姜黃素通過SIRT1/FOXO1通路緩解玉米赤霉烯酮誘導(dǎo)的豬腎上皮細(xì)胞氧化損傷

崔紅杰，盧春亭，潘麗琴，胡會(huì)，鐘佩云，朱潔瑩，張凱照，黃小紅

姜黃素通過SIRT1/FOXO1通路緩解玉米赤霉烯酮誘導(dǎo)的豬腎上皮細(xì)胞氧化損傷

崔紅杰1, 2，盧春亭1，潘麗琴1，胡會(huì)1，鐘佩云1，朱潔瑩1，張凱照1, 2，黃小紅1, 2

1福建農(nóng)林大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，福州 350002；2中西獸醫(yī)結(jié)合與動(dòng)物保健福建省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/福建省獸醫(yī)中藥與動(dòng)物保健重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建農(nóng)林大學(xué)，福州 350002

【目的】探究姜黃素（Cur）對玉米赤霉烯酮（ZEA）誘導(dǎo)豬腎上皮細(xì)胞（PK-15）氧化損傷的保護(hù)作用，并基于SIRT1/FOXO1信號(hào)通路闡明其作用機(jī)制，為姜黃素的獸醫(yī)臨床應(yīng)用提供依據(jù)?！痉椒ā吭囼?yàn)分為5組：對照組、ZEA組（36.55 μg·mL-1ZEA）、Cur 6.25組（36.55 μg·mL-1ZEA+6.25 μmol·L-1Cur）、Cur 12.5組（36.55 μg·mL-1ZEA+12.5 μmol·L-1Cur）、Cur 25組（36.55 μg·mL-1ZEA +25 μmol·L-1Cur）；通過MTT法測定ZEA的半數(shù)抑制濃度和Cur對PK-15細(xì)胞的最大安全濃度；使用倒置顯微鏡觀察PK-15細(xì)胞的形態(tài)變化；采用試劑盒檢測細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）、超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）以及丙二醛（MDA）的水平；qRT-PCR檢測細(xì)胞SIRT1、FOXO1、CAT、Mn-SOD的mRNA水平；Western Blot檢測SIRT1、FOXO1和Acetyl-FOXO1蛋白的表達(dá)量。【結(jié)果】ZEA的IC50為36.55 μg·mL-1，Cur的最大安全濃度為25 μmol·L-1；與對照組相比，ZEA極顯著降低PK-15細(xì)胞活力（＜0.01），極顯著提高ROS和MDA水平（＜0.01），極顯著降低SOD、CAT活性（＜0.01）；與ZEA組對比，不同濃度的Cur（6.25、12.5、25 μmol·L-1）顯著提高PK-15細(xì)胞的存活率（＜0.05），改善細(xì)胞形態(tài)；極顯著（＜0.01）降低ZEA誘導(dǎo)的ROS和MDA水平；極顯著升高細(xì)胞內(nèi)SOD和CAT活性（＜0.01）。qRT-PCR結(jié)果顯示，與對照組相比，ZEA降低SIRT1 mRNA表達(dá)量，極顯著升高FOXO1 mRNA表達(dá)量（＜0.01），升高M(jìn)n-SOD mRNA表達(dá)量，極顯著降低CAT mRNA表達(dá)量（＜0.01）。與ZEA組對比，各Cur組不同程度的升高SIRT1和CAT的mRNA表達(dá)量，極顯著的降低FOXO1的mRNA表達(dá)量（＜0.01）；極顯著升高M(jìn)n-SOD的mRNA表達(dá)量（＜0.01）。Western Blot結(jié)果表明，與對照組對比，ZEA顯著降低SIRT1蛋白表達(dá)（＜0.05），極顯著升高Acetyl-FOXO1蛋白表達(dá)（＜0.01）；與ZEA組對比，各Cur組均極顯著升高SIRT1蛋白表達(dá)（＜0.01），極顯著降低Acetyl-FOXO1蛋白表達(dá)（＜0.01）?！窘Y(jié)論】Cur可以上調(diào)SIRT1的表達(dá)，降低FOXO1的乙?；?，誘導(dǎo)抗氧化酶Mn-SOD和CAT的表達(dá)，從而清除ROS，降低MDA水平，減輕ZEA對PK-15細(xì)胞的氧化損傷作用。

