青花菜花蕾發(fā)育LncRNAs 內(nèi)參基因篩選

裴徐梨，馮鵬宇，唐 征，李亞梅，焦 鵬，荊贊革，

（1.昆明學(xué)院 農(nóng)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，云南 昆明 650214；2.溫州科技職業(yè)學(xué)院 農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院，浙江 溫州 325006）

長(zhǎng) 鏈 非 編 碼RNA（Long non-coding RNAs，LncRNAs）是一類長(zhǎng)度超過(guò)200 bp 的轉(zhuǎn)錄本[1]，其在調(diào)控下游基因表達(dá)、增強(qiáng)mRNA 穩(wěn)定性和調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)活性等生理活動(dòng)中發(fā)揮著重要作用[2-3]。目前，已在 水 稻（Oryza sativaL.）[4]、擬 南 芥（Arabidopsis thalianaL.）[5]、白菜（Brassica pekinensisL.）[6]、黃瓜（Cucumis sativusL.）[3]和木本植物如櫻桃（Cerasus pseudocerasusL.）[7]、葡萄（Vitis viniferaL.）[1]等物種中鑒定出大量的LncRNAs。LncRNAs 具有保守性低、表達(dá)量低和組織特異性強(qiáng)等特點(diǎn)[2-8]。例如，茄科中LncRNAs 的序列分析表明，不同物種中LncRNAs 的序列保守性很低。LncRNA-314在普通番茄和醋栗番茄中有特異性表達(dá)，而在潘那利番茄中則沒(méi)有表達(dá)[9]。水稻LncRNAs 的全基因組鑒定和分析表明，與哺乳動(dòng)物相比，LncRNAs 表達(dá)具有較高的組織特異性或階段特異性[4]。青花菜（Brassica oleraceavar.italica）主要可食用部分為綠色花球，由肉質(zhì)花莖和小花梗及綠色的花蕾群所組成[8]。花蕾的發(fā)育與青花菜的外觀品質(zhì)密切相關(guān)。而LncRNAs 在花蕾發(fā)育過(guò)程中起著重要的調(diào)控作用[6-10]。本研究通過(guò)前期的青花菜全基因組高通量測(cè)序選取了16 個(gè)LncRNAs 作為候選內(nèi)參基因。利用geNorm、NormFinder 和BestKeeper 軟件評(píng)估其在花蕾不同部位和不同發(fā)育時(shí)期中的表達(dá)穩(wěn)定性，篩選適宜的內(nèi)參基因，為進(jìn)一步準(zhǔn)確定量分析青花菜花蕾LncRNAs表達(dá)水平提供適宜內(nèi)參。

1 材料和方法

1.1 材料

以青花菜高代自交系KU19-3 為材料，于開(kāi)花期采集花蕾。花蕾不同部位分別為花梗、花萼、花瓣、雌蕊和雄蕊；花蕾發(fā)育分為6 個(gè)時(shí)期，長(zhǎng)度分別為1、2、3、4、5、6 mm。

1.2 方法

1.2.1 RNA 提取與cDNA 合成 青花菜總RNA 的提取按照植物RNA 提取試劑盒[寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司]操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。質(zhì)量檢測(cè)合格后，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第1鏈。

1.2.2 內(nèi)參基因的選擇與qRT-PCR 引物設(shè)計(jì) 在前期高通量測(cè)序的基礎(chǔ)上，篩選了16個(gè)在細(xì)胞質(zhì)雄性不育系及其保持系中表達(dá)相對(duì)穩(wěn)定的LncRNAs（XLOC_000108、XLOC_000400、XLOC_007087、XLOC_008536、XLOC_008536、XLOC_010342、XLOC_012179、XLOC_015579、XLOC_021473、XLOC_025578、XLOC_029328、XLOC_030832、XLOC_034059、XLOC_034687、XLOC_037050和XLOC_039609）作為青花菜花蕾不同部位和不同發(fā)育時(shí)期的候選內(nèi)參基因，各自引物序列見(jiàn)表1。

