小麥條銹菌效應(yīng)蛋白Hasp83在條銹菌致病性中的功能分析

王建鋒，成嘉欣，舒?zhèn)W(xué)，張艷茹，王曉杰，康振生，湯春蕾

小麥條銹菌效應(yīng)蛋白Hasp83在條銹菌致病性中的功能分析

王建鋒，成嘉欣，舒?zhèn)W(xué)，張艷茹，王曉杰，康振生，湯春蕾

西北農(nóng)林科技大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院/旱區(qū)作物逆境生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西楊凌 712100

【背景】條銹病是小麥上的重大病害，由條形柄銹菌小麥?；停╢. sp.，）侵染引起。條銹菌是活體營養(yǎng)型寄生真菌，在侵染過程中形成吸器，通過吸器從寄主植物汲取營養(yǎng)。同時(shí)，吸器分泌效應(yīng)蛋白調(diào)控寄主免疫，促進(jìn)侵染過程。【目的】明確條銹菌效應(yīng)蛋白的功能及其作用機(jī)理，為揭示條銹菌的致病機(jī)制打下基礎(chǔ)?！痉椒ā勘容^分析條銹菌夏孢子、芽管和吸器轉(zhuǎn)錄組，獲得在吸器誘導(dǎo)表達(dá)的分泌蛋白基因，在本氏煙葉片細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)觀察是否能抑制由BAX引起的細(xì)胞壞死；利用qRT-PCR分析該基因在條銹菌侵染小麥不同階段的表達(dá)水平。借助熒光假單胞菌Ⅲ型分泌系統(tǒng)和寄主誘導(dǎo)的基因沉默（host-induced gene silencing，HIGS）分析在條銹菌侵染過程中的功能。利用酵母雙雜交系統(tǒng)篩選小麥中與Hasp83互作的蛋白，免疫共沉淀技術(shù)進(jìn)一步在煙草細(xì)胞中共表達(dá)驗(yàn)證Hasp83及其候選靶標(biāo)蛋白的互作?！窘Y(jié)果】開放閱讀框全長522 bp，編碼173個(gè)氨基酸，蛋白N端1—29位氨基酸為信號肽，無保守結(jié)構(gòu)域，在本氏煙葉片細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)能抑制由BAX引起的細(xì)胞壞死。qRT-PCR分析顯示，在條銹菌侵染時(shí)期上調(diào)表達(dá)；利用細(xì)菌Ⅲ型分泌系統(tǒng)在小麥水源11品種中瞬時(shí)表達(dá)Hasp83能夠抑制熒光假單胞菌引起的胼胝質(zhì)積累，在接種條銹菌無毒性小種CYR23后，瞬時(shí)表達(dá)Hasp83株系產(chǎn)生的活性氧積累面積和過敏性壞死面積相比對照減少19.35%—38.62%；利用HIGS技術(shù)在接種條銹菌毒性小種CYR31的小麥水源11中沉默，發(fā)現(xiàn)條銹菌的產(chǎn)孢量、菌絲長度、菌絲擴(kuò)展面積和吸器數(shù)目減少，致病力降低。酵母雙雜交結(jié)果表明，效應(yīng)蛋白Hasp83與其小麥中候選靶標(biāo)過敏性壞死誘導(dǎo)蛋白Tahir1互作。免疫共沉淀進(jìn)一步證明Hasp83及其候選靶標(biāo)Tahir1存在互作?！窘Y(jié)論】條銹菌效應(yīng)蛋白Hasp83可抑制寄主由非致病細(xì)菌和無毒性條銹菌生理小種引起的小麥防衛(wèi)反應(yīng)，增強(qiáng)病原菌的致病力。

小麥條銹??；吸器；效應(yīng)蛋白；轉(zhuǎn)錄組分析；靶標(biāo)蛋白鑒定

0 引言

【研究意義】由條形柄銹菌小麥專化型（f. sp.，）引起的小麥條銹病嚴(yán)重危害我國小麥的安全生產(chǎn)，病害嚴(yán)重流行年份可導(dǎo)致小麥減產(chǎn)10%—30%，甚至絕收[1]。小麥條銹病在全球小麥種植區(qū)均有發(fā)生，我國是發(fā)生面積最大、造成經(jīng)濟(jì)損失最重的國家[2-4]。種植抗病小麥品種是防控小麥條銹病的主要策略[5]。然而由于小麥條銹菌的毒性變異頻繁，高溫適應(yīng)性增強(qiáng)，病原菌新小種不斷產(chǎn)生[6]，導(dǎo)致絕大多數(shù)生產(chǎn)品種抗銹性喪失，致使小麥條銹病在我國連年流行成災(zāi)[7]。目前，對小麥條銹菌侵染致病的機(jī)理認(rèn)識不夠，缺乏有效的防控措施。因此，挖掘病菌關(guān)鍵的致病因子，解析其調(diào)控寄主促進(jìn)病菌致病的作用機(jī)理，開發(fā)病害防控新策略，對持續(xù)有效防控小麥條銹病具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】植物在與病原菌的長期進(jìn)化過程中，形成了復(fù)雜的免疫系統(tǒng)，包括細(xì)胞膜上的模式識別受體（pattern recognition receptor，PRR）識別病原菌相關(guān)分子模式（pathogen associated molecular pattern，PAMP）激發(fā)的PTI（PAMP-triggered immunity），及植物抗病蛋白（resistance protein，R）識別病菌無毒基因編碼產(chǎn)物（avirulence protein，Avr）激發(fā)的ETI（effector-triggered immunity）[8-9]。為克服植物的免疫反應(yīng)，病原菌分泌效應(yīng)蛋白抑制寄主的PTI和ETI，促進(jìn)侵染與定殖[10]。小麥條銹菌為活體營養(yǎng)型寄生真菌，在侵染小麥的過程中，會產(chǎn)生吸器這一高度分化的侵染結(jié)構(gòu)，從寄主細(xì)胞源源不斷地汲取營養(yǎng)物質(zhì)維持自身生長發(fā)育與繁殖[11]。另外，條銹菌通過吸器向寄主細(xì)胞中分泌大量的效應(yīng)蛋白（effector），調(diào)控寄主的免疫反應(yīng)，促進(jìn)條銹菌的侵染與定殖[12-14]。通過小麥條銹菌全基因組測序與吸器轉(zhuǎn)錄組測序，分析獲得了大量候選效應(yīng)蛋白[15-16]。目前已鑒定到一些條銹菌效應(yīng)蛋白，發(fā)現(xiàn)它們靶定寄主細(xì)胞不同區(qū)室，通過多元化策略調(diào)控寄主免疫。Pst_13661編碼多糖去乙?；?，分泌到植物細(xì)胞間質(zhì)，對病菌細(xì)胞壁的幾丁質(zhì)脫乙?；?，避免寄主幾丁質(zhì)酶識別，降低寄主對幾丁質(zhì)應(yīng)答產(chǎn)生的免疫反應(yīng)，從而幫助病菌致病[17]。Pst_12806定位到寄主植物葉綠體，抑制細(xì)胞色素b6/f復(fù)合體鐵硫亞基TaISP的功能，削弱葉綠體介導(dǎo)的防衛(wèi)反應(yīng)，促進(jìn)病菌定殖[18]。細(xì)胞質(zhì)效應(yīng)蛋白Pst_4/5則通過劫持并阻止光合電子傳遞鏈關(guān)鍵蛋白TaISP進(jìn)入葉綠體，干擾葉綠體免疫[19]。Pst_A23位于植物細(xì)胞核斑點(diǎn)，結(jié)合小麥pre-mRNA調(diào)控寄主可變剪接抑制免疫[20]。胞質(zhì)效應(yīng)蛋白Hasp98通過抑制寄主免疫途徑關(guān)鍵組分TaMAPK4的激酶活性，調(diào)控寄主免疫[21]。PsSpg1與Pst27791分別通過靶向小麥感病基因增強(qiáng)其激酶活性，磷酸化下游轉(zhuǎn)錄因子，進(jìn)而改變其轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性，抑制防御相關(guān)基因表達(dá)，促進(jìn)小麥感病[22-23]。在解析條銹菌效應(yīng)蛋白作用機(jī)理的基礎(chǔ)上，利用RNAi技術(shù)操縱效應(yīng)蛋白基因表達(dá)，過表達(dá)或編輯其小麥靶標(biāo)基因，創(chuàng)制了小麥抗病新材料，顯著提高了小麥抗銹性?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】效應(yīng)蛋白具有抑制植物免疫系統(tǒng)的功能，但條銹菌大部分效應(yīng)蛋白的基本功能以及分子機(jī)制依然不清楚，因此解析效應(yīng)蛋白調(diào)控植物免疫分子機(jī)制，可為進(jìn)一步了解條銹菌的致病機(jī)制并開發(fā)防控新途徑提供依據(jù)?！緮M解決的關(guān)鍵問題】明確候選效應(yīng)蛋白Hasp83調(diào)控條銹菌的毒性功能，篩選鑒定其在寄主小麥的互作蛋白，為揭示效應(yīng)蛋白Hasp83的致病機(jī)理及深入研究條銹菌-小麥互作機(jī)制打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2016—2020年在西北農(nóng)林科技大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院植物免疫實(shí)驗(yàn)室完成。

