性，實(shí)現(xiàn)血型SNP 分型檢測[29]。例如基于Cas12a 的AIOD-CRISPR（All-In-One Dual CRISPR-Cas12a）用于SARS-CoV-2 檢測，利用產(chǎn)物在上下游設(shè)計兩條crRNA，通過提升Cas12a 的利用率來提升檢測靈敏度[30]。例如基于Cas13a 的DESCS（Dual methylation sensitive restriction endonucleases coupling with an RPA -assisted CRISPR/Cas13a System）用于SEPT9 基因的甲基化檢測，利用限制性內(nèi)切酶對甲基化位點(diǎn)的敏感性來調(diào)控后續(xù)RPA 反應(yīng)，存在甲基化位點(diǎn)則限制性內(nèi)切酶不產(chǎn)生切割，此時靶基因連續(xù)就能繼續(xù)發(fā)生RPA 擴(kuò)增，進(jìn)而完成Cas13a 的有效切割，結(jié)合側(cè)流層析試紙條實(shí)現(xiàn)可視化檢測[31]。

2.3 CRISPR/Cas 系統(tǒng)結(jié)合PCR

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase chain reaction，PCR）是最為傳統(tǒng)的核酸擴(kuò)增技術(shù)，屬于變溫擴(kuò)增，產(chǎn)物為dsDNA。HOLMES（one-hour low-cost multipurpose highly efficient system）是基于CRISPR/Cas12a 與PCR 結(jié)合的經(jīng)典平臺，較SHERLOCK 而言更適合DNA 靶標(biāo)檢測。通過含有PAM 序列的dsDNA 產(chǎn)物與crRNA 結(jié)合并激活Cas12a 的反式切割活性，通過探針切割反應(yīng)中熒光的變化完成。對于24nt crRNA 而言，HOLMES能夠識別PAM 序列以及PAM 后1～7 位堿基中單堿基突變，但是無法區(qū)分8～18 位堿基中的突變；對于16nt 和17nt crRNA 而言，HOLMES 能夠識別PAM 后1～16 位堿基中的突變。根據(jù)這一特性，在SNP 位點(diǎn)附近設(shè)計插入PAM 序列的PCR 引物，提升對SNP 檢測的特異性和靈敏度。HOLMES檢測平臺中，核酸擴(kuò)增技術(shù)并不局限于PCR，還可以采用其它等溫擴(kuò)增技術(shù)[32]。多重PCR 實(shí)現(xiàn)了單一檢測向高通量檢測的進(jìn)階，Wang 等[33]將多重PCR 與CRISPR/Cas12a 結(jié)合建立了多重檢測平臺，針對不同的靶標(biāo)設(shè)計不同的crRNA 序列，并將crRNA 分別裝載入不同的反應(yīng)孔中，最后通過熒光的變化實(shí)現(xiàn)五重檢測。普通PCR 擴(kuò)增耗時長達(dá)2 h 左右，快速PCR 能夠顯著縮短反應(yīng)時間至5 min 內(nèi)，Wang 等[34]將快速PCR 與CRISPR/Cas12a 結(jié)合建立了CRISPCR（CRISPR & rapid PCR in single capillary），將快速PCR 反應(yīng)試劑與Cas12a 切割反應(yīng)試劑分別置于反應(yīng)管的上下兩部分，擴(kuò)增后再混勻試劑進(jìn)行切割，紫外照射后實(shí)現(xiàn)裸眼判定。該方法與Cas12aVDet 有異曲同工之妙，但能夠在10 min 內(nèi)完成整體檢測，效率上更勝一籌。

