馬里苷對db/db小鼠腎臟組織內(nèi)皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化和纖維化的改善作用及機(jī)制

張芳，郭瓊，田亞婷，張博翔，李甜

1 新疆醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，烏魯木齊 830011；2 新疆醫(yī)科大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院

糖尿病腎?。―N）是導(dǎo)致終末期腎病的主要原因，腎臟纖維化是糖尿病腎病的普遍病理特征，主要表現(xiàn)為細(xì)胞外基質(zhì)的堆積［1］。研究證明，內(nèi)皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EndMT）或上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）能夠促進(jìn)器官纖維化發(fā)生發(fā)展，其特征為內(nèi)皮標(biāo)志物（CD31）的表達(dá)下降和間充質(zhì)標(biāo)志物［纖維連接蛋白（Fibronectin）、波形蛋白（Vimentin）］的表達(dá)上升［2］。馬里苷是一種黃酮類化合物，提取于功效獨(dú)特的稀有高寒、野生植物兩色金雞菊，能夠降血糖、調(diào)血脂，有抑制糖異生、改善糖尿病腎臟纖維化等功效，對延緩糖尿病腎病進(jìn)程有潛在的價值［3-4］。然而馬里苷對糖尿病腎臟纖維化和EndMT 作用相關(guān)的分子機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。成纖維細(xì)胞生長因子受體Ⅰ（FGFR1）屬于受體酪氨酸激酶，其與配體成纖維細(xì)胞生長因子（FGF）結(jié)合后發(fā)揮生物學(xué)作用［5］。研究表明，F(xiàn)GFR1 可調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)化生長因子β（TGF-β），在器官纖維化過程中發(fā)揮重要作用［6］。馬里苷與FGFR1 有較強(qiáng)的相互作用，推測FGFR1 與馬里苷改善糖尿病腎臟纖維化有關(guān)［7］。2022 年，本研究以糖尿病瘦素受體基因缺陷小鼠（db/db 小鼠）為研究對象，探究馬里苷對糖尿病db/db小鼠腎臟EndMT 和纖維化的改善作用及機(jī)制，為馬里苷相關(guān)藥物的研究與開發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物、試劑及儀器

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 選取6 周齡野生型瘦素受體基因缺陷雜合（db/m）正常雄性小鼠10只，體質(zhì)量（16 ± 2）g；6 周齡自發(fā)性糖尿病db/db 雄性小鼠30 只，體質(zhì)量（28 ± 2）g。小鼠均由江蘇常州卡文思實(shí)驗(yàn)動物有限公司提供，生產(chǎn)許可號：SCXK（蘇）2016-0010。小鼠飼養(yǎng)于新疆醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心SPF級動物飼養(yǎng)室，單籠、單只飼養(yǎng)，自由飲水，每隔2 d 更換墊料。SPF動物飼養(yǎng)室模擬自然晝夜條件，日間相對溫度（20 ± 2）℃，相對濕度（45 ± 5）%，每日日照時間為12 h，24 h 保持通風(fēng)狀態(tài)。飼養(yǎng)小鼠所使用的鼠籠、飼料、飲用水以及墊料均經(jīng)過高溫高壓滅菌處理，按照國際動物保護(hù)相關(guān)指南和規(guī)定進(jìn)行動物實(shí)驗(yàn)。

1.1.2 藥物、主要試劑及儀器 馬里苷購自法國Extrasynthese 公司；二甲雙胍購自美國MCE 公司；Fibronectin、CD31 和FGFR1 基因引物序列由上海生工生物工程股份有限公司合成；兔抗Fibronectin、Vimentin抗體購自abcam貿(mào)易有限公司；兔抗CD31、GAPDH 抗體購自美國Affinity 公司；兔抗FGFR1 購自美國CST 公司；兔抗TGF-β、二抗IgG H&L/HRP購自博奧森生物技術(shù)有限公司；RNA 提取、逆轉(zhuǎn)錄和熒光定量PCR 試劑盒購自福際生物技術(shù)有限公司；垂直電泳槽購自美國Bio-Rad 公司；Applied BiosystemsTMQuantStudioTM6 and 7 Flex 實(shí)時定量PCR 儀購自美國Thermo Fisher Scientific 公司；拍照顯微鏡購自德國Leica公司。