姜黃素；玉米赤霉烯酮；氧化應(yīng)激；沉默信息調(diào)節(jié)因子1 (SIRT1)

0 引言

【研究意義】玉米赤霉烯酮（zearalenone，ZEA）是一種非甾體霉菌毒素，由多種鐮刀菌通過聚酮途徑生物合成[1]，被國際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）列為具有嚴(yán)重生殖毒性的第3類致癌物[2]。ZEA廣泛存在于谷物和食品中，BIOMIN研究中心監(jiān)測全球100個(gè)國家10年的（2008—2017）霉菌毒素報(bào)告顯示，45%的玉米、小麥、大麥、大豆等飼料原料及其成品飼料被ZEA污染[3]，2019年我國飼料的ZEA檢出率為55%[4]，足見其污染嚴(yán)重性。ZEA化學(xué)結(jié)構(gòu)與17β-雌二醇相似[5]，能夠與雌激素受體（17β-雌二醇特異性受體）結(jié)合，導(dǎo)致生殖障礙，包括生育力低、胎兒發(fā)育異常、產(chǎn)仔數(shù)減少和生殖激素水平的改變[6]。ZEA還具有免疫毒性、肝毒性、腎毒性、遺傳毒性等。腎臟是ZEA產(chǎn)生毒性作用的主要器官之一，ZEA在動(dòng)物體內(nèi)通過肝腸循環(huán)由腎臟排出，在仔豬日糧中添加1.1—3.2 mg·kg-1ZEA會(huì)導(dǎo)致肝腎應(yīng)激[7]；通過雌性小鼠腹腔注射ZEA，發(fā)現(xiàn)ZEA導(dǎo)致小鼠腎臟氧化應(yīng)激，加速腎細(xì)胞凋亡，增加血清肌酐和尿素[8]。ZEA在腎臟的積聚可引起腎小球的分葉和萎縮，誘導(dǎo)小鼠的腎發(fā)生氧化應(yīng)激和凋亡導(dǎo)致蛋白尿[9]。因此，尋找有效的保護(hù)劑來保護(hù)腎臟免受ZEA的損害是非常重要的。【前人研究進(jìn)展】氧化損傷是ZEA產(chǎn)生毒性的主要途徑之一，許多研究表明ZEA通過產(chǎn)生活性氧（reactive oxygen species，ROS）誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯、DNA損傷、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、細(xì)胞自噬、線粒體損傷和細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致細(xì)胞死亡[10-11]。Sirtuin 1（SIRT1）是一種依賴于NAD+的去乙?；?，通過去除組蛋白和各種轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子上的乙?；鶃碚{(diào)控基因表達(dá)[12]。叉頭轉(zhuǎn)錄因子O 1（forkhead box O1，F(xiàn)OXO1）是叉頭轉(zhuǎn)錄因子O類家族的成員，在調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝和氧化應(yīng)激反應(yīng)的各種信號(hào)通路中起著關(guān)鍵作用。研究表明，F(xiàn)OXO1是SIRT1的主要靶蛋白，SIRT1能使FOXO1 DNA結(jié)合域內(nèi)的賴氨酸殘基去乙酰化，并促進(jìn)FOXO1的核保留，增加其轉(zhuǎn)錄活性[13]。姜黃素（curcumin，Cur），學(xué)名1,7-雙（4-羥基-3-甲氧基苯基）-1,6-庚二烯-3,5-二酮，是一種疏水多酚化合物，廣泛存在于姜科姜黃屬多年生植物，如姜黃、莪術(shù)、郁金等的根莖中。姜黃素具有很強(qiáng)的抗氧化性能，可與維生素C或E的活性相媲美。已有文獻(xiàn)報(bào)道姜黃素是活性氧（ROS）和活性氮（RNS）的清除劑，包括超氧陰離子、羥基自由基和二氧化氮[14]。在各種動(dòng)物模型中，姜黃素也被證明可以抑制包括脂質(zhì)過氧化的氧化損傷[15]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前尚不清楚姜黃素是否可以減輕ZEA對腎臟的傷害，其保護(hù)機(jī)制也尚未闡明?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究以豬腎上皮細(xì)胞系PK-15為研究模型，通過添加ZEA和不同濃度的Cur，檢測ROS、SOD、CAT、MDA等氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)以及抗氧化基因SIRT1、FOXO1、CAT、Mn-SOD的mRNA水平，旨在探討姜黃素對ZEA誘導(dǎo)氧化損傷的保護(hù)作用，以期為姜黃素的獸醫(yī)臨床應(yīng)用提供依據(jù)，并為防治其他真菌毒素中毒提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