2.4 CRISPR/Cas 系統(tǒng)結(jié)合LAMP

環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)（Loop mediated isothermal amplification，LAMP）是經(jīng)典的恒溫擴(kuò)增技術(shù)，能在短時間內(nèi)生成大量的dsDNA 產(chǎn)物，并且不依賴于熱循環(huán)儀器。為了簡化操作和避免反應(yīng)交叉污染，同一團(tuán)隊在HOLMES 的基礎(chǔ)上，將 CRISPR/Cas12b 和 LAMP 結(jié)合 建 立 了HOLMESv2 平臺，用于DNA 和RNA 靶標(biāo)的檢測，并有效區(qū)分SNP。在LAMP 產(chǎn)物中選取含有PAM位點(diǎn)的片段作為檢測靶標(biāo)，與crRNA 互補(bǔ)配對后激活Cas12a 的反式切割活性，根據(jù)熒光的變化進(jìn)行結(jié)果分析。該檢測平臺中的核酸擴(kuò)增技術(shù)并不局限于LAMP，也可以是PCR，或者是能夠生成單鏈產(chǎn)物的非對稱PCR。該方法還可以用于檢測基因甲基化，利用酸性亞硫酸鹽處理靶基因，甲基化的胞嘧啶保持不變，未甲基化的胞嘧啶變成尿嘧啶，經(jīng)過PCR 擴(kuò)增后，只有甲基化的產(chǎn)物與cr-RNA 配對結(jié)合，產(chǎn)生熒光的變化[35]。結(jié)合LAMP 的其它應(yīng)用也比較多，例如TB-QUICK 技術(shù)中，利用LAMP 進(jìn)行核酸擴(kuò)增，基于CRISPR/Cas12b 的cis切割活性實(shí)現(xiàn)結(jié)核桿菌的檢測[36]；CAL-LAMP（CRISPR/Cas12a assisted ligation-initiated LAMP）技術(shù)中，利用靶標(biāo)連接發(fā)夾引物進(jìn)而觸發(fā)LAMP反應(yīng)，基于CRISPR/Cas12a 的trans 切割活性實(shí)現(xiàn)microRNA let-7a 的檢測[37]。雖然LAMP 應(yīng)用十分廣泛，但是污染問題一直是限制該技術(shù)的最大弊端，為了避免交叉污染引起的假陽性，Qian 等[38]建立了尿嘧啶-LAMP，采用dUTP 代替dTTP，因此得到的是帶有dUTP 的擴(kuò)增產(chǎn)物。同時發(fā)現(xiàn)Cas12bde PAM 序列可以由“TTTN”更改為“UUUN”，且不影響各種切割活性。因此結(jié)合尿嘧啶糖基化酶（UDG）、尿嘧啶-LAMP 和CRISPR/Cas12a建立了ULC（UDG-LAMP-CRISPR）檢測平臺。先用UDG 進(jìn)行酶解消化，去除體系中殘存的dUTP擴(kuò)增產(chǎn)物，再進(jìn)行擴(kuò)增和后續(xù)的切割反應(yīng)，有效避免了反應(yīng)污染問題。ULC 方法雖然有效，但是一定程度上增加了操作的復(fù)雜性，同樣是為了解決污染問題，Bao 等[39]基于CRISPR/Cas9 建立了CUTLAMP（Contamination-free loop-mediated isothermal amplification），通過在LAMP 內(nèi)引物中添加PAM 序列，使得擴(kuò)增產(chǎn)物中含有重復(fù)的PAM 序列，在Cas9/crRNA 的識別下能夠?qū)a(chǎn)物進(jìn)行切割降解，從而避免污染問題，有效杜絕假陽性反應(yīng)。LAMP 技術(shù)是基于DNA 擴(kuò)增的檢測方法，針對RNA 靶標(biāo)，則需要通過反轉(zhuǎn)錄建立RT-LAMP，隨后將其與CRISPR/Cas12a 系統(tǒng)進(jìn)行結(jié)合，建立了iSCAN（in vitrospecific CRISPR-based assay for nucleic acids detection）檢測平臺，搭載側(cè)流層析試紙條實(shí)現(xiàn)SARS-CoV-2 的可視化檢測[40]；建立了opvCRISPR（a one-pot visual reverse transcription（RT）-LAMP-CRISPR）檢測平臺，通過藍(lán)光激發(fā)實(shí)現(xiàn)SARS-CoV-2 的目視分析，具有良好的特異性靈敏度以及準(zhǔn)確性[41]。

2.5 CRISPR/Cas 系統(tǒng)結(jié)合單鏈擴(kuò)增技術(shù)

對于原始靶標(biāo)信號來說，核酸擴(kuò)增能夠有效放大靶標(biāo)濃度，進(jìn)而激活Cas 蛋白的活性。像RPA、LAMP 等這些擴(kuò)增方法產(chǎn)物都是dsDNA，能夠直接與CRISPR 系統(tǒng)進(jìn)行結(jié)合，但是還有許多核酸擴(kuò)增技術(shù)的產(chǎn)物是ssDNA，與CRISPR 系統(tǒng)結(jié)合時具有一定的選擇性，例如CRISPR/Cas12 和CRISPR/Cas14 能夠識別單鏈靶標(biāo)，則能直接結(jié)合應(yīng)用，而CRISPR/Cas9 與之結(jié)合則需要添加互補(bǔ)鏈組裝成雙鏈靶標(biāo)。

滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)（Rolling circle amplification，RCA）是單鏈擴(kuò)增中研究較多的一種方法，能夠在短時間內(nèi)生產(chǎn)大量連續(xù)重復(fù)的ssDNA 產(chǎn)物。RACE（RCA-assisted CRISPR/Cas9 cleavage）檢測平臺是基于RCA 擴(kuò)增和CRISPR/Cas9 系統(tǒng)聯(lián)合建立的，整體包括擴(kuò)增和檢測兩個步驟。以靶標(biāo)為引物，對含有PAM 序列的環(huán)模板進(jìn)行RCA 擴(kuò)增，產(chǎn)生含有大量重復(fù)靶標(biāo)序列的單鏈產(chǎn)物；添加熒光淬滅的互補(bǔ)探針組裝成雙鏈產(chǎn)物，與crRNA 識別配對后激活Cas9 蛋白的切割活性，對雙鏈產(chǎn)物進(jìn)行切割，導(dǎo)致探針斷裂而釋放熒光，通過熒光的變化實(shí)現(xiàn)對miR-21 的檢測[42]。Xu 等[43]利用適配體進(jìn)行靶標(biāo)轉(zhuǎn)導(dǎo)，基于RCA 和CRISPR/Cas12a 建立了針對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的快速檢測方法。選擇菌體表面的A 蛋白和PBPa2 蛋白的適配體A 和B，其中適配體A 與磁珠偶連，適配體B用互補(bǔ)鏈進(jìn)行封閉，當(dāng)靶標(biāo)菌體與兩條適配體混合時，通過磁分離能夠?qū)ⅰ斑m配體A-菌體-適配體B”進(jìn)行分離，剩下封閉鏈用于RCA 擴(kuò)增，隨后與crRNA 互補(bǔ)后激活Cas12a 蛋白的反式切割活性，利用熒光變化完成檢測。Qing 等[44]利用RCA 作為一種轉(zhuǎn)導(dǎo)擴(kuò)增，結(jié)合CRISPR/Cas12a 實(shí)現(xiàn)不同類型靶標(biāo)的通用檢測。擴(kuò)增部分，在環(huán)模板中設(shè)計特定的一段通用序列，根據(jù)靶標(biāo)改變引物結(jié)合區(qū)序列，RCA 擴(kuò)增后都能夠得到含有重復(fù)通用互補(bǔ)序列的產(chǎn)物，而通用互補(bǔ)序列能夠與crRNA 互補(bǔ)后激活Cas12a 蛋白的反式切割活性。檢測部分，連接氧化石墨烯電極，切割探針斷裂后，無法與亞甲基藍(lán)標(biāo)記的報告探針互補(bǔ)配對，此時的報告探針被氧化石墨烯吸附，引起電信號升高，反之切割探針與報告探針形成雙鏈，無法被氧化石墨烯吸附，則電信號降低。通過RCA 的擴(kuò)增轉(zhuǎn)導(dǎo)、Cas12a 的反式切割以及電化學(xué)傳感器的分析，實(shí)現(xiàn)了疾病相關(guān)核酸以及小分子的通用檢測。

除RCA 應(yīng)用較多之外，還有一類依賴酶切反應(yīng)的單鏈擴(kuò)增技術(shù)，其中鏈置換擴(kuò)增技術(shù)（Strand displacement amplification，SDA）是典型代表。Wang 等[45]利用SDA 結(jié)合CRISPR/Cas12a 實(shí)現(xiàn)了PNKP 的超靈敏檢測。發(fā)夾底物末端的磷酸基團(tuán)在T4 PNKP 的作用下轉(zhuǎn)化成羥基，隨后發(fā)生SDA 反應(yīng)，在鏈置換酶的作用下生成dsDNA，進(jìn)而在切克內(nèi)切酶的作用下生成ssDNA，兩者都是Cas12a/crRNA 的靶標(biāo)，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對熒光淬滅探針的切割。TITAC-Cas（Target-induced transcription amplification to trigger the trans-cleavage activity of Cas13a）檢測平臺是基于RNA 聚合酶介導(dǎo)的SDA和CRISPR/Cas13a 的聯(lián)合，用于堿性磷酸酶ALP的檢測。磷酸基團(tuán)修飾的T7 啟動子序列與轉(zhuǎn)錄模板形成雙鏈底物，此時T7 啟動子序列能夠被外切酶水解。當(dāng)存在ALP 時，磷酸基團(tuán)被轉(zhuǎn)化成羥基從而使得T7 啟動子序列得到保護(hù)，進(jìn)而在T7 RAN 聚合酶的作用下生成RNA，與crRNA 結(jié)合后激活Cas13a 的反式切割活性，通過切割探針熒光的變化完成檢測[46]。指數(shù)擴(kuò)增技術(shù)（Exponential amplification reaction，EXPAR）是以單鏈靶標(biāo)為引物進(jìn)行擴(kuò)增的SDA 反應(yīng)。CAS-EXPAR（CRISPR/Cas9 triggered exponential amplification method）檢測平臺是基于EXPAR 和CRISPR/Cas9的聯(lián)合，與以往的不同是，該平臺是由CRISPR 激發(fā)EXPAR 擴(kuò)增。ssDNA 靶標(biāo)與PAMmer 小片段以及Cas9/sgRNA 混合后，形成含有PAM 序列的ss-DNA-dsDNA-Cas9/sgRNA 復(fù)合物，激活Cas9 蛋白活性對ssDNA 靶標(biāo)進(jìn)行切割，形成的產(chǎn)物能夠作為EXPAR 的引物觸發(fā)后續(xù)的擴(kuò)增反應(yīng)，對單核增生李斯特菌檢測具有良好的特異性和靈敏度[47]。Cas-G4EX（a CRISPR/Cas9 system mediated G4-EXPAR）檢測平臺是基于EXPAR、G4 核酸酶和CRISPR/Cas9 的聯(lián)合，用于ssRNA 和ssDNA 的方法學(xué)檢測。與CAS-EXPAR 前半部分原理相似，單鏈靶標(biāo)與PAMmer 小片段和Cas9/sgRNA 形成復(fù)合物，切斷單鏈靶標(biāo)為EXPAR 提供引物。EXPAR擴(kuò)增模板中設(shè)計有兩個切割位點(diǎn)，因此一級產(chǎn)物能夠再次觸發(fā)二次擴(kuò)增，終產(chǎn)物是富含鳥嘌呤的單鏈核酸，能夠在氯高鐵血紅素的作用下折疊成G 四面體，并呈現(xiàn)出類過氧化物酶活性，催化底物ABTS 發(fā)生顏色變化[48]。