1.2 動物分組及藥物干預(yù) 取10 只db/m 小鼠作為正常對照組，按隨機(jī)數(shù)字表法將30 只db/db 小鼠分為糖尿病模型組10 只、二甲雙胍組10 只、馬里苷組10 只。二甲雙胍組給予二甲雙胍280 mg/kg 灌胃、馬里苷組給予50 mg/kg 馬里苷組灌胃，正常對照組、糖尿病模型組均給予0.5%羧甲基纖維素鈉0.2 mL/10 g灌胃，每日1次，共持續(xù)8周。各組均喂養(yǎng)轉(zhuǎn)基因敲除小鼠飼料、基礎(chǔ)飼料，正常飲水。

1.3 空腹血糖水平檢測 第8 周末次給藥后24 h，固定小鼠，用乙醇棉球消毒鼠巴后剪去一截，待鼠尾形成足夠大的血珠時用血糖試紙吸取血珠，將血糖試紙插入羅氏血糖測量儀，記錄空腹血糖。

1.4 腎組織中EndMT 標(biāo)志物（Fibronectin、Vimentin、CD31）、纖維化指標(biāo)（TGF-β）、FGFR1 蛋白表達(dá)檢測 采用Western blotting 法。檢測空腹血糖后麻醉小鼠，用斷脊法將其處死后解剖，摘取雙側(cè)腎臟，用生理鹽水清洗，并用濾紙將組織表面水分吸干。摘除腎臟表層包膜，沿縱向?qū)⒛I臟組織均分，分別放于1.5 mL凍存管和4%多聚甲醛中固定。取出凍存于-80 ℃的小鼠腎臟組織，在研磨管內(nèi)加入裂解液，用組織研磨儀進(jìn)行研磨，每組研磨4～5次，每次40 s。研磨完成后將組織放置于冰上充分裂解30 min。隨后將裂解產(chǎn)物離心12 000 r/min離心20 min（離心半徑72 mm），吸取上清液，測定蛋白濃度。測定后每4體積蛋白上清液加入1體積4×loading buffer（含β-巰基乙醇，1%），100 ℃沸水水浴10 min。蛋白變性后，加樣進(jìn)行SDS-PAGE 凝膠電泳，轉(zhuǎn)PVDF 膜。將PVDF 膜置于5%脫脂奶粉封閉，抗體孵育4 ℃過夜（1∶1 000的兔抗Fibronectin、Vimentin、CD31、TGF-β、FGFR1、GAPDH）。第2天TBST洗膜，隨后加入酶標(biāo)二抗（1∶5 000 的HRP 標(biāo)記的山羊抗兔IgG）室溫避光孵育50 min，TBST 洗膜后進(jìn)行ECL 顯色反應(yīng)，曝光、顯影圖片存檔，采用Image J 軟件處理分析目的條帶的灰度值。目的蛋白相對表達(dá)量=目的蛋白灰度值/內(nèi)參蛋白灰度值。

1.5 腎組織中Fibronectin、CD31、FGFR1 mRNA 表達(dá)檢測 采用RT-PCR 法。剪取腎組織樣品置于研磨管內(nèi)，研磨充分后進(jìn)行振蕩和離心，1 2 000 r/min離心20 min（離心半徑72 mm），把離心后的水相層轉(zhuǎn)移到新的離心管，根據(jù)試劑盒操作說明書，進(jìn)行動物組織RNA 提取。測定RNA 濃度、純度。將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，行RT-PCR。反應(yīng)體系：SYBR GreenⅠ標(biāo)記底物混合液10 μL、cDNA 模板0.4 μL、上下游引物各0.8 μL、無酶水8 μL、ROX 0.4 μL，總體積20.4 μL。反應(yīng)條件：預(yù)變性95 ℃ 5 min，循環(huán)中模板變性95 ℃ 10 s、退火55 ℃ 10 s、延伸72 ℃ 20 s共45 個循環(huán)。用2-△△Ct法計(jì)算目的基因相對表達(dá)量。Fibronectin 上游引物5'-CTATAGGATTGGAGACACGTGG-3'，下 游 引 物5'-CTGAAGCACTTTGTAGAGCATG-3'；CD31 上游引物5'-CACAACAAACAAGCTAGCAAGA-3'，下 游 引 物5'-TTTGGCTGCAACTATTAAGGTG-3'；FGFR1 上游引物5'-AATGGATTCTGTGGTGCCTTCTGAC-3'，下游引物5'-GCTGGTAGGTGTGGTTGATGCTC-3'；GAPDH 上游 引 物5'-ACATCAAGAAGGTGGTGAAGC-3'，下 游 引 物5'-AAGGTGGAAGAGTGGGAGTTG-3'。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS26.0 統(tǒng)計(jì)軟件。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用獨(dú)立樣本LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組空腹血糖水平比較 第8 周正常對照組、糖尿病模型組、二甲雙胍組、馬里苷組空腹血糖水平分 別為（6.38 ± 0.68）、（30.10 ± 2.49）、（26.12 ± 3.26）、（26.90 ± 1.58）mmol/L。與正常對照組比較，糖尿病模型組空腹血糖水平高（P＜0.05）；與糖尿病模型組比較，二甲雙胍組、馬里苷組空腹血糖水平低（P均＜0.05）；二甲雙胍組空腹血糖水平與馬里苷組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.2 各組腎組織中Fibronectin、Vimentin、CD31、TGF-β、FGFR1蛋白表達(dá)比較 見表1。