姜黃素、甲基噻唑藍(lán)（MTT）、二甲基亞砜（DMSO）均購自Sigma（美國）；ZEA購自Acmec（中國）；胎牛血清、DMEM-高糖培養(yǎng)基、PBS、青－鏈霉素（P＆S）均購自Hyclone（美國）；活性氧（ROS）檢測試劑盒購自茁彩（中國）；超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）和丙二醛（MDA）測定試劑盒購自南京建成生物工程研究（中國）；Eastep?Supper總RNA提取試劑盒購自Promega（美國）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（RR036A）和熒光定量PCR試劑盒（RR820A）均購自TaKaRa（日本）；電泳液，轉(zhuǎn)膜液，預(yù)染蛋白maker（10—180 kD）、脫脂牛奶、10×TBST、RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液（5×）、Anti-β-actin均購自上海碧云天公司；PVDF膜購自北京索萊寶公司；羊抗兔IgG-HRP購自武漢博士德公司；ECL化學(xué)發(fā)光顯色液購自美國Advansta公司；Anti-SIRT1、Anti-FOXO1、Anti-Acetyl-FOXO1購自ABclonal公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀購自賽默飛（美國）；酶標(biāo)儀購自TECAN（瑞士）。

1.2 試驗(yàn)時(shí)間和地點(diǎn)

試驗(yàn)時(shí)間為2021年3月至2022年1月，試驗(yàn)地點(diǎn)為福建農(nóng)林大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院中西獸醫(yī)結(jié)合與動(dòng)物保健福建省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

1.3 細(xì)胞復(fù)蘇與培養(yǎng)

將PK-15細(xì)胞從液氮罐中取出，在37℃恒溫水浴箱中迅速搖晃溶解，室溫下1 000 r/min，離心10 min；棄上清液，加入適量培養(yǎng)液重懸細(xì)胞移至培養(yǎng)瓶中，放在37℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，24 h后觀察貼壁情況和更換培養(yǎng)液。待細(xì)胞生長到培養(yǎng)瓶80%以上時(shí)，棄掉原培養(yǎng)液，用PBS清洗3次后，0.25%胰酶消化，進(jìn)行正常的傳代。

1.4 MTT法測定細(xì)胞活力

將生長良好的PK-15細(xì)胞消化，計(jì)數(shù)、稀釋至2×105個(gè)/mL，加入96孔板中培養(yǎng)24 h后，棄上清，加入100 μL/孔不同濃度的Cur或ZEA，培養(yǎng)24 h。倒置顯微鏡下觀察藥物作用效果；每孔加入10 μL MTT溶液（MTT終濃度約為5 mg·mL-1），37℃避光培養(yǎng)4 h后，吸出上清液，每孔加入150 μL DMSO，吹打混勻，通過酶標(biāo)儀測定結(jié)晶溶液在490 nm下的OD值，用公式計(jì)算細(xì)胞存活率、細(xì)胞抑制率。

1.5 試驗(yàn)分組

試驗(yàn)分為5組，分別為對照組（維持培養(yǎng)液）、ZEA組（36.55 μg·mL-1ZEA+維持培養(yǎng)液）、ZEA+Cur 6.25組（36.55 μg·mL-1ZEA+6.25 μmol·L-1Cur）、ZEA+Cur 12.5組（36.55 μg·mL-1ZEA+12.5 μmol·L-1Cur）、ZEA+Cur 25組（36.55 μg·mL-1ZEA +25 μmol·L-1Cur）。

1.6 活性氧檢測

細(xì)胞經(jīng)過相應(yīng)處理24 h。按照1﹕1 000用無血清培養(yǎng)液稀釋DCFH-DA。去除細(xì)胞培養(yǎng)液，加入DCFH- DA。37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20 min。用無血清培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞3次，在熒光顯微鏡下隨意選取6個(gè)視野觀察及拍照，通過Image J軟件分析熒光強(qiáng)度。