1.1 材料

1.1.1 菌株、質(zhì)粒與植物材料 大腸桿菌菌株DH5和JM109、酵母菌菌株AH109由本實(shí)驗(yàn)室提供；熒光假單胞菌菌株Ethan，由美國華盛頓州立大學(xué)Scot Hulbert教授饋贈；農(nóng)桿菌菌株GV3101（含P19），購自上海唯地生物技術(shù)有限公司；馬鈴薯X病毒（PVX）病毒載體pGR106，用于農(nóng)桿菌侵染本氏煙，由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)竇道龍教授饋贈；pEDV6載體，用于細(xì)菌Ⅲ型分泌系統(tǒng)（type Ⅲ secretion system，T3SS）在小麥中瞬時(shí)表達(dá)，由美國華盛頓州立大學(xué)Scot Hulbert教授饋贈；大麥條紋花葉病毒（BSMV）、、鏈的載體，用于寄主誘導(dǎo)的基因沉默（host-induced gene silencing，HIGS）試驗(yàn)，由本實(shí)驗(yàn)室保存；pGBKT7載體和pGADT7載體，用于酵母雙雜交（yeast two-hybrid，Y2H）篩選系統(tǒng)，由本實(shí)驗(yàn)室提供；pBinGFP2和pICH86988載體，用于免疫共沉淀（co-immunoprecipitation，Co-IP）試驗(yàn)中效應(yīng)蛋白和候選靶標(biāo)在煙草中表達(dá)，由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)王源超教授饋贈。

小麥品種水源11（攜帶抗病基因）和銘賢169（不攜帶任何抗病基因）由本實(shí)驗(yàn)室保存。將水源11和銘賢169的種子均勻播種在直徑9 cm塑料花盆中，16℃光照16 h，13℃黑暗8 h培養(yǎng)，相對濕度70%，待幼苗第二葉片展開備用。水源11用于小麥條銹菌小種CYR31的繁殖、表達(dá)譜分析、T3SS效應(yīng)蛋白的瞬時(shí)表達(dá)和HIGS試驗(yàn)，銘賢169用于小麥條銹菌小種CYR23的繁殖。

供試煙草為本氏煙（），由本實(shí)驗(yàn)室保存。將培育好的煙草幼苗移栽至直徑9 cm塑料花盆中，25℃光照16 h，黑暗8 h培養(yǎng)，相對濕度75%，待其培養(yǎng)至4葉期備用。

供試小麥條銹菌生理小種CYR23和CYR31在本實(shí)驗(yàn)室低溫窯洞進(jìn)行繁殖。其中，水源11接種生理小種CYR31表現(xiàn)為完全產(chǎn)孢的感病反應(yīng)，接種CYR23誘發(fā)過敏性壞死的抗病反應(yīng)；生理小種CYR23和CYR31在銘賢169上均完全產(chǎn)孢。

1.1.2 試劑和引物 T4 DNA連接酶、T-simple vector（Takara，北京寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司）；各種限制性內(nèi)切酶、Taq Polymorase、Pfu DNA Polymerase、RevertAid Master Mix with DNase I（Thermo Fisher，賽默飛世爾科技有限公司）；2×Taq MasterMix（含染料）、DL2000 Marker（康為世紀(jì)公司）；質(zhì)粒小提試劑盒（Omega，北京諾博萊德科技有限公司）；瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒（BioTeke，北京百泰克生物技術(shù)有限公司）；快速通用RNA提取試劑盒（北京華越洋生物科技有限公司）；RiboMAXTMLarge Scale RNA Production System-T7試劑盒（Promega公司）；胰蛋白胨、酵母提取物（OXOID，北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司）；Amp、Kana、利福平等抗生素、DMSO、葡萄糖（MP，北京伊諾凱科技有限公司）；真菌DNA提取試劑盒（BIOMIGA公司）；DAB、WGA、苯胺藍(lán)、蛋白胨、YNB（BD公司）；酵母生長所需各種氨基酸（Clontech公司）；PEG3350（Spectrum，上海斯百全化學(xué)有限公司）；LiAc（Sigma，默克科技公司）；NP-40裂解液（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；GFP-Trap瓊脂糖凝膠珠（Chromo Tek公司）。引物和測序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。本研究所用引物及其序列見表1。

1.2 Hasp83生物信息學(xué)分析

運(yùn)用SignalP 5.0在線軟件（https://services.healthtech. dtu.dk/service.php?SignalP-5.0）預(yù)測Hasp83的信號肽；利用SMART在線軟件（http://smart.embl-heidelberg. de/smart/set_mode.cgi?NORMAL=1）分析Hasp83保守結(jié)構(gòu)域；利用Ensembl Fungi（http://www.fungi.ensembl. org/）網(wǎng)站查找Hasp83的特異沉默片段。

1.3 Hasp83的獲取與重組載體構(gòu)建

在小麥條銹菌吸器轉(zhuǎn)錄組中獲得的ORF序列[16]。利用Primer Premier 5設(shè)計(jì)特異引物，以CYR31侵染水源11小麥葉片的cDNA為模板擴(kuò)增得到目的基因。采用一步克隆法將擴(kuò)增得到的去信號肽基因序列連接到Ⅰ和Ⅰ酶切的pGR106載體，獲得重組載體pGR106-Hasp83Δsp。

表1 本研究所用引物序列

擴(kuò)增編碼去信號肽基因序列，利用BP酶（Gateway? BP Clonase?，Invitrogen）構(gòu)建到含有attP位點(diǎn)的pDONRTM221中間載體，陽性質(zhì)粒pDONRTM221- Hasp83Δsp通過LR酶（GatewayTMLR ClonaseTM，Invitrogen）反應(yīng)獲得重組載體pEDV6-Hasp83Δsp。

設(shè)計(jì)的特異沉默片段和，用特異引物擴(kuò)增沉默片段，利用T4 DNA連接酶連接到Ⅰ和Ⅰ酶切的BSMV::（BSMV::00）載體，獲得BSMV::和BSMV::重組載體。