表1 各組腎組織中Fibronectin、Vimentin、CD31、TGF-β、FGFR1蛋白表達(dá)比較（±s）

表1 各組腎組織中Fibronectin、Vimentin、CD31、TGF-β、FGFR1蛋白表達(dá)比較（±s）

注：與正常對照組比較，*P＜0.05；與糖尿病模型組比較，#P＜0.05；與二甲雙胍組比較，&P＜0.05。

組別正常對照組糖尿病模型組二甲雙胍組馬里苷組n 6 6 6 6 Fibronectin蛋白1.00 ± 0.09 1.42 ± 0.14*0.97 ± 0.21#1.06 ± 0.16#Vimentin蛋白1.00 ± 0.12 2.08 ± 0.13*1.51 ± 0.26#1.19 ± 0.16#&CD31蛋白1.00 ± 0.06 0.79 ± 0.07*1.00 ± 0.18#0.94 ± 0.11#TGF-β蛋白1.00 ± 0.07 1.19 ± 0.12*0.96 ± 0.17#0.95 ± 0.15#FGFR1蛋白1.00 ± 0.08 2.34 ± 0.22*2.03 ± 0.38#1.69 ± 0.22#&

2.3 各組腎組織中Fibronectin、CD31、FGFR1 mRNA表達(dá)比較 見表2。

表2 各組腎組織中Fibronectin、CD31、FGFR1 mRNA表達(dá)比較（±s）

表2 各組腎組織中Fibronectin、CD31、FGFR1 mRNA表達(dá)比較（±s）

注：與正常對照組比較，*P＜0.05；與糖尿病模型組比較，#P＜0.05；與二甲雙胍組比較，&P＜0.05。

組別正常對照組糖尿病模型組二甲雙胍組馬里苷組n 6 6 6 6 Fibronectin mRNA 1 2.62 ± 0.23*2.08 ± 0.10#1.74 ± 0.11#&CD31 mRNA 1 0.65 ± 0.03*0.84 ± 0.12#0.75 ± 0.01#&FGFR1 mRNA 1 1.92 ± 0.17*1.21 ± 0.06#1.32 ± 0.15#