2.6 CRISPR/Cas 系統(tǒng)結(jié)合核酸免擴(kuò)增技術(shù)

對于低濃度靶標(biāo)而言，核酸擴(kuò)增雖能夠顯著放大原始信號，促進(jìn)Cas 蛋白活性最大化，但也存在一些弊端，例如需要引物設(shè)計、需要擴(kuò)增儀器、可能造成污染等等，因此許多免核酸擴(kuò)增的技術(shù)與CRISPR/Cas 系統(tǒng)也開始進(jìn)行結(jié)合應(yīng)用。Choi等[49]利用雙納米金傳感器，結(jié)合CRISPR/Cas12a實(shí)現(xiàn)了癌癥核酸標(biāo)志物的免擴(kuò)增直接檢測。20 nm 金顆粒上連接有7 nm 長的ssDNA 熒光探針，60 nm 金顆粒上連接有9 nm 長的ssDNA 探針，兩條探針通過堿基配對組裝后，探針的熒光被60 nm 金顆粒淬滅。根據(jù)核酸靶標(biāo)設(shè)計crRNA，不存在靶標(biāo)則無法激活Cas12a 的活性。當(dāng)單鏈核酸靶標(biāo)存在時，能夠與crRNA/Cas12a 結(jié)合并激活切割活性，將探針的單鏈部分切斷，致使熒光恢復(fù)，20 nm 金顆粒則能進(jìn)一步增強(qiáng)熒光，通過熒光的變化能實(shí)現(xiàn)對癌癥核酸標(biāo)志物靶標(biāo)的有效靈敏檢測。Li 等[50]利用金屬核酸酶的切割特性，結(jié)合CRISPR/Cas12a 實(shí)現(xiàn)重金屬的超靈敏檢測。根據(jù)鉛離子的金屬核酸酶的底物鏈設(shè)計crRNA，由于序列封閉使其無法與crRNA 結(jié)合，當(dāng)鉛離子存在時，能夠切割底物鏈，釋放游離的ssDNA，進(jìn)而與Cas12a/crRNA 結(jié)合并激活反式切割活性，通過熒光的變化實(shí)現(xiàn)鉛離子的直接檢測。Niu 等[51]利用適配體的生物功能，結(jié)合CRISPR/Cas12a 建立Molecular Radar（Random molecular aptamer-dependent CRISPR-assist reporter）檢測平臺，實(shí)現(xiàn)小分子物質(zhì)的直接檢測檢測。根據(jù)小分子物質(zhì)的適配體設(shè)計crRNA，適配體與Cas 12a/crRNA 結(jié)合并激活反式切割活性，熒光強(qiáng)度發(fā)生變化。當(dāng)靶物質(zhì)存在時，能夠與適配體結(jié)合引起適配體空間構(gòu)象的變化，導(dǎo)致其無法與crRNA 結(jié)合，也就不存在反式切割。體系中靶物質(zhì)濃度與熒光強(qiáng)度成反比，通過的熒光強(qiáng)度能夠?qū)崿F(xiàn)小分子靶標(biāo)的靈敏檢測。Sha 等[52]將CRISPR/Cas13a 和CRISPR/Cas14a 進(jìn)行串聯(lián)，實(shí)現(xiàn)了microRNA 的超靈敏直接檢測。利用microRNA 作為靶標(biāo)，與Cas13a/cr-RNA 結(jié)合并激活反式切割活性，將發(fā)夾底物的環(huán)單鏈進(jìn)行切割，隨后在小立足點(diǎn)的作用下與Cas14a/crRNA 互補(bǔ)結(jié)合并激發(fā)反式切割活性，切割體系中熒光淬滅的探針，通過熒光的變化實(shí)現(xiàn)microRNA 的免擴(kuò)增檢測。