擴(kuò)增編碼去信號肽基因序列，連接到RⅠ和HⅠ酶切的pGBKT7載體，獲得重組載體pGBKT7-Hasp83Δsp。將去信號肽基因序列構(gòu)建到Ⅰ和HⅠ雙酶切的pBinGFP2載體，獲得重組載體pBinGFP2-Hasp83Δsp；此外，采用擴(kuò)增含HA標(biāo)簽的候選靶標(biāo)基因序列，利用一步克隆法連接到Ⅰ單酶切的pICH86988載體，構(gòu)建重組載體pICH86988-Tahir1-HA。

1.4 接種與qRT-PCR檢測分析

小麥水源11和銘賢169生長至一葉一心期時(shí)，脫去葉片表面蠟質(zhì)，將條銹菌CYR31和CYR23夏孢子分別用ddH2O稀釋制成孢子懸液，毛筆蘸取孢子懸液均勻接種于葉片正面，水源11接種條銹菌小種CYR31，銘賢169接種條銹菌小種CYR23，黑暗保濕24 h后轉(zhuǎn)移至16℃溫室進(jìn)行培養(yǎng)，14 d后即可收集新鮮夏孢子。

采集小麥條銹菌夏孢子、萌發(fā)芽管和接種條銹菌CYR31后24、48、72、120和168 h的小麥水源11葉片，用華越洋公司快速通用RNA提取試劑盒提取RNA，使用RevertAid Master Mix with DNase I試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。采用Primer Premier 5設(shè)計(jì)效應(yīng)蛋白基因特異引物，利用qRT-PCR技術(shù)分析其在小麥侵染不同階段的表達(dá)情況。以小麥條銹菌為內(nèi)參，采用2-??Ct法[24]計(jì)算基因的相對表達(dá)量，進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)。

1.5 農(nóng)桿菌侵染本氏煙瞬時(shí)表達(dá)Hasp83

將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒pGR106-Hasp83Δsp通過電擊轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入GV3101感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽性菌落在含有卡那霉素（50 μg·mL-1）和利福平（50 μg·mL-1）的LB培養(yǎng)基中28℃培養(yǎng)36 h。5 000 r/min離心10 min，收集菌體，10 mmol·L-1MgCl2清洗兩次，乙酰丁香酮（As）緩沖液（1 mL 1 mol·L-1KOH-MES、100 μL 150 mmol·L-1As、1 mL 1 mol·L-1MgCl2定容至100 mL）懸浮菌體，稀釋至OD600=0.3，黑暗靜置2 h后注射煙草葉片背面。24 h后，在同一位置注射攜帶pGR106-Bax的農(nóng)桿菌菌液，4 d后觀察表型并拍照。本試驗(yàn)陽性和陰性對照分別為含重組載體pGR106-Avr1b和pGR106-eGFP的農(nóng)桿菌菌液，進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)。

1.6 細(xì)菌Ⅲ型分泌系統(tǒng)在小麥水源11上瞬時(shí)表達(dá)Hasp83

將構(gòu)建好的pEDV6-Hasp83Δsp載體通過電擊轉(zhuǎn)化法導(dǎo)入熒光假單胞菌EtHan感受態(tài)細(xì)胞中，挑取陽性菌落在含有氯霉素（30 μg·mL-1）和慶大霉素（25 μg·mL-1）的LB培養(yǎng)基中28℃培養(yǎng)48 h。4 500 r/min離心1 min收集菌體，用10 mmol·L-1MgCl2清洗3次后重懸菌體至OD600=1.0，注射二葉期小麥水源11第2葉，24 h后采集注射葉段，經(jīng)冰醋酸﹕無水乙醇=1﹕1脫色、水合氯醛固定后，用0.05%苯胺藍(lán)染液過夜避光處理。染色樣本于熒光顯微鏡UV Light通道下觀察胼胝質(zhì)，每個(gè)樣品隨機(jī)選取50個(gè)1 mm2的視野統(tǒng)計(jì)胼胝質(zhì)數(shù)量，進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)。以攜帶有pEDV6-dsReD的EtHan懸浮液注射葉片為陰性對照，細(xì)菌無毒效應(yīng)基因在小麥葉片瞬時(shí)表達(dá)激發(fā)免疫反應(yīng)，監(jiān)測試驗(yàn)系統(tǒng)是否成功。含有pEDV6-Hasp83Δsp的EtHan菌液注射小麥葉片24 h后，接種條銹菌無毒生理小種CYR23，采集接菌后24和48 h的樣品，分別進(jìn)行3, 3’-二氨基聯(lián)苯（3, 3’-diaminobenzidine，DAB）和小麥胚凝集素（wheat germ agglutinin，WGA）染色，接菌后120 h采集葉片，用于生物量檢測。

DAB染色：采集對應(yīng)時(shí)間點(diǎn)葉片，在200 μL DAB（1 mg·mL-1）中光照反應(yīng)3—4 h，葉片剪成2 cm葉段經(jīng)過（冰醋酸﹕無水乙醇=1﹕1）脫色、水合氯醛過夜固定，于熒光顯微鏡下統(tǒng)計(jì)活性氧面積及過敏性壞死面積（激發(fā)波長488 nm）。每次統(tǒng)計(jì)30個(gè)侵染點(diǎn)，進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)。

WGA染色：將經(jīng)過脫色固定后的葉片放置于含1.5 mL 1 mol·L-1KOH溶液的2 mL離心管中，高壓滅菌121℃，5 min，棄去離心管中的KOH溶液，50 mmol·L-1Tris-HCl浸泡30 min，重復(fù)浸泡2次后，用0.1% WGA熒光染液避光處理30 min。染色葉片在熒光顯微鏡（激發(fā)波長488 nm）下觀察統(tǒng)計(jì)菌落面積、菌絲長度、吸器數(shù)目。

生物量檢測：利用真菌DNA提取試劑盒提取接菌的小麥總DNA，將DNA樣品分別稀釋至10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6和10-7，以小麥和條銹菌為內(nèi)參基因制作雙標(biāo)準(zhǔn)曲線。通過雙標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算瞬時(shí)表達(dá)樣品中條銹菌的相對生物量，進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)。

1.7 寄主誘導(dǎo)的基因沉默

利用Ⅰ內(nèi)切酶線性化BSMV和空載體，Ⅰ內(nèi)切酶線性化載體，重組載體BSMV::及BSMV::重組載體用HⅡ內(nèi)切酶線性化。采用RiboMAXTMLarge Scale RNA Production System-T7（Promega）將線性化DNA片段進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄。參照Holzberg等[25]的方法，將BSMV::（、、:Hasp83）的體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物按1﹕1﹕1比例混合（各10 μL），加入200—300 μL FES緩沖液（2.613 g磷酸氫二鉀、1.877 g甘氨酸、0.5 g焦磷酸鈉、0.5 g硅藻土、0.5 g斑脫土，定容至50 mL，高壓滅菌20 min）中，充分混勻，摩擦接種小麥第2葉。BSMV::為陰性對照，BSMV::用于監(jiān)測BSMV系統(tǒng)。接種病毒后25℃培養(yǎng)10 d，待出現(xiàn)病毒癥狀，于第4葉接種條銹菌CYR31，分別于接菌后24、48和120 h采集接菌葉片進(jìn)行DAB與WGA染色，同時(shí)提取樣品RNA，觀察統(tǒng)計(jì)活性氧過敏性壞死面積，菌絲生長發(fā)育情況，分析沉默效率。

1.8 酵母雙雜交篩選候選靶標(biāo)