1.7 細(xì)胞內(nèi)抗氧化指標(biāo)檢測

細(xì)胞經(jīng)過相應(yīng)處理24 h后，收集細(xì)胞沉淀。用PBS清洗兩次，在細(xì)胞沉淀中加入一定量的PBS，混勻，于冰水混合物中手動(dòng)勻漿3 min，然后取破碎好的細(xì)胞懸浮液按照SOD、CAT和MDA測定試劑盒說明書進(jìn)行測定。用中國海門市碧云天的Bradford蛋白濃度測定試劑盒測定總蛋白濃度，所有樣品都測定三個(gè)重復(fù)。

1.8 qRT-PCR測定抗氧化相關(guān)基因表達(dá)量

用Eastep?Supper總RNA提取試劑盒，根據(jù)說明書從-70℃冰凍的細(xì)胞中提取總RNA。通過紫外分光光度計(jì)測定RNA濃度。根據(jù)PrimeScript? RT Master Mix（Perfect Real Time）（TaKaRa）說明書取500 ng總RNA反轉(zhuǎn)成cDNA。豬SIRT1、FOXO1、CAT、Mn-SOD的引物序列如表1所示，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，反應(yīng)體系見表2。熔解曲線階段通過Applied Biosystems QuantStudio? 5 Real- Time PCR System按照表3進(jìn)行。

表1 Real-time PCR引物序列

表2 Real-time PCR反應(yīng)體系

1.9 Western Blot測定抗氧化相關(guān)基因蛋白表達(dá)量

細(xì)胞經(jīng)過不同處理24 h，收集細(xì)胞沉淀，加PBS洗滌細(xì)胞，1 500 r/min離心10 min，棄上清，加入細(xì)胞裂解液在冰上裂解細(xì)胞30 min，再超聲破碎細(xì)胞30 s，12 000 r/min 4℃離心10 min，收集蛋白上清，通過BCA法測蛋白濃度，將提取的蛋白跑電泳，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶封閉2 h，分別加入-actin、SIRT1、FOXO1和Acetyl-FOXO1抗體（1﹕500稀釋）于4℃孵育過夜，TBST漂洗后加入二抗羊抗兔IgG-HRP孵育1 h，化學(xué)發(fā)光顯色檢測。

1.10 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 25.0進(jìn)行。對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，采用單因素方差分析，再用最小顯著性差異檢驗(yàn)。數(shù)據(jù)用平均值（Mean）±標(biāo)準(zhǔn)差（SD）表示，＜0.05為差異顯著，＜0.01為差異極顯著，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用Grapher 16.5軟件作圖。

表3 PCR反應(yīng)程序

每個(gè)樣本都做三個(gè)重復(fù)，以β-actin為內(nèi)參用2-ΔΔCt法計(jì)算mRNA相對水平

Three replicates were performed for each sample. And β-actin was used as an internal reference to calculate mRNA relative levels by 2-ΔΔCtmethod

2 結(jié)果

2.1 ZEA對PK-15細(xì)胞活力的影響

不同濃度的ZEA（0、10、20、30、40、50 μg·mL-1）分別與PK-15細(xì)胞共同孵育24 h，通過MTT法檢測ZEA對PK-15細(xì)胞活力的影響，結(jié)果如圖1所示。隨著濃度的增大，ZEA對PK-15細(xì)胞活力的抑制作用越來越強(qiáng)，30 和40 μg·mL-1ZEA的細(xì)胞活力抑制率分別為10.91%和64.39%。通過計(jì)算ZEA的IC50為36.55 μg·mL-1，因此選用36.55 μg·mL-1作為后續(xù)試驗(yàn)ZEA的濃度。

圖1 ZEA對PK-15細(xì)胞活力的抑制作用

2.2 Cur對PK-15細(xì)胞活力及形態(tài)的影響

為確定適宜的Cur使用濃度，通過MTT法測定Cur對PK-15的最大安全濃度。如圖2所示，Cur濃度在1.56、3.13、6.25、12.5、25、50 μmol·L-1時(shí)，細(xì)胞的存活率均在90%以上；然而在100 μmol·L-1時(shí)，細(xì)胞存活率僅為18.62%。在細(xì)胞形態(tài)學(xué)上，與對照組相比，1.56、3.13、6.25、12.5和25 μmol·L-1的Cur沒有改變PK-15的細(xì)胞形態(tài)（圖3），而50和100 μmol·L-1的Cur使細(xì)胞變圓，細(xì)胞間隙變大，甚至引起細(xì)胞死亡脫落（圖3黑色箭頭）。根據(jù)細(xì)胞活力和細(xì)胞形態(tài)觀察的結(jié)果，后續(xù)試驗(yàn)將選擇6.25、12.5、25 μmol·L-1作為Cur的使用濃度。

