夏秋茶多糖的超聲波輔助提取工藝優(yōu)化

曹 淼，化志秀， 曹 正，宣文芳，王 林

(1.江蘇農(nóng)林職業(yè)技術(shù)學(xué)院茶與食品科技學(xué)院，江蘇句容 212400;2.江蘇省句容中等專(zhuān)業(yè)學(xué)校，江蘇句容 212400)

我國(guó)是主要茶葉生產(chǎn)國(guó)，茶園總面積和產(chǎn)量均居世界第一。據(jù)統(tǒng)計(jì)，從2014年開(kāi)始，我國(guó)茶葉消費(fèi)增長(zhǎng)始終低于產(chǎn)量增長(zhǎng)，茶葉庫(kù)存不斷增加，使我國(guó)茶葉產(chǎn)業(yè)面臨嚴(yán)重的產(chǎn)能過(guò)剩問(wèn)題[1-2]。夏秋茶是按季節(jié)劃分的一大類(lèi)茶，產(chǎn)量占茶葉總產(chǎn)量60%以上，夏秋茶苦澀味重，口感差，僅少量被采摘甚至棄之不采，資源浪費(fèi)嚴(yán)重[3]。研究表明，夏秋茶及粗老葉片中的茶多糖含量比嫩芽中高，并且茶多糖具有較強(qiáng)的抗氧化、降血糖、降血脂作用，在防治糖尿病、抗凝血、防血栓形成，保護(hù)血象和增強(qiáng)人體非特異性免疫能力等方面也具有明顯功效，尤其是降血糖的功效極顯著，是一種極具應(yīng)用和開(kāi)發(fā)前景的天然產(chǎn)物[4-7]。

目前，多糖提取常用的方法是水提法[8]和堿提法[9]。近年來(lái)，學(xué)者在提取多糖等工藝上進(jìn)行了很多改進(jìn)，如酶法[10]、超聲浸提法[11]、微波提取法[12-13]，在藥品及食品制作過(guò)程中用于提高茶多糖的提取率。其中，超聲波輔助浸提法具有提取時(shí)間較短，耗能較低，效率較高及其技術(shù)簡(jiǎn)單等特點(diǎn)被廣泛應(yīng)用。超聲波是利用其具有的3種效應(yīng)，通過(guò)細(xì)胞中介質(zhì)傳播過(guò)程中引起的溶質(zhì)分子運(yùn)動(dòng)速度加快，導(dǎo)致植物細(xì)胞壁破裂，從而釋放細(xì)胞內(nèi)容物以提取生物有效成分。筆者擬探討超聲波提取工藝參數(shù)對(duì)茶多糖得率的影響，通過(guò)響應(yīng)面法優(yōu)化夏秋茶中茶多糖的提取工藝參數(shù)，以期為拓展夏秋茶中茶多糖的利用途徑提供理論參考和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備夏秋茶，福云6號(hào)，江蘇茶博園提供；無(wú)水乙醇，上海久億化學(xué)試劑有限公司，分析純；95%乙醇，上海久億化學(xué)試劑有限公司，分析純；苯酚，南京揚(yáng)子石英力士苯酚有限公司，分析純；濃硫酸，上海久億化學(xué)試劑有限公司，分析純。

電子天平，常數(shù)市雙杰測(cè)試儀器廠，JJ200B；高低溫?fù)u床培養(yǎng)箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司，TSSQ-280；電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司，DHG-9123A；超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司，KQ3200E；隔膜真空泵，天津市津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司，GM-0.33A；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠，RE-5203；循環(huán)水式多用真空泵，鄭州市長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司，SHB-Ⅲ；架盤(pán)藥物天平，常數(shù)市雙杰測(cè)試儀器廠，JP100；高速臺(tái)式大容量離心機(jī)，無(wú)錫市瑞江分析儀器有限公司，RJ-TDL-5A；電熱恒溫水浴鍋，上海-恒科學(xué)儀器有限公司，HWS-24；紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司，T6新世紀(jì)。

1.2 方法

1.2.1提取流程。茶葉→80%乙醇浸泡24 h→除上清液→烘干→超聲波浸提→抽濾→濃縮→95%乙醇沉淀24 h→離心→收集沉淀→烘干→定容→測(cè)定多糖含量。具體步驟：稱(chēng)取1 g茶樣，加入80%乙醇搖床浸泡沉淀24 h(液料比20∶1)，除去絕大多數(shù)上清液。茶樣殘?jiān)娓? h(50 ℃)，以蒸餾水為提取液浸提預(yù)處理好的茶渣，在常溫下采用隔膜真空泵抽濾干凈，將濾液在80 ℃水浴的條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至10 mL，加入3倍95%乙醇在4 ℃條件下靜置24 h。采用高速離心機(jī)(4 000 r/min 15 min)去除上清液收集離心物，沉淀物50 ℃烘干，定容至100 mL待測(cè)。