將重組誘餌質(zhì)粒pGBKT7-Hasp83Δsp利用PEG/ LiAC法轉(zhuǎn)化至酵母AH109中，篩選條銹菌侵染的小麥cDNA文庫，挑取在三缺培養(yǎng)基（SD-Trp-Leu-His）上生長的酵母單菌落，無菌水稀釋后在四缺培養(yǎng)基（SD-Trp-Leu-His-Ade）劃線，30℃培養(yǎng)，5 d后挑取單菌落轉(zhuǎn)移到含有X--gal的四缺培養(yǎng)基培養(yǎng)。利用AD-F和AD-R引物擴(kuò)增四缺培養(yǎng)基上顯藍(lán)的菌落，產(chǎn)物送至公司進(jìn)行測序。測序結(jié)果在NCBI 數(shù)據(jù)庫中BlastX比對，獲得候選基因序列。

酵母雙雜交驗(yàn)證效應(yīng)蛋白和候選靶標(biāo)互作：利用Primer Premier 5設(shè)計(jì)候選基因引物，以CYR31侵染小麥葉片的cDNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，將其產(chǎn)物構(gòu)建至pGADT7載體。將含候選基因的重組載體與pGBKT7-Hasp83Δsp質(zhì)粒共轉(zhuǎn)入酵母AH109菌株中，分別涂布于二缺培養(yǎng)基（SD-Trp-Leu）和三缺培養(yǎng)基（SD-Trp-Leu-His），30℃培養(yǎng)3 d。挑取SD-Trp-Leu上的陽性單菌落，以106、105、104、103梯度稀釋，在SD-Trp-Leu、SD-Trp-Leu-His和四缺培養(yǎng)基（SD-Trp-Leu-His-Ade）點(diǎn)斑，培養(yǎng)基倒置放于30℃培養(yǎng)3 d。

1.9 免疫共沉淀驗(yàn)證效應(yīng)蛋白和候選靶標(biāo)互作

將重組質(zhì)粒pBinGFP2-Hasp83Δsp和pICH86988- Tahir1-HA轉(zhuǎn)入GV3101感受態(tài)細(xì)胞，選取陽性菌落在含有卡那霉素（50 μg·mL-1）和利福平（50 μg·mL-1）的LB培養(yǎng)基中28℃培養(yǎng)36 h。農(nóng)桿菌菌液的處理見1.5。將含有pBinGFP2-Hasp83Δsp和pICH86988-Tahir1的農(nóng)桿菌菌液（各組分OD600終濃度均為0.5）注射煙草，25℃培養(yǎng)48 h后采樣。采集葉片于研缽中液氮速凍并充分研磨，研磨好的粉末置于2 mL離心管中加入預(yù)冷的NP-40裂解液進(jìn)行渦旋，12 000 r/min 4℃離心10 min。將上清轉(zhuǎn)移至含50 μL預(yù)處理GFP-Trap瓊脂糖凝膠珠的離心管中，4℃孵育2 h。1 000 r/min離心1 min，棄上清。用NP-40 裂解液洗滌凝珠3次，向離心管中加入1×SDS蛋白上樣緩沖液，沸水浴10 min。煮沸樣品在10%聚丙烯酰胺凝膠中電泳，利用轉(zhuǎn)膜儀將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，隨后將膜置于含5%脫脂奶粉的TBST緩沖液內(nèi)室溫封閉1 h，在含anti-GFP抗體的TBST緩沖液（抗體比例1﹕1 000）中4℃過夜孵育；TBST緩沖液清洗3次后，置于含辣根過氧化物酶交聯(lián)二抗的TBST緩沖液中室溫孵育1 h。TBST緩沖液清洗3次后，在化學(xué)發(fā)光成像儀下進(jìn)行曝光。

2 結(jié)果

2.1 Hasp83在條銹菌侵染小麥中上調(diào)表達(dá)

比較分析小麥條銹菌生理小種CYR31的夏孢子、芽管與吸器轉(zhuǎn)錄組，發(fā)現(xiàn)在吸器階段顯著上調(diào)表達(dá)（圖1）。（GenBank：KI516380.1）全長522 bp，編碼173個(gè)氨基酸，SignalP 5.0預(yù)測N端1—29位氨基酸為信號肽，SMART預(yù)測沒有明顯的結(jié)構(gòu)域。qRT-PCR分析結(jié)果顯示，在條銹菌夏孢子、芽管表達(dá)量較低，在條銹菌侵染的小麥葉片中誘導(dǎo)表達(dá)，24、72、和168 h表達(dá)量顯著升高，72 h達(dá)到峰值，表達(dá)量為在夏孢子中的308倍，隨后下降（圖2）。

H：吸器haustorium；GT：芽管germinated tube；U：夏孢子urediospore

U：夏孢子urediospore；GT：芽管germinated tube。 **：P＜0.01

2.2 Hasp83抑制Bax誘導(dǎo)的細(xì)胞壞死

Bax是一種小鼠促細(xì)胞凋亡蛋白，其在本氏煙中表達(dá)誘導(dǎo)產(chǎn)生細(xì)胞壞死，與病原菌誘導(dǎo)產(chǎn)生的過敏性壞死反應(yīng)具有相似的生理特性[26]。因此，能否抑制由Bax引起的細(xì)胞壞死成為初步篩選和檢驗(yàn)效應(yīng)蛋白毒性功能的有效方法[27-28]。通過農(nóng)桿菌侵染在本氏煙中瞬時(shí)表達(dá)Hasp83Δsp，24 h后注射含Bax的農(nóng)桿菌菌液，觀察本氏煙葉片的壞死情況。結(jié)果表明，單獨(dú)注射含pGR106-eGFP的農(nóng)桿菌菌液不能引起本氏煙細(xì)胞壞死，24 h后在原位置注射含Bax的農(nóng)桿菌菌液細(xì)胞壞死明顯；單獨(dú)注射含重組質(zhì)粒pGR106- Hasp83Δsp的農(nóng)桿菌菌液沒有出現(xiàn)壞死反應(yīng)，原位點(diǎn)注射含Bax的農(nóng)桿菌菌液后也未觀察到明顯壞死現(xiàn)象出現(xiàn)，與對照Avr1b表型一致（圖3）。Hasp83能抑制由Bax引發(fā)的細(xì)胞壞死。

2.3 Hasp83抑制小麥的基礎(chǔ)免疫反應(yīng)

含熒光假單胞菌EtHan注射小麥葉片能夠引起胼胝質(zhì)積累[29-30]，為明確Hasp83抑制小麥的基礎(chǔ)免疫作用，利用熒光假單胞菌EtHan的Ⅲ型分泌系統(tǒng)在小麥葉片瞬時(shí)表達(dá)Hasp83Δsp，檢測胼胝質(zhì)。注射攜帶有pEDV6-dsRed的熒光假單胞菌能激發(fā)小麥產(chǎn)生胼胝質(zhì)，表達(dá)陽性對照AvrRpt2誘導(dǎo)胼胝質(zhì)積累顯著增多，瞬時(shí)表達(dá)Hasp83的小麥葉片中胼胝質(zhì)數(shù)目較對照葉片dsRed相比顯著減少（圖4-A），進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)分析顯示，瞬時(shí)表達(dá)Hasp83的小麥葉片中胼胝質(zhì)數(shù)目較pEDV6-dsRed表達(dá)葉片相比降低44.53%（圖4-B），說明Hasp83可以抑制由熒光假單胞菌EtHan激發(fā)的小麥基礎(chǔ)免疫反應(yīng)。

A：攜帶有pGR106-Hasp83Δsp、pGR106-eGFP或 pGR106-Avr1b的農(nóng)桿菌侵染煙草葉片，24 h后注射含有pGR106-Bax的農(nóng)桿菌，5 d后觀察表型N. benthamiana leaves were infiltrated with A. tumefaciens containing pGR106-Hasp83Δsp, pGR106-eGFP, or pGR106-Avr1b, either alone or with A. tumefaciens cells carrying pGR106-Bax, which were infiltrated 24 h later. At 5 d post infiltration, the phenotypes were observed and photographed。B：農(nóng)桿菌侵染煙草葉片示意圖Schematic diagram of A. tumefaciens infiltrating N. benthamiana leaves