與對照組相比較，*表示差異顯著（P＜0.05），**表示差異極顯著（P＜0.01）

圖3 不同濃度Cur對PK-15細(xì)胞形態(tài)的影響（標(biāo)尺= 100 μm）

2.3 Cur減輕ZEA對PK-15的細(xì)胞毒性

在生長良好的PK-15細(xì)胞中加入ZEA（36.55 μg·mL-1）的同時(shí)，分別添加不同濃度的Cur（6.25、12.5、25 μmol·L-1）作用24 h后，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)與貼壁情況。跟對照組相比，ZEA組細(xì)胞界限模糊，細(xì)胞融合，細(xì)胞變圓有脫落現(xiàn)象（圖4黑色箭頭）。不同濃度Cur的加入，都能使細(xì)胞界限變得清晰，細(xì)胞形態(tài)變好，減少細(xì)胞變圓脫落現(xiàn)象（圖4紅色箭頭）。說明Cur能改善ZEA引起的PK-15細(xì)胞形態(tài)的變化。采用MTT法檢測各組的細(xì)胞存活率，結(jié)果如圖5所示。與對照組對比，ZEA組的細(xì)胞存活率極顯著降低（＜0.01）；與ZEA組相比，Cur 6.25組和Cur 12.5組細(xì)胞存活率顯著升高（＜0.05），Cur 25組極顯著升高（＜0.01）。以上結(jié)果表明，ZEA可降低PK-15細(xì)胞活力，Cur能有效降低ZEA對PK-15細(xì)胞的毒性作用。

圖4 不同濃度Cur對ZEA引起的PK-15細(xì)胞形態(tài)變化的影響（標(biāo)尺= 100 μm）

2.4 Cur降低ZEA誘導(dǎo)的ROS生成

DCFH-DA熒光探針能自由穿過細(xì)胞膜，被細(xì)胞內(nèi)ROS氧化為熒光DCF，熒光強(qiáng)度與細(xì)胞內(nèi)ROS水平成正比。用DCFH-DA標(biāo)記細(xì)胞，利用Image J計(jì)算和分析熒光強(qiáng)度。結(jié)果如圖6和圖7所示，ZEA組的熒光強(qiáng)度極顯著高于對照組（＜0.01），不同濃度的Cur組的熒光強(qiáng)度要極顯著（＜0.01）低于ZEA組。說明Cur能有效降低ZEA誘導(dǎo)的ROS產(chǎn)生。

2.5 Cur緩解ZEA誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激

將細(xì)胞進(jìn)行處理24 h后，收集細(xì)胞，通過試劑盒檢測細(xì)胞內(nèi)SOD、CAT和MDA水平。結(jié)果如圖8所示，與對照組相比，ZEA極顯著降低細(xì)胞的SOD和CAT活性（＜0.01）；ZEA組的MDA含量極顯著（＜0.01）上升；而相較于ZEA組，Cur組的SOD和CAT活性均極顯著（＜0.01）上升，Cur組的MDA含量均極顯著（＜0.01）下降。以上結(jié)果說明，ZEA誘導(dǎo)PK-15細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激，而Cur可緩解ZEA誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激。

與對照組相比較，*表示差異顯著（P＜0.05），**表示差異極顯著（P＜0.01）；與ZEA相比較，#表示差異顯著（P＜0.05），##表示差異極顯著（P＜0.01）。下同

