線粒體鐵蛋白調(diào)控上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化對非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞順鉑耐藥的影響

趙峻秀霍明洋陳振宇白雪松馬洪波郗艷麗*

(1.吉林醫(yī)藥學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院,吉林 吉林 132013; 2.延邊大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,吉林 延邊 133002)

肺癌是全球致死率最高的惡性腫瘤,其中非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)大約能占肺癌總數(shù)的80%～85%[1-2]。多數(shù)肺癌患者確診時已處于臨床晚期,臨床上缺少療效顯著的治療藥物,生物靶向藥物的針對性強(qiáng),很多患者因基因配型不符而錯失最佳治療機(jī)會。此外,許多肺癌患者對臨床常用的化療或放射療法存在耐藥,導(dǎo)致肺癌患者的5年生存率較低,僅有4%～17%[3]。順鉑(cisplatin,DDP)是臨床上常用的抗腫瘤藥物,抗癌譜廣,與多種抗腫瘤藥物有協(xié)同作用、且無交差耐藥[4],但順鉑的單獨(dú)長期使用會造成患者耐藥[5]。研究發(fā)現(xiàn),肺癌患者的順鉑耐藥可能誘導(dǎo)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)過程,抑制肺癌細(xì)胞的EMT過程,可能會有效抑制肺癌細(xì)胞的耐藥與侵襲[6]。持續(xù)性鐵過載能促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞發(fā)生EMT過程[7]。在乳腺癌細(xì)胞中,通過抑制膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)可以促使細(xì)胞內(nèi)鐵濃度升高,進(jìn)而導(dǎo)致EMT發(fā)生[8]。由此推測,鐵過載可能與腫瘤細(xì)胞的耐藥及EMT過程有關(guān)。線粒體鐵蛋白(ferritin mitochondrial,FtMt)是一種定位在線粒體上、與鐵代謝密切相關(guān)的蛋白,具有組織受限性表達(dá)的特點(diǎn),由于其mRNA上缺乏鐵依賴的、能翻譯調(diào)控鐵反應(yīng)元件的共有序列,所以它的翻譯不受鐵反應(yīng)元件(iron resposive element,IRE)-鐵調(diào)節(jié)蛋白(iron regulatory protein,IRP)機(jī)制的調(diào)控,而該機(jī)制被認(rèn)為是調(diào)控細(xì)胞鐵穩(wěn)態(tài)的重要機(jī)制[9-10]。已證實(shí)FtMt參與了線粒體中的鐵調(diào)節(jié)并維持線粒體內(nèi)鐵穩(wěn)態(tài)[11],但目前關(guān)于FtMt在肺癌細(xì)胞耐受順鉑及EMT過程中的作用尚不清楚。為此,本研究通過比較順鉑耐藥細(xì)胞株A549/DDP與非耐藥細(xì)胞株A549之間FtMt表達(dá)水平、EMT過程及相關(guān)信號通路的差異,探索FtMt與順鉑耐藥和EMT之間的關(guān)系,為進(jìn)一步了解肺癌的發(fā)病機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞

人非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞株(中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物寶藏委員會細(xì)胞庫);人非小細(xì)胞肺癌順鉑耐藥細(xì)胞株A549/DDP(長春晶美生物工程有限公司)。

1.2 主要試劑與儀器

胎牛血清(以色列BI);RPMI-1640培養(yǎng)基(美國Hyclone);凋亡檢測試劑盒(南京諾唯贊生物科技有限公司);線粒體鐵蛋白一抗(Ferritin mitochondrial,FtMt)、E-鈣黏蛋白、N-鈣黏蛋白、βactin、HRP-Goat Anti-Rabbit IgG、HRP-Goat Anti-Mouse IgG(武漢三鷹生物技術(shù)有限公司);cDNA合成試劑盒(北京康潤誠業(yè)生物科技有限公司);BeyoFastTMSYBR Green qPCR Mix和線粒體提取試劑盒(碧云天生物技術(shù));順鉑(cisplatin,DDP)(美國sigma);引物(生物工程上海股份有限公司)。

NBS Galaxy 170S二氧化碳培養(yǎng)箱(德國,Eppendorf);Epoch 多功能酶標(biāo)儀(美國BioTek);C6流式細(xì)胞儀(美國BD);7500 FastPCR儀(美國ABI);Mastercycler nexus gradient梯度PCR儀(德國Eppendorf);IX73活細(xì)胞工作站(日本奧林巴斯);Mini-Protean電泳槽、Mini Trans-Blot轉(zhuǎn)印槽和Gel Doc XR凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞凋亡檢測