3 CRISPR/Cas 核酸傳感器在食品快速檢測中的應(yīng)用

核酸傳感器是利用核酸貫穿整體檢測，實(shí)現(xiàn)“靶標(biāo)信號-核酸信號-化學(xué)信號” 的層層轉(zhuǎn)化，CRISPR/Cas 核酸傳感器則是在核酸傳感器的基礎(chǔ)上，將CRISPR/Cas 系統(tǒng)引入其中，完成整體檢測信號的識別、放大與轉(zhuǎn)導(dǎo)，顯著提高檢測靈敏度和特異性。目前，CRISPR/Cas 核酸傳感器已逐步應(yīng)用于食品安全的快速檢測，例如食源性致病微生物、生物毒素、金屬離子、生物技術(shù)食品、肉類摻假以及非法添加等方面。

3.1 食源性致病菌的檢測

食源性致病菌引發(fā)的食品安全事件長居榜首。致病菌的CRISPR/Cas 核酸傳感器檢測可分為兩大類（圖2）：第一，通過增菌后提取基因組，結(jié)合核酸擴(kuò)增技術(shù)和Cas 蛋白的切割能力建立核酸傳感器檢測；第二，結(jié)合適配體實(shí)現(xiàn)致病菌向核酸的轉(zhuǎn)化，隨后直接或者間接與CRISPR/Cas 系統(tǒng)結(jié)合，建立相應(yīng)的核酸傳感器，實(shí)現(xiàn)免培養(yǎng)免提取檢測。Peng 等[53]基于核酸擴(kuò)增和CRISPR/Cas12a 建立了CRISPR/Cas-熒光傳感器，用于金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的檢測。通過基因組提取進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，隨后將擴(kuò)增產(chǎn)物與Cas12a/crRNA 結(jié)合，利用反式切割活性切割熒光淬滅探針，通過熒光強(qiáng)度的變化完成金黃色葡萄球菌的檢測，最低檢測限為103CFU/mL。Mukama 等[5]基于核酸擴(kuò)增、CRISPR/Cas12a 和試紙條技術(shù)建立了CRISPR/Cas-側(cè)流層析傳感器，用于銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）的檢測。通過基因組提取進(jìn)行LAMP 擴(kuò)增，隨后將擴(kuò)增產(chǎn)物與Cas12a/crRNA 結(jié)合，熒光淬滅探針作為連接體能夠?qū)⒓{米金固定在試紙條的檢測線上。當(dāng)探針在反式切割活性作用下被切斷后，納米金則無法被固定在檢測線上，通過檢測線的有無實(shí)現(xiàn)了銅綠假單胞菌的定性檢測。Li 等[54]基于核酸擴(kuò)增、CRISPR/Cas12a 和電化學(xué)技術(shù)建立了CRISPR/Cas-電化學(xué)傳感器，用于單核細(xì)胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）的檢測。通過基因組提取進(jìn)行RAA 擴(kuò)增（原理與RPA 相同），隨后將擴(kuò)增產(chǎn)物與Cas12a/crRNA 結(jié)合，利用反式切割活性將電極表面ssDNA 探針切斷引發(fā)電信號變化，實(shí)現(xiàn)了單核增生李斯特菌的檢測，最低檢測限為26 CFU/mL。Gootenberg 等[25]基于核酸擴(kuò)增和CRISPR/Cas13 建立了CRISPR/Cas-雙重?zé)晒鈧鞲衅鳎糜诮瘘S色葡萄球菌和銅綠假單胞菌的檢測。通過基因組提取進(jìn)行多重RPA 擴(kuò)增，隨后將擴(kuò)增產(chǎn)物反轉(zhuǎn)錄后與Cas13a/crRNA 和Cas13b/crRNA 結(jié)合，根據(jù)Cas13 蛋白對切割探針的偏好性，采取Cas13a 切割poly U 探針，Cas13b 切割poly A 探針，通過兩種熒光信號強(qiáng)度的變化，實(shí)現(xiàn)了金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌的同時檢測。Shen 等[55]基于適配體、核酸擴(kuò)增和CRISPR/Cas13a 建立了CRISPR/Cas-熒光傳感器，用于腸炎沙門氏菌（Salmonella Enteritidis）的免培養(yǎng)檢測。利用“適配體-T7 啟動區(qū)-引物結(jié)合區(qū)”設(shè)計發(fā)夾探針，探針中的適配體能夠有效識別靶標(biāo)并與之結(jié)合，通過空間構(gòu)象的變化釋放出引物區(qū)，結(jié)合引物后在DNA 聚合酶的作用下形成dsDNA，進(jìn)而在T7 RNA 聚合酶的作用下生成ssRNA，與Cas13a/cr-RNA 結(jié)合后激活反式切割活性，通過熒光強(qiáng)度的變化實(shí)現(xiàn)腸炎沙門氏菌的檢測，最低檢測限為1 CFU/mL。Li 等[50]基于適配體和CRISPR/Cas12a 建立了CRISPR/Cas-熒光傳感器，用于鮑曼不動桿菌（Acinetobacter baumannii）的免培養(yǎng)免擴(kuò)增檢測。利用磁珠探針進(jìn)行菌體捕獲，探針中的適配體與靶標(biāo)結(jié)合后釋放互補(bǔ)鏈，而互補(bǔ)鏈能夠結(jié)合Cas12a/crRNA 激活反式切割活性，通過熒光強(qiáng)度的變化實(shí)現(xiàn)鮑曼不動桿菌的檢測，最低檢測限為3 CFU/mL。