表1 16個(gè)候選LncRNAs引物序列及相關(guān)數(shù)據(jù)Tab.1 Primer sequences and related data of 16 candidate LncRNAs

續(xù)表1 16個(gè)候選LncRNAs引物序列及相關(guān)數(shù)據(jù)Tab.1（Continued）Primer sequences and related data of 16 candidate LncRNAs

1.2.3 候選內(nèi)參基因qRT-PCR 擴(kuò)增 qRT-PCR 在ABI 7500 上進(jìn)行，反應(yīng)體系和程序參照裴徐梨等[11]的方法。擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后觀察溶解曲線，檢測(cè)引物的特異性。

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 將cDNA模板依次稀釋10倍得到5 個(gè)梯度（1、10-1、10-2、10-3、10-4）。根據(jù)PCR得到的反應(yīng)結(jié)果繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算擴(kuò)增效率（E），E=（10-1/slope-1）×100%，slope 為 標(biāo) 準(zhǔn) 曲 線 的斜率。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

利用geNorm、NormFinder 和BestKeeper 軟件對(duì)候選內(nèi)參LncRNAs 進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析。geNorm和NormFinder 軟件需先將平均循環(huán)閾值（ΔCt）轉(zhuǎn)換為相對(duì)表達(dá)量Q 值（Q=E-ΔCt）才能進(jìn)行數(shù)據(jù)輸入，BestKeeper 軟件可以直接輸入qRT-PCR 得到的ΔCt值[9]。將3 個(gè)軟件分別輸出的平均表達(dá)穩(wěn)定值M 和S、標(biāo)準(zhǔn)差SD 值進(jìn)行表達(dá)穩(wěn)定性排名，并對(duì)其求平均得出綜合排名。

2 結(jié)果與分析

2.1 候選內(nèi)參LncRNAs表達(dá)豐度分析

16 個(gè)候選內(nèi)參LncRNAs 樣品Ct 值都集中在19～30，表達(dá)豐度適中。在青花菜花蕾不同部位中，XLOC_034059（24.0、21.3、20.5、22.2、20.9）和XLOC_000108（24.4、22.5、21.2、23.7、24.1）的Ct 值最低。在青花菜花蕾不同發(fā)育時(shí)期中，XLOC_039609（20.2、21.6、21.2、21.2、21.1、22.8）和XLOC_034059（19.9、20.8、20.7、20.7、20.8、22.2）的Ct值最低（表2）。

表2 候選LncRNAs在青花菜花蕾樣本中的Ct值Tab.2 Ct values of candidate LncRNAs in sample of flower bud of broccoli

續(xù)表2 候選LncRNAs在青花菜花蕾樣本中的Ct值Tab.2（Continued）Ct values of candidate LncRNAs in sample of flower bud of broccoli

2.2 候選內(nèi)參LncRNAs表達(dá)穩(wěn)定性分析

2.2.1 geNorm 分析 在青花菜花蕾不同部位中，16個(gè)候選內(nèi)參基因的平均表達(dá)穩(wěn)定值（M 值）都小于標(biāo)準(zhǔn)值1.5，其中XLOC_000400和XLOC_008536的M 值為0.01，在16 個(gè)候選內(nèi)參LncRNAs 中最低，表明這2個(gè)候選內(nèi)參基因在不同部位中表達(dá)穩(wěn)定性最高。XLOC_015579（M=0.75）的M 值最大，其次是XLOC_000108（M=0.60），兩者表達(dá)穩(wěn)定性較低（圖1）。由geNorm 配對(duì)差異柱形圖（圖2）可知，配對(duì)變異值（V2/3）為0.068，小于0.15，表明最適合內(nèi)參基因個(gè)數(shù)為2。綜合上述結(jié)果，青花菜花蕾不同部位中表達(dá)最穩(wěn)定的基因組合是XLOC_000400和XLOC_008536。