A549細(xì)胞以2×105個/孔接種于6孔板,在含有10%胎牛血清、1%青霉素和鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)液(完全培養(yǎng)液)中,37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。A549/DDP細(xì)胞培養(yǎng)于富含10%胎牛血清、1%青霉素和鏈霉素、2 μg/mL DDP的RPMI-1640培養(yǎng)液(完全培養(yǎng)液)中,37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。按如下分組給予受試物處理:對照組加入2 mL的不完全培養(yǎng)液(不含血清,其余同完全培養(yǎng)液),給藥組分別加入相同體積的1.0、2.5和5.0 μg/mL的順鉑溶液(不含血清,其余同完全培養(yǎng)液)。37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,消化并收集細(xì)胞,離心去上清,向沉淀中加入預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞1次,加入195 μL Annexin V-FITC結(jié)合液重懸細(xì)胞。加入5 μL Annexin V-FITC和10 μL的PI染色液,混勻,室溫避光孵育20 min,立即上機(jī)檢測。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.2 細(xì)胞周期檢測

細(xì)胞處理同1.3.1。處理終點(diǎn)后,用1×PBS洗3次,消化并收集細(xì)胞,1000 r/min離心3 min,棄上清,向沉淀中加入70%冷乙醇,4℃固定過夜,PBS洗滌,RNaseA 在37℃孵育30 min。1000 r/min離心3min,棄上清,加入0.5 mL、10 μg/mL的PI溶液,室溫避光反應(yīng)30 min。PBS洗去未結(jié)合染色液,立即上機(jī)檢測。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。Modfit軟件分析結(jié)果。

1.3.3 蛋白表達(dá)檢測

A549和A549/DDP細(xì)胞接種于6孔板,37℃、5% CO2培養(yǎng)24 h后,用1×PBS洗3次,每孔加入100 μL細(xì)胞裂解液,冰浴10 min,待細(xì)胞裂解完全,移入1.5 mL EP管中,100℃變性15 min,3000 r/min離心5 min后,取上清進(jìn)行Western blot檢測Ecadherin和N-cadherin的表達(dá)水平。按照線粒體提取試劑盒說明書步驟,提取線粒體,檢測FtMt蛋白表達(dá)水平。通過Image Lab 軟件對蛋白印跡進(jìn)行分析,以β-actin為內(nèi)參計(jì)算蛋白的相對含量。

1.3.4 mRNA表達(dá)水平檢測

細(xì)胞處理同1.3.1。處理終點(diǎn)后,胰蛋白酶消化收集細(xì)胞,1000 r/min離心5 min,去上清留沉淀,加入1 mL TRIzol,冰浴15 min以充分裂解,加入0.2mL氯仿并劇烈搖蕩15 s,12 000 r/min離心15min,留取上清,加入0.5 mL異丙醇,靜置10 min,12 000 r/min離心10 min,棄上清后加入1 mL、75%預(yù)冷乙醇,7500 r/min離心5 min后棄上清,37℃干燥后,加入20 μL DEPC水融解。用提取的RNA作為模板,按照試劑盒說明書的步驟合成cDNA,并進(jìn)行Real-time PCR檢測。以GAPDH為內(nèi)參,反應(yīng)條件為:95℃ 2 min,95℃ 15 s,60℃ 15 s,共進(jìn)行35個循環(huán)。擴(kuò)增后采用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對表達(dá)量。引物序列參照PrimerBank,見表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.3.5 細(xì)胞遷移檢測

細(xì)胞以2×105個/皿接種30 mm培養(yǎng)皿,待細(xì)胞貼壁后,用20 μL槍頭在培養(yǎng)皿底部畫一條直線,制備出細(xì)胞劃痕區(qū)域。加入不完全培養(yǎng)液洗凈劃痕區(qū)域殘留的細(xì)胞脆片,分別加入2 mL不同濃度的順鉑溶液,置于活細(xì)胞工作站,觀察細(xì)胞遷移情況。觀察時間為24 h。每個實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次,利用Image J 軟件統(tǒng)計(jì)分析劃痕區(qū)域的寬度。寬度=24 h劃痕區(qū)域的寬度/0 h劃痕區(qū)域的寬度。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

SPSS 16.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,所有數(shù)據(jù)均用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,各組間均數(shù)比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA),組間兩兩比較采用最小顯著差法(LSD)檢驗(yàn),檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05,P＜0.05表示差異有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞凋亡的比較