圖2 食源性致病菌的CRISPR/Cas 核酸傳感器檢測流程示意圖Fig.2 Schematic diagram of CRISPR/Cas nucleic acid biosensors detection process for foodborne pathogens

3.2 生物毒素的檢測

生物毒素是由動物、植物、微生物產(chǎn)生的有毒有害物質(zhì)，引發(fā)食品安全事件較多的是微生物分泌的毒素。由于毒素屬于非核酸物質(zhì)，所以在利用CRISPR/Cas 核酸傳感器檢測時大多需要采用適配體進(jìn)行核酸轉(zhuǎn)化（圖3）。Abnous 等[56]基于適配體、CRISPR/Cas12a、和納米金建立了CRISPR/Cas-比色傳感器，用于黃曲霉毒素M1（AFM1）的檢測。利用適配體和作為Cas12a/crRNA 的激活鏈，當(dāng)AFM1存在時，適配體與靶標(biāo)結(jié)合，則無法結(jié)合Cas12a/crRNA，此時Cas12a 沒有活性，納米金表面的ssDNA 引物和磷酸基團(tuán)修飾的ssDNA 鎖式探針能夠在T4 連接酶和Phi29 DNA 聚合酶的作用下發(fā)生RCA 反應(yīng)，生成大量的單鏈環(huán)繞在納米金表面。加入對硝基苯酚后，體系呈現(xiàn)出綠色。若是沒有AFM1，則適配體與Cas12a/crRNA 結(jié)合進(jìn)而激活反式切割活性，能夠?qū)⒓{米金表面的ssDNA 引物和磷酸基團(tuán)修飾的ssDNA 鎖式探針切斷，則無法發(fā)生后續(xù)的RCA 擴(kuò)增，導(dǎo)致納米金表面裸露。加入對硝基苯酚后，在納米金的類過氧化物酶活性的催化下，對硝基苯酚被氧化成氨基苯酚，體系由綠色變?yōu)闊o色。通過顏色的變化實(shí)現(xiàn)AFM1 的超靈敏檢測，最低檢測限為0.05 ng/L。脂多糖（LPS）是一種內(nèi)毒素，Wang 等[57]基于適配體、金屬核酸酶和CRISPR/Cas12a 建立了CRISPR/Cas-納米機(jī)器熒光傳感器，用于LPS 的檢測。將肼基標(biāo)記ssDNA（ASI）和鎂離子金屬核酸酶的底物鏈（SS）修飾在磁珠（MB）表面，構(gòu)建MB@SS/ASI復(fù)合物，醛基標(biāo)記的ssDNA（ASII）中包含有金屬核酸酶的酶鏈，ASII 能夠通過C=N 鍵與ASI 相連，組裝為MB@SS/ASI/ASII 納米機(jī)器。隨后ASII的酶鏈部分與SS 互補(bǔ)配對組裝成完整的金屬核酸酶，在鎂離子的作用切斷SS，釋放出游離的單鏈靶標(biāo)，ASII 則再次與新的SS 鏈互補(bǔ)并切割，往復(fù)循環(huán)至SS 全被切斷。通過磁分離將游離的單鏈靶標(biāo)分離，與Cas12a/crRNA 結(jié)合進(jìn)而激活反式切割活性，熒光信號顯著增強(qiáng)。在LPS 的檢測體系中，ASII 中含有適配體互補(bǔ)序列，與適配體形成雙鏈而封閉活性，當(dāng)LPS 存在時，能夠與適配體結(jié)合釋放ASII，觸發(fā)后續(xù)反應(yīng)，熒光增強(qiáng)。如果沒有LPS，則ASII 與適配體維持雙鏈狀態(tài)，進(jìn)而無法觸發(fā)后續(xù)反應(yīng)，沒有熒光信號。通過熒光信號強(qiáng)度的變化實(shí)現(xiàn)LPS 的檢測分析，最低檢測限為7.31 fg/mL。