2.4 Hasp83抑制小麥抗條銹病反應(yīng)并促進(jìn)病原菌生長

為進(jìn)一步明確Hasp83能否抑制寄主小麥對條銹菌的抗性，在瞬時(shí)表達(dá)Hasp83的小麥葉片上接種條銹菌無毒小種CYR23，觀察統(tǒng)計(jì)接菌后24和48 h的活性氧與細(xì)胞壞死。結(jié)果顯示，與瞬時(shí)表達(dá)dsRed的葉片相比，表達(dá)Hasp83的小麥葉片中活性氧積累和細(xì)胞壞死面積在24和48 h均有不同程度減?。▓D5-A），活性氧積累面積在24和48 h分別下降34.47%和38.62%（圖5-B），細(xì)胞壞死面積在24和48 h分別減少19.35%和25.58%（圖5-C），表明Hasp83能抑制由無毒條銹菌生理小種引起的小麥抗病反應(yīng)。

A：苯胺藍(lán)染色觀察瞬時(shí)表達(dá)Hasp83小麥葉片中胼胝質(zhì)Observation of callose deposition stained by aniline blue in wheat leaves transiently expressing Hasp83。dsRed：陰性對照negative control；AvrRpt2能誘導(dǎo)胼胝質(zhì)產(chǎn)生bacterial AvrRpt2 could induce callose production in wheat。標(biāo)尺Scale=200 μm。

利用WGA染色條銹菌侵染結(jié)構(gòu)，觀察并統(tǒng)計(jì)菌絲長度和菌落擴(kuò)展面積。結(jié)果顯示，與對照葉片相比，表達(dá)Hasp83的小麥葉片接種條銹菌24和48 h后，條銹菌菌絲長度增長，菌落面積增大（圖6-A、6-B），瞬時(shí)表達(dá)Hasp83的小麥葉片接種條銹菌120 h后，條銹菌生物量顯著增加（圖6-C）。以上結(jié)果說明瞬時(shí)表達(dá)Hasp83抑制小麥免疫，促進(jìn)條銹菌生長發(fā)育。

2.5 HIGS沉默Hasp83減弱條銹菌致病力

為進(jìn)一步解析Hasp83在條銹菌致病性中的功能，設(shè)計(jì)的兩個(gè)特異片段，分別命名為和。其中，片段長為107 bp，片段為244 bp（圖7-A）。利用HIGS在小麥水源11與條銹菌CYR31親和互作體系中沉默，接種條銹菌14 d觀察侵染表型。沉默植株（BSMV::和BSMV::）中，條銹菌夏孢子堆數(shù)目與對照葉片BSMV::相比明顯減少（圖7-B）。qRT-PCR檢測沉默效率，結(jié)果顯示，在24 hpi的沉默葉片中表達(dá)量較對照BSMV::分別下降50%和44%，在48 hpi分別下降55%和39%，在120 hpi后分別下降60%和66%（圖7-C）。組織學(xué)觀察顯示，與BSMV::對照相比，在24和48 hpi沉默葉片中條銹菌的菌絲長度變短，侵染面積變小，形成的吸器數(shù)目變少；120 hpi菌落侵染面積也顯著減?。▓D7-E、7-F、7-G）。以上結(jié)果說明，瞬時(shí)沉默降低條銹菌毒力，抑制了條銹菌生長發(fā)育。

A：組織學(xué)觀察瞬時(shí)表達(dá)Hasp83小麥葉片接種條銹菌無毒生理小種CYR23 24和48 h的活性氧（ROS）積累及過敏性壞死反應(yīng)（HR），標(biāo)尺Scale =20 μm Histological observation of ROS accumulation and hypersensitive response (HR) in wheat leaves transiently expressing Hasp83 at 24 and 48 h post inoculation (hpi) of avirulent Pst CYR23。SV：氣孔下囊Sub-stomatal vesicle；IH：侵染菌絲Infection hyphae。B、C：條銹菌侵染小麥24和48 h ROS積累及細(xì)胞過敏性壞死反應(yīng)面積統(tǒng)計(jì)。3次生物學(xué)重復(fù)，每次統(tǒng)計(jì)30個(gè)侵染點(diǎn)。*：P＜0.05 Statistical analysis of ROS accumulation and HR per infection site at 24 and 48 hpi. The experiments were repeated for three biological replications with 30 infection sites for each replication

A、B：瞬時(shí)表達(dá)Hasp83小麥葉片中，條銹菌侵染24和48 h后菌絲長度及侵染面積統(tǒng)計(jì)。3次生物學(xué)重復(fù)，每次統(tǒng)計(jì)30個(gè)侵染點(diǎn)。*：P＜0.05 Statistical analysis of Pst hyphal length and infection area per infection site at 24 and 48 hpi. The experiments were repeated for three biological replications with 30 infection sites for each replication。C：條銹菌侵染小麥120 h的相對生物量，**：P＜0.01 Relative fungal biomass of Pst at 120 hpi in wheat leaves expressing Hasp83 calculated by qPCR

2.6 Hasp83與小麥Tahir1互作

以Hasp83作為誘餌蛋白，在條銹菌與小麥親和互作的酵母雙雜交cDNA文庫篩選其互作蛋白。經(jīng)過兩次重復(fù)，共獲得52個(gè)候選互作蛋白。對其中在兩次篩選結(jié)果中均出現(xiàn)的4個(gè)蛋白進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)其中過敏性壞死誘導(dǎo)蛋白（hypersensitive induced reaction protein 1，Tahir1）在兩次篩選結(jié)果中均有出現(xiàn)。（GenBank：AFD54041.1）全長840 bp，編碼279個(gè)氨基酸。為了驗(yàn)證二者是否存在互作關(guān)系，以CYR31侵染小麥葉片的cDNA為模板擴(kuò)增，測序正確后構(gòu)建至pGADT7載體進(jìn)行酵母雙雜交互作驗(yàn)證。結(jié)果顯示，共表達(dá)pGBKT7-Hasp83Δsp和pGADT7-Tahir1的酵母在四缺培養(yǎng)基（SD-Trp-Leu-His-Ade）上生長（圖8），表明Hasp83與Tahir1在酵母中存在互作。進(jìn)一步利用Co-IP驗(yàn)證Hasp83與Tahir1的互作。在煙草中將Tahir1-HA分別與Hasp83-GFP和GFP（陰性對照）共表達(dá)，提取煙草葉片總蛋白進(jìn)行Western blot檢測，結(jié)果顯示，煙草總蛋白中均能檢測到Hasp83-GFP，GFP與Tahir1-HA，表明蛋白均表達(dá)成功；利用GFP-Trap富集總蛋白，沉淀產(chǎn)物中可以同時(shí)檢測到Hasp83-GFP及Tahir1-HA，而陰性對照GFP中則不能檢測到Tahir1-HA（圖9），表明Hasp83與Tahir1在植物體內(nèi)存在互作關(guān)系。