圖6 Cur對ZEA誘導(dǎo)的PK-15細(xì)胞內(nèi)ROS的影響（標(biāo)尺 = 100 μm）

圖7 活性氧相對熒光強(qiáng)度

2.6 Cur對ZEA引起SIRT1/FOXO1信號(hào)通路相關(guān)基因的影響

通過qRT-PCR檢測細(xì)胞內(nèi)SIRT1、FOXO1、CAT、Mn-SOD mRNA表達(dá)量，結(jié)果如圖9所示，與對照組對比，ZEA組SIRT1 mRNA表達(dá)量降低，F(xiàn)OXO1 mRNA表達(dá)量極顯著（＜0.01）升高，Mn-SOD mRNA表達(dá)量稍有上升，CAT極顯著（＜0.01）降低。與ZEA組對比，Cur 6.25組顯著（＜0.05）升高SIRT1 mRNA表達(dá)量，Cur 12.5組和Cur 25組的SIRT1的mRNA表達(dá)量極顯著（＜0.01）的升高；Cur組FOXO1的mRNA表達(dá)量均極顯著（＜0.01）的降低；Cur組Mn-SOD的mRNA表達(dá)量極顯著（＜0.01）的升高；Cur 6.25組CAT的mRNA表達(dá)量顯著（＜0.05）升高，Cur 12.5組極顯著（＜0.01）升高，Cur 25組沒有顯著變化。

通過Western Blot檢測細(xì)胞內(nèi)SIRT1、FOXO1、Acetyl-FOXO1蛋白表達(dá)量，結(jié)果如圖10所示，與對照組對比，ZEA組的SIRT1蛋白表達(dá)顯著降低（＜0.05），Acetyl-FOXO1蛋白表達(dá)極顯著升高（＜0.01）；與ZEA組對比，Cur組SIRT1蛋白表達(dá)量均極顯著升高（＜0.01），Acetyl-FOXO1蛋白表達(dá)極顯著降低（＜0.01）。

3 討論

ZEA是一種常見的真菌毒素，廣泛存在于各種谷類作物中，并持續(xù)污染動(dòng)植物食品，嚴(yán)重危害人類和動(dòng)物健康。腎臟是機(jī)體重要的代謝器官，參與藥物和毒素的代謝，比其他器官更容易受到毒素的侵害。之前的研究表明ZEA的毒性與氧化應(yīng)激密切相關(guān)，具有抗氧化特性的化合物可有效地減輕這種真菌毒素的毒性作用[16-17]。因此，本研究旨在探討抗氧化劑姜黃素對ZEA造成的PK-15細(xì)胞損傷的保護(hù)作用。

A：SOD活性 B：CAT活性 C: MDA含量

A：SIRT1 mRNA表達(dá)；B：FOXO1 mRNA表達(dá)；C：Mn-SOD mRNA表達(dá)；D：CAT mRNA表達(dá)

A：SIRT1，Acetyl-FOXO1和FOXO1的蛋白條帶；B：SIRT1蛋白表達(dá)水平；C：Acetyl-FOXO1蛋白表達(dá)水平

3.1 ZEA對細(xì)胞的毒性作用

多項(xiàng)研究表明，在不同的細(xì)胞類型，不同的劑量的ZEA毒性作用機(jī)制不同。低濃度的ZEA及其衍生物能刺激細(xì)胞生長，在10-10—10-8mol·L-1濃度之間時(shí)，ZEA表現(xiàn)出明顯的促進(jìn)細(xì)胞增殖的活性[18]。ZEA能刺激T47D細(xì)胞生長，10-8mol·L-1組的細(xì)胞活力是對照組的2倍[19]。ZEA衍生物也能促進(jìn)細(xì)胞生長，α-玉米赤霉醇（α-ZAL）是ZEA的衍生物之一，能有效刺激BMS細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)成骨細(xì)胞分化，抑制破骨細(xì)胞形成[20]。α-玉米赤霉烯醇（α-ZEL），另一種ZEA衍生物，即使與對顆粒細(xì)胞生長有抑制作用的富馬菌素B1（FB1）一起使用，依然對顆粒細(xì)胞的增殖有很強(qiáng)的刺激作用[21]。高濃度的ZEA則抑制細(xì)胞活力，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。ZEA（15—60 mol·L-1）處理24 h后，睪丸支持細(xì)胞活力明顯下降[22]。ZEA（3—300 mol·L-1）呈劑量依賴性降低HEK293細(xì)胞活力，其IC50值為80 μmol·L-1[23]。本試驗(yàn)中ZEA劑量依賴性的降低PK-15細(xì)胞活力，IC50為36.55 μg·mL-1，再次證明高濃度ZEA對細(xì)胞具有毒性作用。