圖1 geNorm 軟件分析青花菜花蕾不同部位候選LncRNAs的表達(dá)穩(wěn)定性Fig.1 Expression stability analysis of candidate LncRNAs in different parts of flower buds of broccoli by geNorm software

圖2 geNorm軟件分析青花菜花蕾不同部位候選LncRNAs的配對(duì)變異值Fig.2 Pairwise variation values of candidate LncRNAs in different parts of flower buds of broccoli by geNorm software

geNorm 分析結(jié)果顯示，在青花菜花蕾不同發(fā)育時(shí)期中候選內(nèi)參LncRNAs 的M 值，由高到低依次為XLOC_015579＞XLOC_034059＞XLOC_007980＞XLOC_030832＞XLOC_000400＞XLOC_012179＞XLOC_029238＞XLOC_007087＞XLOC_037050＞XLOC_010342＞XLOC_034687＞XLOC_025578＞XLOC_021473＞XLOC_039609＞XLOC_000108/XLOC_008536（圖3）。

XLOC_015579的M 值為0.16，是16 個(gè)候選基因最大值，表明其不適合作為內(nèi)參基因。XLOC_000108和XLOC_008536基因的M 值為0.02，為16個(gè)內(nèi)參基因中最低。由geNorm 柱形圖（圖4）可知，配對(duì)變異值（V2/3）為0.023，小于0.15，表明最適內(nèi)參基因個(gè)數(shù)為2。綜合以上結(jié)果，青花菜花蕾不同發(fā)育時(shí)期表達(dá)適宜的內(nèi)參組合是XLOC_000108和XLOC_008536。

圖4 geNorm軟件分析青花菜花蕾不同發(fā)育時(shí)期候選LncRNAs的配對(duì)變異值Fig.4 Pairwise variation values of candidate LncRNAs in different developmental stages of flower buds of broccoli by geNorm software

2.2.2 NormFinder分析 NormFinder軟件分析結(jié)果（表3）表明，在青花菜花蕾不同部位中，XLOC_021473的平均表達(dá)穩(wěn)定值（S 值）最小，為0.047，說(shuō)明它的穩(wěn)定性是最高的。其次是XLOC_034059（S=0.074）和XLOC_000400（S=0.149）。XLOC_015579的 S值最大，高達(dá) 1.149，最不穩(wěn)定。

在青花菜花蕾不同發(fā)育時(shí)期中，XLOC_021473（S=0.030）的S 值最小，穩(wěn)定性最高。其次是XLOC_039609（S=0.032）和XLOC_00108（S=0.033），而XLOC_015579（S=0.205）的S值最大，最不穩(wěn)定（表3）。

表3 NormFinder軟件分析候選LncRNAs在青花菜花蕾不同部位和不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)穩(wěn)定性Tab.3 Expression stability analysis of candidate LncRNAs in different parts and different developmental stages of flower buds of broccoli by NormFinder software

2.2.3 BestKeeper 分析 在青花菜花蕾不同部位中，標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD 值）較為穩(wěn)定的LncRNAs 是XLOC_025578（SD=0.72）、XLOC_010342（SD=0.84）、XLOC_008536（SD=0.93）。此 外，最 不 穩(wěn) 定 是XLOC_015579（SD=1.70）。表明XLOC_025578適合作青花菜花蕾不同部位的內(nèi)參基因（表4）。

在青花菜花蕾不同發(fā)育時(shí)期 SD 值較小的LncRNAs 是XLOC_034059（SD=0.44）、XLOC_007980（SD=0.45）和XLOC_007087（SD=0.49）。此外，最不穩(wěn)定基因是XLOC_037050和XLOC_000400（SD=0.62）。表明XLOC_034059適合作青花菜花蕾不同發(fā)育時(shí)期的內(nèi)參基因（表4）。