A：Hasp83特異沉默片段示意圖Schematic diagram of the specific silencing fragment of Hasp83。B：利用HIGS技術(shù)沉默Hasp83，接種條銹菌CYR31，14 d后觀察表型Disease phenotypes of Hasp83-silencing wheat plants inoculated with Pst CYR31 observed at 14 d post inoculation。C：qRT-PCR分析24、48和120 hpi Hasp83的沉默效率Silencing efficiency of Hasp83 at 24, 48 and 120 hpi assessed using qRT-PCR。BSMV::γ：陰性對照negative control。D：組織學(xué)觀察Hasp83沉默葉片接種CYR31 24和48 h的條銹菌生長發(fā)育（標(biāo)尺Scale=20 μm）Histological observation of fungal growth in Hasp83-silencing wheat plants infected with CYR31。SV：氣孔下囊Sub-stomatal vesicle；IH：侵染菌絲Infection hyphae；HMC：吸器母細(xì)胞Haustorial mother cell。E—G：Hasp83沉默葉片中，接種條銹菌24、48和120 h后吸器數(shù)量、菌絲長度及侵染面積統(tǒng)計(jì)。3次生物學(xué)重復(fù)，每次重復(fù)統(tǒng)計(jì)30個(gè)侵染點(diǎn)。*：P＜0.05，**：P＜0.01 Statistical analysis of Pst haustorium number, hyphal length and infection area per infection site in Hasp83-silencing plants. The experiments were repeated for three biological replications, with 30 infection sites for each replication

圖8 酵母雙雜交驗(yàn)證Hasp83與候選小麥蛋白Tahir1互作

圖9 免疫共沉淀胞外驗(yàn)證Hasp83與靶標(biāo)蛋白Tahir1的互作

3 討論

3.1 小麥條銹菌效應(yīng)蛋白的研究方法

條銹菌侵染小麥時(shí)通過吸器向寄主分泌效應(yīng)蛋白調(diào)控植物的免疫與代謝，促進(jìn)寄主植物感病[11]。鑒定小麥條銹菌的關(guān)鍵效應(yīng)蛋白，對揭示其致病機(jī)理具有重要意義。近年來，通過生物信息學(xué)分析從小麥條銹菌全基因組與吸器轉(zhuǎn)錄組中獲得大量分泌蛋白基因[15-16]，為鑒定小麥條銹菌效應(yīng)蛋白提供了豐富的基因資源。然而，小麥條銹菌為活體營養(yǎng)寄生真菌，缺乏穩(wěn)定的遺傳轉(zhuǎn)化體系，極大限制了效應(yīng)蛋白基因的功能研究。寄主誘導(dǎo)的基因沉默（HIGS）技術(shù)通過在寄主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)靶向病原菌效應(yīng)蛋白基因的干擾片段，在小麥條銹菌侵染過程中通過吸器跨界轉(zhuǎn)運(yùn)到病原菌，從而特異沉默病原菌靶標(biāo)基因[31-33]。利用細(xì)菌Ⅲ型分泌系統(tǒng)（T3SS）可將病原菌效應(yīng)蛋白直接轉(zhuǎn)入寄主細(xì)胞，為在小麥中瞬時(shí)表達(dá)條銹菌基因提供了技術(shù)支持[29]。這些技術(shù)的發(fā)展，為解析活體營養(yǎng)專性寄生真菌的基因功能奠定了基礎(chǔ)，并促進(jìn)了小麥條銹菌效應(yīng)蛋白的鑒定與功能研究。

通過HIGS瞬時(shí)沉默及T3SS介導(dǎo)的瞬時(shí)表達(dá)技術(shù)，鑒定到一批顯著影響條銹菌致病力的效應(yīng)蛋白，如Hasp68、Hasp2和Hasp98[21,34-35]。研究表明這些效應(yīng)蛋白基因沉默后均顯著降低條銹菌致病力，瞬時(shí)表達(dá)抑制小麥的PTI和ETI。本研究鑒定并克隆了一個(gè)在吸器階段誘導(dǎo)表達(dá)的條銹菌效應(yīng)蛋白基因，小麥上瞬時(shí)表達(dá)效應(yīng)蛋白能夠抑制小麥PTI相關(guān)胼胝質(zhì)積累及無毒條銹菌生理小種誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)，促進(jìn)條銹菌生長發(fā)育，瞬時(shí)沉默則顯著降低條銹菌致病力，表明Hasp83為影響條銹菌致病力的關(guān)鍵效應(yīng)蛋白。不同于Hasp8[36]在條銹菌侵染前期誘導(dǎo)表達(dá)，在條銹菌侵染小麥早期及后期均誘導(dǎo)表達(dá)，特別在72 h達(dá)到表達(dá)高峰，表明在條銹菌侵染早期與寄主建立寄生關(guān)系及后期在小麥葉肉細(xì)胞間的擴(kuò)展中均發(fā)揮功能。

3.2 小麥條銹菌效應(yīng)蛋白調(diào)控寄主免疫的作用機(jī)制

小麥條銹菌效應(yīng)蛋白能夠通過多種作用途徑調(diào)控寄主的免疫反應(yīng)。Pst_12806、Pst_4和Pst_5通過干擾葉綠體光合作用抑制葉綠體介導(dǎo)免疫，促進(jìn)致病[18-19]。富含甘氨酸和絲氨酸效應(yīng)蛋白PstGSRE1及細(xì)胞核效應(yīng)蛋白Pst_A23分別通過干擾轉(zhuǎn)錄因子TaLOL2入核或寄主pre-mRNA可變剪接，在轉(zhuǎn)錄水平和轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)寄主基因轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)病菌侵染[20,37]。Pst18363和Pst27791增強(qiáng)免疫負(fù)調(diào)控因子Nudix水解酶23（TaNUDX23）及TaRaf46蛋白穩(wěn)定[23,38]，PsSpg1則通過提高感病基因激酶活性抑制寄主抗病性[22]。這類效應(yīng)蛋白操縱寄主感病基因介導(dǎo)小麥感病性，另外一類效應(yīng)蛋白則通過抑制免疫正調(diào)控因子的活性，抑制寄主免疫。Hasp98和 PstGSRE4分別抑制寄主免疫正調(diào)控激酶TaMAPK4的活性，銅鋅超氧化物歧化酶TaCZSOD2活性，導(dǎo)致寄主活性氧積累減少，介導(dǎo)條銹菌致病力[21,39]。本研究中，Hasp83與小麥過敏性壞死（HR）誘導(dǎo)蛋白Tahir1互作。在玉米與大麥中，的表達(dá)與寄主植物局部細(xì)胞壞死及抗病反應(yīng)相關(guān)[40-41]。Athir1和Athir2能夠與NB-LRR類抗病蛋白RPS2形成復(fù)合體激活植物的ETI，在擬南芥中過表達(dá)和顯著減弱丁香假單胞菌DC3000生長與侵染[42]。水稻Oshir1蛋白定位在細(xì)胞質(zhì)膜上，與LRR類抗性蛋白Oslrr1互作，促進(jìn)植物的過敏性壞死，以阻止丁香假單胞菌DC3000的進(jìn)一步侵染與擴(kuò)展[43]。研究表明Hir蛋白通常與R蛋白互作，介導(dǎo)植物抗病HR。鑒于過敏性壞死誘導(dǎo)蛋白在植物抗病HR的重要作用[40-41]，推測效應(yīng)蛋白Hasp83通過與Tahir1互作，影響Tahir1功能抑制HR反應(yīng)，可能通過干擾Tahir1與R蛋白的互作，影響Tahir1穩(wěn)定或活性等作用機(jī)制。后續(xù)對Tahir1在小麥抗條銹病及HR反應(yīng)中的功能，及Hasp83調(diào)控Tahir1抑制小麥HR，降低抗病性的作用機(jī)制需進(jìn)一步研究。在深入揭示作用機(jī)理的基礎(chǔ)上，有望通過沉默創(chuàng)制RNAi小麥，精準(zhǔn)編輯Tahir1與Hasp83互作位點(diǎn)打破二者互作，創(chuàng)制抗病小麥材料。

4 結(jié)論

Hasp83可作為小麥條銹菌的重要效應(yīng)蛋白，具有抑制寄主免疫增強(qiáng)病原菌致病力的毒性功能，效應(yīng)蛋白Hasp83與小麥過敏性壞死誘導(dǎo)蛋白Tahir1互作。

[1] 陳萬權(quán), 徐世昌, 吳立人. 中國小麥條銹病流行體系與持續(xù)治理研究回顧與展望. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué), 2007, 40(增刊1): 177-183.