結(jié)果顯示,隨著順鉑給藥劑量的增加,細(xì)胞凋亡率和壞死率逐漸增多。5.0 μg/mL順鉑組A549細(xì)胞早期凋亡、晚期凋亡和壞死率均顯著高于0、1.0和2.5 μg/mL順鉑組(P＜0.05)。1.0和2.5 μg/mL順鉑組A549細(xì)胞早期凋亡、晚期凋亡和壞死率雖高于0 μg/mL順鉑組,但比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。1.0、2.5和5.0 μg/mL順鉑組A549細(xì)胞之間早期凋亡、晚期凋亡和壞死率比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。1.0、2.5和5.0 μg/mL順鉑組A549/DDP早期凋亡率顯著高于0 μg/mL順鉑組(P＜0.05)。5.0 μg/mL順鉑組A549/DDP早期凋亡率顯著高于1.0和2.5μg/mL順鉑組(P＜0.05)。5.0 μg/mL順鉑組A549/DDP細(xì)胞晚期凋亡率顯著高于0 μg/mL順鉑組(P＜0.05)。與A549細(xì)胞5.0 μg/mL順鉑組比較,A549/DDP細(xì)胞的早期凋亡率、晚期凋亡率和壞死率顯著降低(P＜0.05)。與A549細(xì)胞1.0 和2.5 μg/mL順鉑組比較,A549/DDP細(xì)胞的壞死率顯著降低(P＜0.05)。見表2和圖1。

圖1 不同濃度順鉑處理下A549和A549/DDP細(xì)胞凋亡率及壞死率的流式圖Figure 1 Flow cytometry of apoptosis rate and necrosis rate of A549 and A549/DDP cells under different concentrations of cisplatin

表2 A549和A549/DDP細(xì)胞凋亡率及壞死率的比較(%)Table 2 Comparison of apoptosis rate and necrosis rate between A549 and A549/DDP cells

2.2 細(xì)胞周期的比較

與0 μg/mL順鉑組比較,5.0 μg/mL順鉑組A549細(xì)胞G0/G1期顯著降低(P＜0.05);2.5和5.0 μg/mL順鉑組A549細(xì)胞S期顯著升高(P＜0.05)。5.0 μg/mL順鉑組A549細(xì)胞G2/M期顯著低于0、1.0和2.5 μg/mL順鉑組(P＜0.05)。各劑量組A549細(xì)胞凋亡率之間比較有顯著差異(P＜0.05)。1.0和2.5 μg/mL順鉑組A549/DDP細(xì)胞G2/M期顯著高于0 μg/mL順鉑組;5.0 μg/mL順鉑組A549/DDP細(xì)胞G2/M期顯著低于0、1.0和2.5μg/mL順鉑組。5.0 μg/mL順鉑組A549/DDP細(xì)胞凋亡率顯著高于0、1.0和2.5μg/mL順鉑組(P＜0.05)。2.5和5.0 μg/mL順鉑組A549/DDP細(xì)胞G0/G1期顯著高于A549細(xì)胞(P＜0.05)。0 μg/mL順鉑組A549/DDP細(xì)胞S期顯著高于A549細(xì)胞(P＜0.05),G2/M期顯著低于A549細(xì)胞(P＜0.05)。5.0 μg/mL順鉑組A549/DDP細(xì)胞S期顯著低于A549細(xì)胞(P＜0.05)。1.0、2.5和5.0 μg/mL順鉑組A549/DDP細(xì)胞凋亡率顯著低于A549細(xì)胞(P＜0.05)。見表3和圖2。

圖2 不同濃度順鉑處理下A549和A549/DDP細(xì)胞周期的流式圖譜Figure 2 Flow cytometry of A549 and A549/DDP cell cycles under different concentrations of cisplatin

表3 A549和A549/DDP細(xì)胞周期的比較(%)Table 3 Comparison of cell cycle between A549 and A549/DDP

2.3 E-cadherin和N-cadherin表達(dá)水平的比較

由結(jié)果可知,與A549細(xì)胞比較,A549/DDP細(xì)胞中E-cadherin表達(dá)水平雖降低,但比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.919,P＞0.05);A549/DDP細(xì)胞中N-cadherin表達(dá)水平顯著升高,比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.162,P＜0.05)。見圖3。

圖3 A549和A549/DDP細(xì)胞E-cadherin和N-cadherin的表達(dá)水平Figure 3 Expression levels of E-cadherin and N-cadherin in A549 and A549/DDP cells