表4 BestKeeper軟件分析候選LncRNAs在青花菜花蕾不同部位和不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)穩(wěn)定性Tab.4 Expression stability analysis of candidate LncRNAs in different parts and different developmental stages of flower buds of broccoli by BestKeeper software

2.2.4 3 個(gè)軟件綜合分析 3 個(gè)分析軟件因算法不同，在花蕾的不同部位和不同發(fā)育時(shí)期中所得的結(jié)果有所差別。通過(guò)對(duì)3個(gè)軟件的基因穩(wěn)定性排名求平均得出綜合排名，發(fā)現(xiàn)在花蕾不同部位中適宜的內(nèi)參基因?qū)κ荴LOC_000400（3.0）和XLOC_008536（3.3）（表5）。在花蕾不同發(fā)育時(shí)期中適宜的內(nèi)參基因?qū)閄LOC_039609（3.3）和XLOC_021473（3.7）（表6）。

表5 候選LncRNAs基因在青花菜花蕾不同部位綜合排名Tab.5 Comprehensive ranking of candidate LncRNAs in different parts of flower buds of broccoli

表6 候選LncRNAs在青花菜花蕾發(fā)育不同發(fā)育時(shí)期綜合排名Tab.6 Comprehensive ranking of candidate LncRNAs in different developmental stages of flower buds of broccoli

3 結(jié)論與討論

實(shí)時(shí)熒光定量PCR 是檢測(cè)基因相對(duì)表達(dá)量的常用技術(shù)[12-13]，其準(zhǔn)確性主要依賴于選擇適宜的內(nèi)參基因[14-15]。因此，篩選出合適的內(nèi)參基因?qū)ρ芯壳嗷ú嘶ɡ俨煌课缓筒煌l(fā)育時(shí)期LncRNAs 的相對(duì)表達(dá)量尤為重要。本試驗(yàn)篩選LncRNAs 最佳內(nèi)參基因，為青花菜花蕾不同部位和不同發(fā)育時(shí)期的研究提供適宜內(nèi)參基因。

近年來(lái)大量的研究表明，基因的表達(dá)并不是絕對(duì)穩(wěn)定的，任何內(nèi)參基因的穩(wěn)定性只是在一定的實(shí)驗(yàn)條件下保持相對(duì)穩(wěn)定[16]。因此，本試驗(yàn)在青花菜花蕾不同部位和不同發(fā)育時(shí)期選擇不同的基因作為內(nèi)參基因是合理的。同時(shí)由于geNorm 和NormFinder、BestKeeper 3 個(gè)分析軟件的算法不同，會(huì)導(dǎo)致3 個(gè)軟件分析結(jié)果出現(xiàn)差異。因此，本研究綜合各軟件的穩(wěn)定性排名選出在3個(gè)軟件中穩(wěn)定性均表現(xiàn)良好的基因作為內(nèi)參基因。

前人報(bào)道指出，選擇2 個(gè)或2 個(gè)以上的內(nèi)參基因可以減少單一內(nèi)參基因帶來(lái)的誤差，提高結(jié)果的準(zhǔn)確性[17-18]。本研究發(fā)現(xiàn)，在青花菜花蕾不同部位中最穩(wěn)定的內(nèi)參基因組合數(shù)為2 個(gè)，在青花菜花蕾不同發(fā)育時(shí)期最佳內(nèi)參基因數(shù)也為2個(gè)。本研究通過(guò)geNorm 配對(duì)變異值分析發(fā)現(xiàn)，在花蕾不同部位組和不同發(fā)育時(shí)期組中，內(nèi)參組合Vn/（n＋1）值均小于程序推薦值0.15。表明本研究中選擇的16 個(gè)內(nèi)參基因差異較小，此時(shí)選擇2個(gè)內(nèi)參基因來(lái)校正試驗(yàn)，可以減少單一內(nèi)參基因帶來(lái)的誤差[19-20]。