Chen W Q, Xu S C, Wu L R. Epidemiology and sustainable management of wheat stripe rust caused byWest. in China: A historical retrospect and prospect.Scientia Agricultura Sinica, 2007, 40 (Suppl. 1): 177-183. (in Chinese)

[2] 陳萬權(quán), 康振生, 馬占鴻, 徐世昌, 金社林, 姜玉英. 中國小麥條銹病綜合治理理論與實(shí)踐. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué), 2013, 46(20): 4254-4262.

CHEN W Q, KANG Z S, MA Z H, Xu S C, Jin S L, JIANG Y Y. Integrated management of wheat stripe rust caused byf. sp.in China. Scientia Agricultura Sinica, 2013, 46(20): 4254-4262. (in Chinese)

[3] WAN A M, ZHAO Z H, CHEN X M, HE Z H, JIN S L, JIA Q Z, YAO G, YANG J X, WANG B T, LI G B, BI Y Q, YUAN Z Y. Wheat stripe rust epidemic and virulence off. sp.in China in 2002. Plant Disease, 2004, 88(8): 896-904.

[4] CHEN W Q, WU L R, LIU T G, XU S C, JIN S L, PENG Y L, WANG B T. Race dynamics, diversity, and virulence evolution inf. sp., the causal agent of wheat stripe rust in China from 2003 to 2007. Plant Disease, 2009, 93(11): 1093-1101.

[5] WAN A M, CHEN X M, HE Z H. Wheat stripe rust in China. Australian Journal of Agricultural Research, 2007, 58(6): 605-619.

[6] LINE R F. Stripe rust of wheat and barley in North America: a retrospective historical review. Annual Review of Phytopathology, 2002, 40: 75-118.

[7] FISHER M C, HENK D A, BRIGGS C J, BROWNSTEIN J S, MADOFF L C, MCCRAW S L, GURR S J. Emerging fungal threats to animal, plant and ecosystem health. Nature, 2012, 484(7393): 186-194.

[8] JONES J D G, DANGL J L. The plant immune system. Nature, 2006, 444(7117): 323-329.

[9] YU X, FENG B M, HE P, SHAN L B. From chaos to harmony: Responses and signaling upon microbial pattern recognition. Annual Review of Phytopathology, 2017, 55: 109-137.

[10] HE Q, MCLELLAN H, BOEVINK P C, BIRCH P R J. All roads lead to susceptibility: The many modes of action of fungal and oomycete intracellular effectors. Plant Communications, 2020, 1(4): 100050.

[11] STAPLES R C. Nutrients for a rust fungus: the role of haustoria. Trends in Plant Science, 2001, 6(11): 496-498.

[12] GIRALDO M C, VALENT B. Filamentous plant pathogen effectors in action. Nature Reviews. Microbiology, 2013, 11(11): 800-814.

[13] CATANZARITI A M, DODDS P N, ELLIS J G. Avirulence proteins from haustoria-forming pathogens. FEMS Microbiology Letters, 2007, 269(2): 181-188.

[14] GARNICA D P, NEMRI A, UPADHYAYA N M, RATHJEN J P, DODDS P N. The ins and outs of rust haustoria. PLoS pathogens, 2014, 10(9): e1004329.

[15] ZHENG W M, HUANG L L, HUANG J Q, WANG X J, CHEN X M, ZHAO J, GUO J, ZHUANG H, QIU C Z, LIU J,. High genome heterozygosity and endemic genetic recombination in the wheat stripe rust fungus. Nature Communications, 2013, 4: 2673.

[16] XU Q, TANG C L, WANG L K, ZHAO C C, KANG Z S, WANG X J. Haustoria-arsenals during the interaction between wheat andf. sp.. Molecular Plant Pathology, 2020, 21(1): 83-94.

[17] XU Q, WANG J F, ZHAO J R, XU J H, SUN S T, ZHANG H F, WU J J, TANG C L, KANG Z S, WANG X J. A polysaccharide deacetylase fromf. sp.is an important pathogenicity gene that suppresses plant immunity. Plant Biotechnology Journal, 2020, 18(8): 1830-1842.

[18] XU Q, TANG C L, WANG X D, SUN S T, ZHAO J R, KANG Z S, WANG X J. An effector protein of the wheat stripe rust fungus targets chloroplasts and suppresses chloroplast function. Nature Communications, 2019, 10(1): 5571.

[19] WANG X D, ZHAI T, ZHANG X M, TANG C L, ZHUANG R, ZHAO H B, XU Q, CHENG Y L, WANG J F, DUPLESSIS S, KANG Z S, WANG X J. Two stripe rust effectors impair wheat resistance by suppressing import of host Fe-S protein into chloroplasts. Plant Physiology, 2021, 187(4): 2530-2543.

[20] 許強(qiáng). 小麥條銹菌效應(yīng)蛋白Pst_A23調(diào)控植物pre-mRNA可變剪切抑制植物免疫[D]. 楊凌: 西北農(nóng)林科技大學(xué), 2020.

XU Q. Pre-mRNA regulation mediated byeffector Pst_A23 suppresses plant immunity[D]. Yangling: Northwest A&F University, 2020. (in Chinese)

[21] WEI J P, WANG X D, HU Z Y, WANG X J, WANG J L, WANG J F, HUANG X L, KANG Z S, TANG C L. Theeffector Hasp98 facilitates pathogenicity by blocking the kinase activity of wheat TaMAPK4. Journal of integrative plant biology, 2023, 65(1): 249-264.

[22] WANG N, TANG C L, FAN X, HE M Y, GAN P F, ZHANG S, HU Z Y, WANG X D, YAN T, SHU W X,. Inactivation of a wheat protein kinase gene confers broad-spectrum resistance to rust fungi. Cell, 2022, 185(16): 2961-2974.

[23] WAN C P, LIU Y, TIAN S X, GUO J, BAI X X, ZHU H C, KANG Z S, GUO J. A serine-rich effector from the stripe rust pathogen targets a Raf-like kinase to suppress host immunity.Plant Physiology, 2022, 190(1): 762-778.

[24] PFAFFL M W. A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR. Nucleic Acids Research, 2001, 29(9): 2002-2007.

[25] HOLZBERG S, BROSIO P, GROSS C, POGUE G P. Barley stripe mosaic virus-induced gene silencing in a monocot plant. The Plant Journal, 2002, 30(3): 315-327.

[26] LACOMME C, CRUZ S S. Bax-induced cell death in tobacco is similar to the hypersensitive response. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 1999, 96(14): 7956-7961.

[27] ABRAMOVITCH R B, KIM Y J, Chen S R, DICKMAN M B, MARTIN G B.type III effector AvrPtoB induces plant disease susceptibility by inhibition of host programmed cell death. The EMBO Journal, 2003, 22(1): 60-69.

[28] JAMIR Y, GUO M, OH H S, PETNICKI-OCWIEJA T, CHEN S R, TANG X Y, DICKMAN M B, COLLMER A, ALFANO J R. Identification oftype III effectors that can suppress programmed cell death in plants and yeast. The Plant Journal, 2004, 37(4): 554-565.

[29] YIN C T, HULBERT S. Prospects for functional analysis of effectors from cereal rust fungi. Euphytica, 2011, 179(1): 57-67.

[30] XIN X F, HE S Y.pv.DC3000: a model pathogen for probing disease susceptibility and hormone signaling in plants. Annual Review of Phytopathology, 2013, 51: 473-498.