3 討論

糖尿病并發(fā)癥嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量和預(yù)期壽命，給患者及社會帶來了極大的醫(yī)療和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)［8］。器官纖維化的防治一直是糖尿病研究領(lǐng)域的重要課題。腎臟纖維化常見于糖尿病晚期，表現(xiàn)為腎組織中細(xì)胞外基質(zhì)的過度沉積，最終導(dǎo)致腎臟功能衰竭［9］。糖尿病的高血糖、高血脂和胰島素抵抗可通過觸發(fā)上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞向成纖維細(xì)胞樣表型轉(zhuǎn)化，或者直接刺激成纖維細(xì)胞合成基質(zhì)［10］，激活纖維化反應(yīng)，但其中涉及的分子、基因及具體機(jī)制目前尚不清楚。目前主要集中于高糖環(huán)境刺激，造成活性氧的產(chǎn)生和生長因子的級聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)促炎因子和趨化因子聚集，產(chǎn)生糖基化終產(chǎn)物，最終上調(diào)纖維生成和基質(zhì)細(xì)胞蛋白的表達(dá)［11］。馬里苷是一種黃酮類化合物，能夠抑制糖異生和改善胰島素抵抗，調(diào)節(jié)機(jī)體血糖血脂紊亂，對改善和延緩糖尿病腎病進(jìn)程有著潛在的應(yīng)用價值［12］。已有研究表明，馬里苷可有效保護(hù)糖尿病腎臟功能障礙以及腎小管和腎小球病變，但其對糖尿病腎臟纖維化的保護(hù)作用及相關(guān)分子機(jī)制還有待進(jìn)一步研究［13］。 FGFR1 屬于酪氨酸激酶家族受體，在血管生成、受傷組織修復(fù)以及能量代謝調(diào)節(jié)等方面扮演著十分重要的角色［14］。FGF 配體通過與細(xì)胞表面的FGFR 酪氨酸激酶發(fā)出信號，這些酪氨酸激酶在哺乳動物中由四種不同的基因編碼。配體結(jié)合后誘導(dǎo)FGFR 二聚化，使細(xì)胞內(nèi)受體激酶結(jié)構(gòu)域相互接近和準(zhǔn)確配位，從而使其發(fā)生磷酸化激活激酶。激活的受體激酶依次磷酸化和激活細(xì)胞內(nèi)底物，主要是FGFR 底物2α（FRS2α）和磷脂酶Cγ1 （PLCγ1）。激活的FRS2α 通過RASMAPK 通路或PI3K-AKT 通路啟動下游信號通路，從而發(fā)揮調(diào)節(jié)作用［15］。目前FGFR1 在癌癥中的作用研究較多，EMT 或EndMT 是幫助癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的重要途徑。在小鼠前列腺中過表達(dá)FGFR1 可誘導(dǎo)前列腺上皮內(nèi)瘤變，并且在該模型中，前列腺上皮內(nèi)瘤變在1年內(nèi)發(fā)展為移行性肉瘤樣癌，提示發(fā)生了EMT。在化學(xué)誘導(dǎo)激活FGFR1 乳腺癌模型中，成年小鼠乳腺上皮中FGFR1 的激活誘導(dǎo)了MAPK 和AKT 依賴的癌細(xì)胞擴(kuò)增，并最終導(dǎo)致浸潤性乳腺病變，同樣說明FGFR1 激活了EMT 促進(jìn)癌細(xì)胞的侵襲、擴(kuò)增［16］。此外在糖尿病背景下FGFR1 的作用也有較多研究［17-18］。在研究二甲雙胍對糖尿病大鼠FGFR1表達(dá)的影響實(shí)驗(yàn)中，提示通過影響FGFR1作用于AKT 通路可改善高糖誘導(dǎo)的胰腺及脂肪組織的功能損傷［19］。研究表明，腎臟FGF23 和FGF2 從內(nèi)皮細(xì)胞、足細(xì)胞、系膜細(xì)胞、間充質(zhì)細(xì)胞和成纖維細(xì)胞中分泌，與腎臟FGFR1 受體結(jié)合，可促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞和管狀上皮細(xì)胞向間充質(zhì)轉(zhuǎn)化，從而加速腎組織間質(zhì)累積和纖維化病變［20］。以上說明FGFR1 在糖尿病腎臟間質(zhì)轉(zhuǎn)化和纖維化病變中有關(guān)鍵作用，進(jìn)一步探究其分子作用機(jī)制以及藥物是否通過影響FGFR1改善糖尿病腎臟間質(zhì)轉(zhuǎn)化和纖維化有一定的研究價值。

本研究以糖尿病模型db/db 小鼠為研究對象，以二甲雙胍為陽性對照。由各組第8 周空腹血糖檢測結(jié)果看出，馬里苷可有效降低db/db 小鼠的空腹血糖水平，對糖代謝紊亂有改善作用。在蛋白和基因水平，與正常對照組相比，糖尿病模型db/db 小鼠腎臟間質(zhì)表型指標(biāo)Fibronectin、Vimentin和纖維化指標(biāo)TGF-β表達(dá)明顯升高，內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物CD31表達(dá)明顯下降，說明糖尿病模型組小鼠腎臟發(fā)生了End-MT 和纖維化，二甲雙胍和馬里苷可明顯降低db/db小 鼠Fibronectin、Vimentin、TGF-β 的 表 達(dá)，上 調(diào)CD31表達(dá)，說明馬里苷對db/db小鼠腎臟EndMT 和纖維化有一定的保護(hù)作用。此外，糖尿病db/db 小鼠腎組織FGFR1 分子表達(dá)上調(diào)，二甲雙胍和馬里苷給藥后可降低FGFR1 的表達(dá)，說明馬里苷可能通過降低FGFR1 的表達(dá)改善糖尿病腎臟EndMT 和纖維化。

綜上所述，馬里苷可改善糖尿病db/db 小鼠的腎臟EndMT 和纖維化，下調(diào)腎組織中FGFR1 表達(dá)。馬里苷可能通過下調(diào)FGFR1發(fā)揮對糖尿病db/db小鼠的腎臟EndMT 和纖維化的治療作用，但其中的通路還有待進(jìn)一步研究。