1.2.2單因素試驗(yàn)。

1.2.2.1超聲時(shí)間。分別精準(zhǔn)稱(chēng)取1 g茶多糖樣品(精準(zhǔn)到0.001 g)，固定液料比20∶1、超聲溫度60 ℃，設(shè)定可變因素超聲波時(shí)間 10、30、50、70、90 min，選出對(duì)茶多糖得率影響較大的值。

1.2.2.2液料比。分別精準(zhǔn)稱(chēng)取1 g茶多糖樣品(精準(zhǔn)到0.001 g)，固定超聲時(shí)間70 min、超聲溫度60 ℃，設(shè)定可變因素液料比10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1，選出對(duì)茶多糖得率影響較大的值。

1.2.2.3超聲溫度。分別精準(zhǔn)稱(chēng)取1 g茶多糖樣品(精準(zhǔn)到0.001 g)，固定超聲時(shí)間70 min、液料比20∶1，設(shè)定可變因素超聲波溫度40、50、60、70、80 ℃，選出對(duì)茶多糖得率影響較大的值。

1.2.3響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)。以上述試驗(yàn)結(jié)果為基礎(chǔ)，采用Box-Behnken設(shè)計(jì)的響應(yīng)曲面法；以超聲時(shí)間、液料比、超聲溫度3個(gè)因素為響應(yīng)值，以1、0、-1為編碼設(shè)計(jì)因素水平(表1)。

表1 響應(yīng)面設(shè)計(jì)因素水平及編碼

1.2.4茶多糖測(cè)定。采用苯酚硫酸法測(cè)定多糖含量[14-15]。具體流程：將定容好的溶液精準(zhǔn)吸取2 mL于試管中，加入6%苯酚1 mL、濃硫酸5 mL，混合均勻，置于75 ℃水浴鍋中加熱10 min，放在室溫下冷卻，在波長(zhǎng)為490 nm處測(cè)定吸光光度。

茶多糖的得率計(jì)算公式：

得率=多糖質(zhì)量/茶葉質(zhì)量×100%

1.2.5統(tǒng)計(jì)分析。運(yùn)用Design-Expert 12軟件進(jìn)行響應(yīng)面分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1超聲時(shí)間對(duì)茶多糖得率的影響。從圖1可見(jiàn)，茶多糖得率隨超聲時(shí)間的延長(zhǎng)呈先平緩后升降趨勢(shì)，當(dāng)70 min時(shí)茶多糖得率最大，超過(guò)70 min 茶多糖得率則大幅降低。原因可能是時(shí)間過(guò)短，茶多糖未能全部溶解；而時(shí)間過(guò)長(zhǎng)反而使茶多糖被降解，因?yàn)槌暡ň哂休^高的剪切力，產(chǎn)生的輻射壓強(qiáng)能快速破壞茶樣的細(xì)胞壁，使細(xì)胞組織發(fā)生變形，加快細(xì)胞內(nèi)多糖溶解于溶劑中，而長(zhǎng)時(shí)間的超聲波浸提則會(huì)破壞已溶出多糖的結(jié)構(gòu)，從而導(dǎo)致茶多糖提取得率下降。綜上，選定超聲波輔助提取茶多糖時(shí)間為70 min。

圖1 超聲時(shí)間對(duì)茶多糖得率的影響Fig.1 Effect of ultrasonic time on tea polysaccharide yield

2.1.2液料比對(duì)茶多糖得率的影響。由圖2可知，茶多糖得率隨料液比的增加呈先緩慢上升后下降的趨勢(shì)，當(dāng)液料比為20∶1時(shí)茶多糖得率最大，之后下降。原因可能是液料比20∶1的情況下，茶多糖的溶出量已達(dá)到飽和，再增加溶劑會(huì)降低其的傳質(zhì)能力[16]；因超聲波浸提過(guò)程中會(huì)出現(xiàn)空化效應(yīng)[17]，其產(chǎn)生的氣泡在聲壓的作用下形成微激流，過(guò)多的溶質(zhì)同時(shí)也會(huì)阻礙茶樣細(xì)胞壁的破裂，減緩多糖的溶出，從而增加了茶多糖的損失，降低了超聲波浸提茶多糖的得率。綜上，選定超聲波輔助提取茶多糖液料比為20∶1。

圖2 液料比對(duì)茶多糖得率的影響Fig.2 Effect of liquid-to-material ratio on tea polysaccharide yield

2.1.3超聲溫度對(duì)茶多糖得率的影響。由圖3可知，茶多糖得率隨超聲溫度的升高呈不斷上升趨勢(shì)，但當(dāng)溫度超過(guò)70 ℃ 時(shí)，茶多糖得率反而下降，并且在試驗(yàn)過(guò)程中觀察到超聲溫度越高樣品顏色越深，過(guò)深顏色的樣品并不利于后續(xù)的純化[16]。分析其原因，可能是在相同時(shí)間、相同液料比條件下，超聲溫度較低難以充分提取茶多糖，超聲波提取通過(guò)介質(zhì)不斷傳播擴(kuò)散的過(guò)程導(dǎo)致茶樣細(xì)胞組織溫度升高，而較高的水浸提則加速破壞了茶多糖的糖苷鍵，并且使原本已被溶解出的有效成分出現(xiàn)氧化現(xiàn)象，故溫度在70～80 ℃時(shí)超聲波輔助提取茶多糖的得率會(huì)出現(xiàn)降解的作用。綜上，選定超聲波輔助提取茶多糖超聲溫度為70 ℃。