[31] QI T, GUO J, PENG H, LIU P, KANG Z S, GUO J. Host-induced gene silencing: A powerful strategy to control diseases of wheat and barley. International Journal of Molecular Sciences, 2019, 20(1): 206.

[32] KOCH A, WASSENEGGER M. Host-induced gene silencing— mechanisms and applications. New Phytologist, 2021, 231(1): 54-59.

[33] NOWARA D, GAY A, LACOMME C, SHAW J, RIDOUT C, DOUCHKOV D, HENSEL G, KUMLEHN J, SCHWEIZER P. HIGS: Host-induced gene silencing in the obligate biotrophic fungal pathogen. The Plant Cell, 2010, 22(9): 3130-3141.

[34] 於立剛, 齊曉晚, 魏晉萍, 王婷, 王曉杰, 康振生, 湯春蕾. 條形柄銹菌吸器特異效應(yīng)蛋白Hasp68抑制寄主免疫并與小麥組織蛋白酶B互作. 菌物學(xué)報(bào), 2020, 39(10): 1905-1919.

YU L G, QI X W, WEI J P, WANG T, WANG X J, KANG Z S, TANG C L. A haustorium-specific effector protein Hasp68 ofsuppresses wheat immunity by targeting wheat cathepsin B TaCTSB. Mycosystema, 2020, 39(10): 1905-1919. (in Chinese)

[35] 季森, 趙夢鑫, 徐靜華, 湯春蕾, 康振生, 王曉杰. 小麥條銹菌效應(yīng)蛋白HASP2抑制寄主免疫反應(yīng). 植物病理學(xué)報(bào), 2019, 49(3): 326-333.

JI S, ZHAO M X, XU J H, TANG C L, KANG Z S, WANG X J. Wheat stripe rust effector HASP2 inhibits host immune response. Acta Phytopathologica Sinica, 2019, 49(3): 326-333. (in Chinese)

[36] 趙聰聰, 盛麗梅, 許強(qiáng), 湯春蕾, 康振生, 王曉杰. 小麥條銹菌細(xì)胞質(zhì)效應(yīng)子Hasp8抑制植物基礎(chǔ)免疫. 植物保護(hù)學(xué)報(bào), 2020, 47(3): 537-545.

ZHAO C C, SHENG L M, XU Q, TANG C L, KANG Z S, WANG X J. Cytoplasmic effector Hasp8 off. sp.inhibits plant immunity. Journal of Plant Protection, 2020, 47(3): 537-545. (in Chinese)

[37] QI T, GUO J, LIU P, HE F X, WAN C P, Islam M A, TYLER B M, KANG Z S, GUO J. Stripe rust effector PstGSRE1 disrupts nuclear localization of ROS-promoting transcription factor TaLOL2 to defeat ROS-induced defense in wheat. Molecular Plant, 2019, 12(12): 1624-1638.

[38] YANG Q, HUAI B Y, LU Y X, CAI K Y, GUO J, ZHU X G, KANG Z S, GUO J. A stripe rust effector Pst18363 targets and stabilises TaNUDX23 that promotes stripe rust disease. New Phytologist, 2020, 225(2): 880-895.

[39] LIU C, WANG Y Q, WANG Y F, DU Y Y, SONG C, SONG P, YANG Q, HE F X, BAI X X, HUANG L L, GUO J, KANG Z S, GUO J. Glycine-serine-rich effector PstGSRE4 inf. sp.inhibits the activity of copper zinc superoxide dismutase to modulate immunity in wheat. PLoS pathogens, 2022, 18(7): e1010702.

[40] NADIMPALLI R, YALPANI N, JOHAL G S, SIMMONS C R. Prohibitins, stomatins, and plant disease response genes compose a protein superfamily that controls cell proliferation, ion channel regulation, and death. The Journal of Biological Chemistry, 2000, 275(38): 29579-29586.

[41] ROSTOKS N, SCHMIERER D, KUDRNA D, KLEINHOFS A. Barley putative hypersensitive induced reaction genes: genetic mapping, sequence analyses and differential expression in disease lesion mimic mutants. Theoretical and Applied Genetics, 2003, 107(6): 1094-1101.

[42] QI Y P, TSUDA K, NGUYEN L V, WANG X, LIN J S, MURPHY A S, GLAZEBROOK J, Thordal-CHRISTENSEN H, KATAGIRI F. Physical association ofhypersensitive induced reaction proteins (HIRs) with the immune receptor RPS2. The Journal of Biological Chemistry, 2011, 286(36): 31297-31307.

[43] ZHOU L, CHEUNG M Y, LI M W, FU Y P, SUN Z X, SUN S M, LAM H M. Rice hypersensitive induced reaction protein 1 (OsHIR1) associates with plasma membrane and triggers hypersensitive cell death. BMC Plant Biology, 2010, 10: 290.

Functional Analysis of Effector Hasp83 in the Pathogenicity off. sp.

WANG JianFeng, Cheng JiaXin, Shu WeiXue, Zhang YanRu, WANG XiaoJie, KANG ZhenSheng, TANG ChunLei

College of Plant Protection, Northwest A&F University/State Key Laboratory of Crop Stress Biology for Arid Areas, Yangling 712100, Shaanxi

【Background】Wheat stripe rust is a serious disease on wheat, which is caused byf. sp.().is an obligate biotrophic fungus, which can form haustorium during infection and absorb nutrients from the host plants via haustorium. Moreover,secretes effectors through haustorium to regulate host immunity and promotes the infection process.【Objective】The objective of this study is to clarify the function and mechanism ofeffectors, and to reveal the pathogenicity mechanism of.【Method】By comparing the transcriptome ofurediospore, germinated tube and haustorium,encoding secreted protein was identified to be significantly induced in haustorium, and whether it could inhibit the cell death caused by BAX onleaves was observed through-mediated transient expression. qRT-PCR was used to detect the expression level ofduring differentinfection stages in wheat. The type Ⅲ secretion system (T3SS) ofEtHan and host induced gene silencing (HIGS) were carried out to investigate the function ofduringinfection. The yeast two-hybrid (Y2H) system was used to screen the proteins interacting with Hasp83 in wheat, and co-inmunoprecipitation (Co-IP) assay was used to further verify the interaction by co-expressing Hasp83 and its candidate target proteins incells.【Result】The open reading frame (ORF) ofis 522 bp, encoding 173 amino acids. Hasp83 contains no conserved domain, and the N-terminal 1-29 amino acids encode a signal peptide, which could inhibit the cell death caused by BAX onleaves through-mediated transient expression. qRT-PCR analysis revealed thatwas up-regulated duringinfection in wheat. Transient expression of, and lead to 19.35%-38.62% decrease of reactive oxygen species (ROS) accumulation area and necrotic cell area caused by the avirulentrace CYR23 in wheat. Silencing ofby HIGS in Suwon11 wheat leaves infected with the virulentrace CYR31 significantly reduced pathogenicity ofcompared to controls, resulting in less urediospore sporulation, shorter infection hyphal length, smaller infection area, and decreased haustorium number. Y2H result showed that the effector Hasp83 interacted with wheat hypersensitive-induced reaction (HIR) protein, Tahir1. The interaction between Hasp83 and Tahir1 was further confirmed by Co-IP assay in.【Conclusion】effector Hasp83 can suppress wheat immunity caused by the non-pathogenic bacteria and avirulent, and enhance the pathogenicity of.

wheat stripe rust; haustorium; effector; transcriptome analysis; identification of target protein

10.3864/j.issn.0578-1752.2023.05.005

2022-10-31；

2022-12-19

國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2021YFD1401000）、國家小麥產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（CARS-03）、中央高校基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)（2452020223）

王建鋒，E-mail：ipp@nwsuaf.edu.cn。通信作者湯春蕾，E-mail：tclbad@163.com

（責(zé)任編輯 岳梅）