3.2 ZEA的細(xì)胞毒性作用與氧化應(yīng)激的關(guān)系

過往研究表明ZEA的細(xì)胞毒性與氧化應(yīng)激密切相關(guān)。活性氧（ROS）的過量產(chǎn)生或抗氧化酶活性的缺乏會(huì)打破細(xì)胞內(nèi)氧化還原的平衡導(dǎo)致氧化應(yīng)激。ROS是高活性分子，其中氧自由基可破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，增加生物膜的脂質(zhì)過氧化。本研究中ZEA作用于PK-15細(xì)胞，顯著增加了細(xì)胞內(nèi)ROS水平（圖6和7）。SOD和CAT是細(xì)胞內(nèi)重要的兩種抗氧化酶，SOD將超氧化物分解為氧和H2O2，CAT將H2O2轉(zhuǎn)化為水[24]。本試驗(yàn)中ZEA處理使SOD和CAT的活性分別下降了3倍和2倍（圖8-A和B）。MDA作為脂質(zhì)過氧化的最終產(chǎn)物，可引起細(xì)胞嚴(yán)重的膜結(jié)構(gòu)損傷，改變細(xì)胞膜的通透性，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡、壞死。因此，MDA含量的測定可以間接反映脂質(zhì)過氧化程度[25]。本研究發(fā)現(xiàn)ZEA處理24 h后，PK-15細(xì)胞內(nèi)的MDA水平升高了40倍（圖8-C）。由以上可知，ZEA通過增加活性氧水平和脂質(zhì)過氧化程度，降低過氧化物酶SOD和CAT的活性，對PK-15細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用。

3.3 姜黃素可緩解ZEA誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生的氧化應(yīng)激作用

Cur是一種天然抗氧化劑，許多研究表明Cur能提升機(jī)體的抗氧化水平，有效清除機(jī)體內(nèi)的活性氧（ROS）和活性氮（RNS）[26-29]，提高抗氧化酶的活性，降低細(xì)胞毒性產(chǎn)物MDA的含量，從而發(fā)揮抗氧化作用[30]。本研究中Cur顯著降低了ZEA誘導(dǎo)的ROS和MDA水平，提高了抗氧化酶SOD、CAT的活性，從而減輕了ZEA導(dǎo)致的PK-15細(xì)胞活力下降和細(xì)胞形態(tài)的改變。之前研究報(bào)道Cur可通過多條信號(hào)通路抑制氧化應(yīng)激，如KEAP1-NRF2-ARE信號(hào)通路、NF-κB信號(hào)通路等[27]。Sirtuin家族于2000年首次在哺乳動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)，研究發(fā)現(xiàn)其可調(diào)控原核及真核生物的重要代謝途徑，參與細(xì)胞衰老、增殖、凋亡、DNA修復(fù)、細(xì)胞代謝和氧化應(yīng)激等多種生物學(xué)過程[31]。SIRT1作為Sirtuin家族重要的一員，是一種去乙?；?，可使FOXO1發(fā)生去乙?；痆13]。而去乙?；腇OXO1會(huì)促進(jìn)其下游靶基因Mn-SOD、CAT等的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，但是長時(shí)間的去乙?；瘯?huì)導(dǎo)致FOXO1 mRNA表達(dá)水平下降[32]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Cur上調(diào)了SIRT1、Mn-SOD和CAT mRNA的表達(dá)和SIRT1的蛋白表達(dá)，下調(diào)了FOXO1 mRNA表達(dá)和Acetyl-FOXO1的蛋白表達(dá)，說明Cur激活了SIRT1/FOXO1信號(hào)通路。

綜上所述，本研究結(jié)果表明Cur可通過激活SIRT1/FOXO1信號(hào)通路，上調(diào)SIRT1的表達(dá)，促使FOXO1去乙?；险{(diào)抗氧化酶Mn-SOD和CAT的活性，從而清除ZEA誘導(dǎo)生成的ROS，降低了細(xì)胞脂質(zhì)過氧化水平，減輕了ZEA對PK-15細(xì)胞的毒性作用。

4 結(jié)論

Cur可有效緩解ZEA對PK-15細(xì)胞的氧化損傷作用，其保護(hù)機(jī)制是通過激活SIRT 1/FOXO 1抗氧化應(yīng)激通路上調(diào)SIRT1的表達(dá)，引起FOXO1去乙?；险{(diào)其下游抗氧化酶Mn-SOD和CAT的表達(dá)，清除ROS，降低MDA水平，從而減輕ZEA對PK-15細(xì)胞的毒性作用。