2.4 EMT信號通路的比較

結(jié)果顯示,與A549細(xì)胞比較,A549/DDP細(xì)胞中E-cadherin mRNA水平降低,但比較差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.570,P＞0.05);A549/DDP細(xì)胞中N-cadherin、snail、slug和vimentin的mRNA水平顯著升高(t=8.469,t=8.768,t=5.793,t=7.118,P＜0.05);Twist的mRNA水平雖然顯著升高,但比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.819,P＞0.05)。見圖4。

圖4 A549和A549/DDP細(xì)胞EMT信號通路的比較Figure 4 Comparison of EMT signaling pathways in A549 and A549/DDP cells

2.5 細(xì)胞遷移的比較

由結(jié)果可知,與A549細(xì)胞比較,A549/DDP細(xì)胞傷口劃痕區(qū)域面積顯著升高(t=6.745,P＜0.05),表明A549/DDP細(xì)胞遷移的速度顯著快于A549細(xì)胞。見圖5。

圖5 A549和A549/DDP細(xì)胞遷移的比較Figure 5 Comparison of A549 and A549/DDP cell migration

2.6 FPn、DMT1、hepcidin和TfR1的mRNA水平比較

由圖6可知,與A549細(xì)胞比較,A549/DDP細(xì)胞中DMT1 mRNA水平雖降低,但比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.112,P＞0.05)。FPn、hepcidin和TfR1 mRNA水平顯著升高,且比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=5.385,t=2.893,t=5.611,P＜0.05)。

圖6 A549和A549/DDP細(xì)胞中FPn、DMT1、鐵調(diào)素和TfR1的mRNA水平Figure 6 mRNA levels of FPn, DMT1, hepcidin and TfR1 in A549 and A549/DDP cells

2.7 FtMt表達(dá)水平的比較

由結(jié)果可知,與A549細(xì)胞比較,A549/DDP細(xì)胞中FtMt蛋白表達(dá)水平顯著升高(t=2.804,P＜0.05)。見圖7。

圖7 A549和A549/DDP細(xì)胞中FtMt的表達(dá)水平Figure 7 Expression level of FtMt in A549 and A549/DDP cells

3 討論

NSCLC是常見的惡性腫瘤之一,臨床對于NSCLC的治療往往采用以鉑類為基礎(chǔ)的化學(xué)聯(lián)合治療,部分患者治療2～3年后對鉑類會產(chǎn)生繼發(fā)性耐藥[12]。耐藥細(xì)胞具有更強(qiáng)的侵襲轉(zhuǎn)移特性,晚期NSCLC患者常死于鉑類耐藥后的廣泛轉(zhuǎn)移,尋找NSCLC鉑類化療耐藥機(jī)制一直是醫(yī)學(xué)界研究的熱點(diǎn)[13]。構(gòu)建鉑類耐藥的肺癌細(xì)胞系將有利于探尋其耐藥機(jī)制。在本研究中,購買了一株肺癌順鉑耐藥細(xì)胞株A549/DDP,在深入探討肺癌耐藥機(jī)制之前,首先驗(yàn)證了購買的A549/DDP細(xì)胞的順鉑耐藥性。通過研究發(fā)現(xiàn),A549/DDP細(xì)胞與A549細(xì)胞經(jīng)順鉑處理后,A549/DDP細(xì)胞的存活率顯著高于A549細(xì)胞,凋亡率和壞死率顯著低于A549細(xì)胞。這表明A549/DDP細(xì)胞是順鉑耐藥細(xì)胞系。