圖3 超聲溫度對(duì)茶多糖得率的影響Fig.3 Effect of ultrasonic temperature on polysaccharide yield

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1優(yōu)化設(shè)計(jì)及數(shù)據(jù)分析。根據(jù)BBD優(yōu)化共設(shè)計(jì)17個(gè)設(shè)計(jì)點(diǎn)，進(jìn)行3因素3水平的響應(yīng)面優(yōu)化茶多糖得率試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表2。根據(jù)表2進(jìn)行回歸模型方差分析，得到回歸方程為

Y=1.410-0.100A+0.200B+0.091C-0.160AB-0.130AC-0.089BC-0.290A2-0.096B2-0.330C2

由表3可知，該模型失擬項(xiàng)P=0.143 1>0.05，說(shuō)明該因素在試驗(yàn)中影響較小，R2=0.934 8，表示該模型的選擇較為合適；在3個(gè)因素優(yōu)化設(shè)計(jì)試驗(yàn)中，一次項(xiàng)顯著程度表現(xiàn)為B>A>C，其中B差異極顯著；交互作用中顯著程度表現(xiàn)為AB>AC>BC，其中AB差異顯著；二次項(xiàng)中顯著程度表現(xiàn)為C2>A2>B2，其中C2和A2差異極顯著。超聲波提取茶多糖得率的影響表現(xiàn)為液料比>超聲時(shí)間>超聲溫度。

表3 回歸模型方差分析

2.2.2響應(yīng)面與等高線結(jié)果分析。由回歸方程得到超聲時(shí)間(A)、液料比(B)和超聲溫度(C)對(duì)茶多糖得率的影響設(shè)計(jì)響應(yīng)面圖和高等線，結(jié)果如圖4所示。對(duì)茶多糖得率影響的顯著程度是根據(jù)響應(yīng)面的坡度與高等線圖呈現(xiàn)的形狀來(lái)區(qū)分的，響應(yīng)面坡度較為陡峭，則顯著，反之則不顯著；當(dāng)高等線圖在出現(xiàn)橢圓形并且中心點(diǎn)越靠近紅色部位，則顯著，圓形則不顯著，此時(shí)2因素相交即可忽略。由圖4可知，當(dāng)超聲溫度70 ℃時(shí)，隨著超聲時(shí)間(A)的延長(zhǎng)和液料比(B)的升高，等高線呈橢圓形，且響應(yīng)面坡度以液料比30∶1為最高點(diǎn)走向，坡度較為明顯，交互作用較顯著，尤其是當(dāng)超聲時(shí)間65 min、液料比30∶1時(shí)多糖得率較高。

圖4 液料比、超聲時(shí)間及其交互作用對(duì)茶多糖得率的響應(yīng)面和等高線Fig.4 The response surface and contour of the effect of liquid-to-material ratio，ultrasound time and its interaction on polysaccharide yield

2.2.3驗(yàn)證試驗(yàn)。通過(guò)響應(yīng)面結(jié)果分析得出最高茶多糖得率為1.578%，其中最優(yōu)條件為超聲時(shí)間80 min、液料比20∶1、超聲溫度60 ℃，為了更高效率地提取茶多糖，在響應(yīng)面分析的基礎(chǔ)上，采用Design-expert軟件進(jìn)行回歸模型方差分析及響應(yīng)面圖與等高線圖結(jié)果分析，在該條件下優(yōu)選出最優(yōu)提取條件為超聲時(shí)間65.27 min、液料比30∶1、超聲溫度70.93 ℃，得率為1.583%。由此表明，茶多糖得率的實(shí)際值與預(yù)測(cè)值接近，證實(shí)了響應(yīng)面法與回歸方程為茶多糖工藝參數(shù)優(yōu)化提供了可靠方案。

3 結(jié)論

該試驗(yàn)采用超聲波輔助提取茶多糖，通過(guò)考察單因素試驗(yàn)對(duì)茶多糖得率的影響，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行響應(yīng)面分析法、二次多元化回歸擬合分析、響應(yīng)面圖與等高線圖分析對(duì)茶多糖提取工藝條件優(yōu)化。結(jié)果表明，各因素對(duì)茶多糖得率的影響表現(xiàn)為液料比>超聲時(shí)間>超聲溫度，其中超聲時(shí)間與液料比交互作用對(duì)茶多糖提取得率的影響顯著，優(yōu)選出的最優(yōu)工藝參數(shù)為超聲時(shí)間65.27 min，液料比30∶1，超聲溫度70.93 ℃，在該條件下茶多糖得率為1.583%。經(jīng)驗(yàn)證，該數(shù)學(xué)模型可靠，可用于茶多糖提取工藝參數(shù)的預(yù)測(cè)。