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Curcumin Alleviates Zearalenone-Induced Oxidative Damage in Porcine Renal Epithelial Cells via SIRT1/FOXO1 Pathway

CUI HongJie1, 2, LU ChunTing1, PAN LiQin1, HU Hui1, ZHONG PeiYun1, ZHU JieYing1, ZHANG KaiZhao1, 2, HUANG XiaoHong1, 2

1College of Animal Sciences, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002;2University Key Laboratory for Integrated Chinese Traditional and Western Veterinary Medicine and Animal Healthcare in Fujian Province/Fujian Key Laboratory of Traditional Chinese Veterinary Medicine and Animal Health, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002

【Objective】 The purpose of this study was to investigate the protective effect of curcumin (Cur) on zearalenone (ZEA)-induced oxidative damage in porcine renal epithelial cells (PK-15), and to elucidate the protective mechanism based on SIRT1/FOXO1 signaling pathway. 【Method】 The experiment was divided into 5 groups: control group, ZEA group (36.55 μg·mL-1ZEA), Cur6.25 group (36.55 μg·mL-1ZEA+6.25 μmol·L-1Cur), Cur12.5 group (36.55 μg·mL-1ZEA+12.5 μmol·L-1Cur), and Cur25 group (36.55 μg·mL-1ZEA +25 μmol·L-1Cur). MTT assay was used to determine the half inhibitory concentration of ZEA and the maximum safe concentration of Cur on PK-15 cells. The morphological changes were observed by inverted microscope. The levels of intracellular reactive oxygen species (ROS), superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), and malondialdehyde (MDA) were detected by the reagent kits. Real-time quantitative PCR was used to detect the mRNA levels of SIRT1, FOXO1, CAT and Mn-SOD. The expression levels of SIRT1, FOXO1 and Acetyl-FOXO1 proteins were detected by Western Blot. 【Result】 The IC50 of ZEA was 36.55 μg·mL-1, and the maximum safe concentration of Cur was 25 μmol·L-1. Compared with the control group, ZEA significantly decreased the cell viability of PK-15 cells (＜0.01), significantly increased the levels of ROS and MDA (＜0.01), and significantly decreased the activities of SOD and CAT (＜0.01). Compared with ZEA group, the different concentrations of Cur (6.25, 12.5, 25 μmol·L-1) significantly increased the cell viability of PK-15 cells (＜0.05) and improved the cell morphology. ROS and MDA levels induced by ZEA were also significantly reduced by Cur (＜0.01). Moreover, SOD and CAT activities in cells were significantly increased (＜0.01). qRT-PCR results showed that, compared with the control group, ZEA decreased SIRT1 mRNA expression, significantly increased FOXO1 mRNA expression (＜0.01), increased Mn-SOD mRNA expression, and significantly decreased CAT mRNA expression (＜0.01). Compared with ZEA group, mRNA expression levels of SIRT1 and CAT were increased in different degrees, FOXO1 mRNA expression levels were significantly decreased (＜0.01), and Mn-SOD mRNA expression levels were significantly increased (＜0.01) in all Cur groups. Western Blot results showed that ZEA significantly reduced SIRT1 protein expression (＜0.05), and significantly increased Acetyl-FOXO1 protein expression (＜0.01). Compared with ZEA group, SIRT1 protein expression was significantly increased (＜0.01), while Acetyl-FOXO1 protein expression was significantly decreased (＜0.01) in all Cur groups.【Conclusion】 Cur could up-regulate the expression of SIRT1, reduce the acetylation level of FOXO1, and induce the expression of antioxidant enzymes Mn-SOD and CAT, thereby eliminating ROS, reducing the level of MDA, and alleviating the oxidative damage of ZEA on PK-15 cells.

curcumin; zearalenone; oxidative stress; silencing information regulator 1 (SIRT1)

10.3864/j.issn.0578-1752.2023.05.015

2021-10-21；

2022-05-17

福建省科技廳重大專項(xiàng)（2021NZ029008）、福建省自然科學(xué)基金（2021J01080）、福建省中青年教師教育科研項(xiàng)目（JAT210066）、橫向課題項(xiàng)目（KH190363A）

崔紅杰，Tel：13696892917；E-mail：tsuisearcher@163.com。通信作者黃小紅，Tel：13774550003；E-mail：984158392@qq.com

（責(zé)任編輯 林鑒非）