研究證實(shí),順鉑可通過與腫瘤細(xì)胞DNA結(jié)合形成交叉鍵,從而抑制其復(fù)制[14]。當(dāng)DNA受損后,細(xì)胞停滯在G0/G1期,此時細(xì)胞發(fā)生修復(fù),容易使化療藥物無效[15]。若細(xì)胞周期大量停滯在G2/M期,細(xì)胞周期調(diào)控系統(tǒng)會發(fā)生失衡,可誘發(fā)腫瘤細(xì)胞失控性生長[16]。本研究結(jié)果顯示,1.0～5.0 μg/mL順鉑處理后,A549細(xì)胞的細(xì)胞周期主要停留在G0/G1期和G2/M期,隨著順鉑給藥劑量的增加,A549細(xì)胞停留在G0/G1期和G2/M期的細(xì)胞數(shù)量逐漸降低,即在1.0～5.0 μg/mL范圍內(nèi),A549細(xì)胞未發(fā)生順鉑耐藥,細(xì)胞凋亡率隨著順鉑給藥劑量增加而增加。順鉑可以更好地與肺癌細(xì)胞DNA穩(wěn)定結(jié)合,抑制肺癌細(xì)胞的自我修復(fù),從而誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞A549發(fā)生凋亡。1.0～5.0 μg/mL順鉑處理后,隨著順鉑給藥濃度的增加,進(jìn)入G0/G1期和G2/M期的A549/DDP細(xì)胞數(shù)量先升高后降低。在順鉑低劑量給藥條件下(1.0～2.5 μg/mL),其誘導(dǎo)的A549/DDP細(xì)胞凋亡率升高的不十分顯著,此時A549/DDP細(xì)胞發(fā)生了順鉑耐藥;當(dāng)順鉑給藥劑量增加到5.0 μg/mL時,其誘導(dǎo)的A549/DDP細(xì)胞凋亡率顯著升高,此時A549/DDP細(xì)胞的耐藥性因順鉑給藥劑量的增加而得到緩解。但在臨床治療中,順鉑給藥劑量的增加,可能會導(dǎo)致出現(xiàn)肝腎組織毒性,引起嚴(yán)重的副作用。因而在臨床治療中,順鉑給藥劑量不能隨意增加,順鉑的耐藥性亦不能得到有效的控制。

EMT是指在特定生理病理?xiàng)l件下,具有極性的上皮細(xì)胞失去極性,向間質(zhì)細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化,使其具有運(yùn)動能力且能在細(xì)胞基質(zhì)間自由運(yùn)動,具有間質(zhì)表型的細(xì)胞對化學(xué)藥物的敏感性降低,但向周圍組織及遠(yuǎn)端器官侵襲、遷移的能力增強(qiáng)[17]。E-cadherin的減少和N-cadherin的升高是EMT發(fā)生的重要標(biāo)志,此時細(xì)胞間的粘附能力下降,運(yùn)動能力和粘附能力增強(qiáng)[18]。波形蛋白(vimentin)是細(xì)胞間質(zhì)表型的重要標(biāo)志,能使細(xì)胞的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,增加細(xì)胞的遷移與侵襲能力[19]。機(jī)體內(nèi)參與調(diào)控EMT過程的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子包括鋅指蛋白、snail、slug、twist等,其中snail、slug和twist的研究最為多見[20]。Snail、slug、ZEB1、E12/E47和SIP1均是轉(zhuǎn)錄抑制因子snail超家族的成員,該家族成員的結(jié)構(gòu)非常相似,C-末端含有鋅指DNA結(jié)合區(qū)域,N-末端含有SNAG結(jié)構(gòu)域[21]。Snail、slug與EMT的進(jìn)展有關(guān)[22]。下調(diào)snail和slug水平,可以逆轉(zhuǎn)EMT過程[23]。Twist與惡性腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān),在NSCLC肺癌組織中高表達(dá)。減少twist的表達(dá)可通過抑制N-鈣黏蛋白表達(dá)抑制癌細(xì)胞侵襲[24]。Twist作為堿性螺旋-環(huán)-螺旋轉(zhuǎn)錄因子的家族成員,是多種腫瘤的不良預(yù)后因子[25]。大量研究表明,EMT過程與肺癌的獲得性耐藥有關(guān),抑制肺癌細(xì)胞的EMT過程,可能會有效抑制肺癌細(xì)胞的耐藥與侵襲[26]。本研究結(jié)果顯示,A549/DDP細(xì)胞遷移速度顯著快于A549細(xì)胞,且A549/DDP細(xì)胞中的E-cadherin表達(dá)水平和mRNA水平低于A549細(xì)胞,N-cadherin和vimentin蛋白的表達(dá)水平和mRNA水平顯著高于A549細(xì)胞,參與EMT過程的snail、slug和twist的mRNA水平高于A549細(xì)胞。這一結(jié)果表明,A549/DDP細(xì)胞不僅存在順鉑耐藥,還具備較高的細(xì)胞侵襲和遷移能力,即肺癌細(xì)胞的順鉑耐藥與EMT過程有關(guān),肺癌細(xì)胞發(fā)生順鉑耐藥,預(yù)示著其可能會同時發(fā)生遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移。