圖3 生物毒素的CRISPR/Cas 核酸傳感器檢測流程示意圖Fig.3 Schematic diagram of CRISPR/Cas nucleic acid biosensors detection process for biotoxin

3.3 金屬離子的檢測

食品安全風(fēng)險檢測中提及的重金屬包含鉛、汞、銀、鎘、鉻等，目前的傳感器快檢技術(shù)主要是依基于金屬離子對應(yīng)的核酸酶開展研究，實(shí)現(xiàn)重金屬離子向核酸信號的轉(zhuǎn)化，同樣，CRISPR/Cas 核酸傳感器也采取相同的策略（圖4）。Li 等[50]基于金屬核酸酶和CRISPR/Cas12a 建立了CRISPR/Cas-熒光傳感器，用于鉛離子的檢測。將鉛離子金屬核酸酶修飾在磁珠表面，并根據(jù)底物鏈設(shè)計crRNA，由于底物鏈互補(bǔ)且沒有PAM 序列，導(dǎo)致其無法激活Cas12a 的活性，熒光信號不變。當(dāng)鉛離子存在時，切割底物鏈釋放出游離的ssDNA，進(jìn)而與Cas12a/crRNA 結(jié)合并激活反式切割活性，熒光信號增強(qiáng)。通過熒光的變化實(shí)現(xiàn)鉛離子的檢測，最低檢測限為0.053 nmol/L。除重金屬外，食品中鈉離子作為核心營養(yǎng)素也備受關(guān)注，過多攝入也會影響人體健康。Xiong 等[58]基于金屬核酸酶和CRISPR/Cas12a 建立了CRISPR/Cas-熒光傳感器，用于鈉離子的檢測。將鈉離子金屬核酸酶底物鏈通過生物素-鏈霉親和素作用進(jìn)行固定，沒有鈉離子時，底物鏈與酶鏈組裝為完整的金屬核酸酶，無法激活Cas12a 的活性，熒光信號不變。當(dāng)鈉離子存在時，能夠切割底物鏈釋放出游離的ssDNA，進(jìn)而與Cas12a/crRNA 結(jié)合并激活反式切割活性，熒光信號增強(qiáng)。通過熒光的變化實(shí)現(xiàn)鈉離子的檢測，最低檢測限為0.1 nmol/L。

圖4 金屬離子的CRISPR/Cas 核酸傳感器檢測流程示意圖Fig.4 Schematic diagram of CRISPR/Cas nucleic acid biosensors detection process for metal ions

3.4 生物技術(shù)食品的檢測

生物技術(shù)食品一般是指基于生物技術(shù)得到的食品，目前大家比較熟識的主要是轉(zhuǎn)基因食品和基因編輯食品。采用CRISPR/Cas 核酸傳感器檢測需要提取基因組、核酸擴(kuò)增和Cas 蛋白切割3 個步驟（圖5）。Wu 等[59]基于核酸擴(kuò)增、CRISPR/Cas12a 和自主便攜設(shè)備建立了CRISPR/Cas-便攜式熒光傳感器，用于轉(zhuǎn)基因大豆的檢測。通過基因組提取，針對35S 啟動子和大豆內(nèi)源基因（Lectin）進(jìn)行雙重LAMP 擴(kuò)增，隨后將反應(yīng)管倒置，擴(kuò)增產(chǎn)物分別與兩個反應(yīng)孔中的Cas12a/crRNA 結(jié)合，利用反式切割活性切割熒光淬滅探針，通過兩個孔的熒光變化完成轉(zhuǎn)基因大豆的檢測，最低檢測限為0.1%。Liu 等[60]基于核酸擴(kuò)增和CRISPR/Cas12a建立了CRISPR/Cas-熒光傳感器，用于轉(zhuǎn)基因玉米的檢測。通過基因組提取進(jìn)行RPA 擴(kuò)增，隨后將擴(kuò)增產(chǎn)物與Cas12a/crRNA 結(jié)合，在反式切割作用下通過熒光變化完成轉(zhuǎn)基因玉米中NOS 終止子和35S 啟動子的檢測，最低檢測限為10 拷貝。

圖5 生物技術(shù)食品的CRISPR/Cas 核酸傳感器檢測流程示意圖Fig.5 Schematic diagram of CRISPR/Cas nucleic acid biosensors detection process for biotech foods

3.5 肉制品成分的檢測

肉制品中的肉類摻假問題是全球熱點(diǎn)，從我國的“掛羊頭賣狗肉”到國外的“馬肉事件”，以次充好、以假亂真的現(xiàn)象越來越常見。采用CRISPR/Cas 核酸傳感器檢測同樣需要提取基因組、核酸擴(kuò)增和Cas 蛋白切割3 個步驟（圖6）。Liu 等[60]基于核酸擴(kuò)增和CRISPR/Cas12a 建立了CRISPR/Cas-熒光傳感器，用于肉制品中肉類成分的檢測。通過基因組提取進(jìn)行RPA 擴(kuò)增，隨后將擴(kuò)增產(chǎn)物與Cas12a/crRNA 結(jié)合，在反式切割作用下通過熒光變化實(shí)現(xiàn)豬肉、牛肉和鴨肉的真實(shí)性檢測，最低檢測限分別為100 拷貝、10 拷貝和10 拷貝。

圖6 肉制品的CRISPR/Cas 核酸傳感器檢測流程示意圖Fig.6 Schematic diagram of CRISPR/Cas nucleic acid biosensors detection process for meat product

3.6 非法添加物的檢測

一些食品安全事件是由于非法添加引起的，例如2008年的“三聚氰胺事件”，對中國奶業(yè)商業(yè)信譽(yù)造成了重創(chuàng)，就是因為生產(chǎn)者違法向奶粉中添加“非法添加物”三聚氰胺，導(dǎo)致眾多嬰幼兒出現(xiàn)腎結(jié)石甚至腎損傷。采用CRISPR/Cas 核酸傳感器檢測則需要將非法添加物轉(zhuǎn)化成核酸進(jìn)行分析（圖7）。Qiao 等[61]基于適配體和CRISPR/Cas12a 建立了兩個CRISPR/Cas-鎖式熒光傳感器，用于三聚氰胺的檢測，檢測準(zhǔn)確性及靈敏度能夠與HPLC相匹配。第1 個傳感器中，利用一條互補(bǔ)鏈與適配體配對，當(dāng)三聚氰胺與適配體結(jié)合后釋放互補(bǔ)鏈，與Cas12a/crRNA 結(jié)合并激活反式切割活性，通過熒光強(qiáng)度的變化完成檢測，最低檢測限為38 nmol/L；第2 個傳感器中，利用一條互補(bǔ)鏈與兩條適配體配對，后續(xù)反應(yīng)一致，最低檢測限可達(dá)到0.24 μmol/L。

圖7 非法添加物的CRISPR/Cas 核酸傳感器檢測流程示意圖Fig.7 Schematic diagram of CRISPR/Cas nucleic acid biosensors detection process for illegal additives

4 展望

CRISPR/Cas 核酸傳感器具有諸多優(yōu)勢，但在未來的發(fā)展中仍具挑戰(zhàn)。第一，多重檢測發(fā)展有局限，雖然能夠通過不同的Cas 蛋白的選擇性或者分離反應(yīng)能夠?qū)崿F(xiàn)多重檢測，但是方法的通用性不強(qiáng)。尤其是針對食品安全風(fēng)險檢測而言，能夠?qū)崿F(xiàn)單一體系下的多重檢測更有研究意義，因此未來還應(yīng)該在CRISPR/Cas 的多重分析上尋求新的突破，實(shí)現(xiàn)多重檢測可行化、簡便化。第二，核酸擴(kuò)增技術(shù)雖能夠顯著放大原始信號，提升傳感器的靈敏度，但是擴(kuò)增過程中容易引起交叉污染造成結(jié)果假陽性。針對這一弊端雖然也有多種技術(shù)進(jìn)行改進(jìn)，但是卻增加了操作上的繁瑣，未來還需要進(jìn)一步探索出更有效的方法。第三，結(jié)果呈現(xiàn)方面有比色、熒光、電信號等，其中液相的比色分析、部分熒光分析和固相的試紙條分析能夠?qū)崿F(xiàn)裸眼檢測，能夠應(yīng)用在現(xiàn)場分析，但是電化學(xué)平臺則推廣受限，未來應(yīng)該開發(fā)更多具有自主知識產(chǎn)權(quán)的小型便攜設(shè)備，擴(kuò)大基礎(chǔ)科研走向現(xiàn)場應(yīng)用。第四，食品安全檢測應(yīng)用方面，雖然涵蓋了食源性致病菌、生物毒素等核酸和非核酸靶標(biāo)，但是相關(guān)的研究并不多，并且大部分是以CRISPR/Cas12a 系統(tǒng)開展的研究，此外在農(nóng)獸藥殘留檢測等關(guān)鍵風(fēng)險因子方面仍沒有相關(guān)的研究，未來還需要進(jìn)一步拓展CRISPR/Cas 的應(yīng)用范疇。