FtMt是一種由染色體5q23.1上無內(nèi)含子基因編碼的線粒體定位的鐵存儲蛋白,具有與鐵蛋白重鏈同源結(jié)構(gòu),該結(jié)構(gòu)有助于在FtMt的殼結(jié)構(gòu)中儲存鐵[11,27-28]。FtMt主要在高耗氧量和高代謝活性的細(xì)胞中表達(dá),如精母細(xì)胞、神經(jīng)元和心肌細(xì)胞。FtMt會隨著線粒體中鐵的增加而增加,但在肝和脾中的FtMt表達(dá)相對較低,而這兩個部位的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)儲存了大量的鐵。FtMt的水平似乎與線粒體豐度的相關(guān)性大于鐵代謝的相關(guān)性[29]。FtMt作為鐵庫,儲存鐵的能力大于細(xì)胞質(zhì)鐵蛋白[30-31]。FtMt增加時會促進(jìn)鐵從胞質(zhì)向線粒體重新分布,加入鐵螯合劑后,這種作用會增強(qiáng)。FtMt對鐵的強(qiáng)烈儲存作用解釋了為什么大多數(shù)細(xì)胞一直保持低水平的FtMt[31]。目前關(guān)于FtMt在肺癌細(xì)胞中的表達(dá)情況研究較少,本課題組之前研究發(fā)現(xiàn),在肺癌細(xì)胞A549中檢測到了FtMt mRNA的表達(dá),通過給予順鉑后,線粒體中FtMt mRNA水平下調(diào)[32]。這提示FtMt在肺癌細(xì)胞中可能有重要作用,但具體機(jī)制尚不十分清楚。本研究發(fā)現(xiàn),A549/DDP細(xì)胞中的FtMt蛋白表達(dá)水平顯著高于A549細(xì)胞,這提示在肺癌細(xì)胞耐受順鉑的過程中,存在著FtMt蛋白表達(dá)水平的變化,FtMt在肺癌細(xì)胞耐受順鉑過程中可能發(fā)揮了重要作用,但具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(ferroportin,FPn)、二價金屬離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1(divalent metal transporter 1,DMT1)和轉(zhuǎn)鐵蛋白受體1(transferrin receptor1,TfR1)均是細(xì)胞中負(fù)責(zé)參與鐵運(yùn)輸?shù)闹匾盘栆蜃?。其?FPn是目前唯一已知的鐵輸出蛋白,而鐵調(diào)素是一種鐵穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)激素,可以與FPn結(jié)合,以防止鐵外流[33-34]。在本研究中,A549/DDP細(xì)胞中DMT1和FPn mNRA水平顯著高于A549細(xì)胞,這提示A549/DDP細(xì)胞中的鐵代謝比A549細(xì)胞活躍。

組織可以通過TfR1從血液中吸收轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合鐵,DMT1可介導(dǎo)內(nèi)吞小泡上轉(zhuǎn)鐵蛋白-TfR1復(fù)合物上的鐵進(jìn)入細(xì)胞漿[35]。當(dāng)鐵負(fù)荷時TfR1和DMT1表達(dá)會下調(diào)[36]。在本研究中,A549/DDP細(xì)胞中DMT1 mRNA水平雖低于A549細(xì)胞,但比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這提示DMT1可能不是造成A549/DDP與A549細(xì)胞中鐵代謝差異的主要基因。而A549/DDP細(xì)胞中TfR1 mRNA水平顯著高于A549細(xì)胞,提示TfR1參與了肺癌順鉑耐藥細(xì)胞的鐵代謝,TfR1的高表達(dá)可能是肺癌順鉑耐藥細(xì)胞中鐵代謝紊亂的重要機(jī)制之一。此外,Nie等[31]研究發(fā)現(xiàn),細(xì)胞轉(zhuǎn)染FtMt以后,細(xì)胞中的TfR1的表達(dá)水平會升高,這一結(jié)論與我們的結(jié)果相似。

綜上所述,肺癌細(xì)胞的順鉑耐藥與EMT過程有關(guān),肺癌細(xì)胞發(fā)生順鉑耐藥的同時可能也發(fā)生了侵襲和轉(zhuǎn)移。肺癌細(xì)胞順鉑耐藥過程中,存在著FtMt蛋白表達(dá)水平的變化,提示FtMt在肺癌細(xì)胞耐受順鉑過程中可能發(fā)揮了重要作用。鐵代謝紊亂可能與肺癌細(xì)胞順鉑耐藥有關(guān)。但具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。下一步會通過構(gòu)建過表達(dá)載體或敲除載體進(jìn)一步評價FtMt在EMT和順鉑耐藥過程中的作用,為非小細(xì)胞肺癌發(fā)病機(jī)制的探討提供更多的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。