外泌體在肺腺癌早期診斷和治療中的應(yīng)用進(jìn)展

張永凱，李豪源，史文松

(1.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院三全學(xué)院 臨床醫(yī)學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003；2.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院 胸外科，河南 鄭州 450052；3.河南中醫(yī)藥大學(xué)第五臨床醫(yī)學(xué)院/河南中醫(yī)藥大學(xué)人民醫(yī)院/鄭州人民醫(yī)院 胸外科，河南 鄭州 450053)

近年來(lái)，由于環(huán)境污染加重等因素導(dǎo)致肺癌發(fā)病率不斷上升，已占據(jù)癌癥發(fā)病率的首位[1]，其從病理類(lèi)型分為小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞肺癌(non small cell lung cancer，NSCLC)，而肺腺癌為NSCLC的一種，目前是發(fā)病率最高的類(lèi)型[2]。由于肺腺癌多屬外周型肺癌，早期無(wú)特異臨床表現(xiàn)，多數(shù)患者在有明顯臨床癥狀后才到醫(yī)院就診，確診時(shí)大多已經(jīng)處于肺腺癌中晚期，這也是其生存率較低的原因。只有早期發(fā)現(xiàn)、診斷并對(duì)早期肺腺癌進(jìn)行治療才有希望提高肺腺癌患者的生存率。低劑量計(jì)算機(jī)斷層掃描應(yīng)用于肺癌早期篩查降低了肺腺癌的病死率，但其具有滯后性的缺點(diǎn)[3]。組織活檢雖能夠用作肺腺癌的確診指標(biāo)，但其不能反映腫瘤整體情況且為有創(chuàng)檢查導(dǎo)致患者依從性差和應(yīng)用有限，因此亟待尋找一種新的檢測(cè)手段[4]。液體活檢是一種無(wú)創(chuàng)檢查，具有易獲取、無(wú)創(chuàng)傷、依從性好和能早期反映腫瘤的整體狀況等優(yōu)勢(shì)。隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)液體活檢在腫瘤早期診斷方面有著較大的潛能，外泌體是液體活檢中的一種，因其獨(dú)特優(yōu)勢(shì)而逐漸受到關(guān)注[5]。

外泌體通過(guò)參與細(xì)胞間的信息傳遞和控制信號(hào)通路基因的表達(dá)來(lái)調(diào)控肺腺癌的發(fā)生發(fā)展、轉(zhuǎn)移，對(duì)肺腺癌的發(fā)生發(fā)展有著重要作用。在肺腺癌的發(fā)病早期，機(jī)體的外泌體表達(dá)水平會(huì)發(fā)生一定程度的改變且其在綜合治療中也會(huì)隨著腫瘤負(fù)荷有所改變，因此在肺腺癌的早期診斷和療效評(píng)價(jià)中具有很重要的應(yīng)用價(jià)值。本文就此做出綜述，期望相關(guān)學(xué)者對(duì)此有所認(rèn)識(shí)。

1 外泌體概述

外泌體是由質(zhì)膜和內(nèi)體膜出芽而產(chǎn)生的直徑在30～100 nm的盤(pán)狀細(xì)胞外囊泡，廣泛分布于血液、唾液等體液中，體內(nèi)多種細(xì)胞包括癌細(xì)胞在內(nèi)皆可產(chǎn)生外泌體[6]。外泌體內(nèi)包含多種多樣的信號(hào)分子，如核酸、蛋白質(zhì)、脂類(lèi)、氨基酸，上述物質(zhì)可來(lái)源于不同的細(xì)胞，且具有特異性[7]。外泌體核酸又包括DNA、mRNA、miRNA、lncRNA等分子[8]。已經(jīng)明確的是，外泌體通過(guò)這些信號(hào)分子的傳遞來(lái)調(diào)控其他細(xì)胞，在一些生理及病理活動(dòng)中發(fā)揮著非常重要的作用，如生長(zhǎng)發(fā)育、免疫功能、腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移等[9]。

2 外泌體與腫瘤

外泌體可使正常細(xì)胞發(fā)生惡變并促使腫瘤細(xì)胞增殖、免疫逃逸、遷移等環(huán)節(jié)[10-13]。李丹等[14]在結(jié)直腸癌患者血清中發(fā)現(xiàn)外泌體circRASGRF2水平升高，接著通過(guò)受試者工作特征(receiver operator characteristic，ROC)曲線分析發(fā)現(xiàn)外泌體circRASGRF2在結(jié)直腸癌診治和預(yù)后評(píng)估方面有著巨大的潛在價(jià)值。將腦膠質(zhì)瘤術(shù)后患者與腦外傷患者進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)前者腦脊液中外泌體miR-21水平高于后者，并與患者總生存時(shí)間的中位值呈負(fù)相關(guān)，可以作為腦膠質(zhì)瘤術(shù)后療效評(píng)價(jià)和復(fù)發(fā)的指標(biāo)[15]。由此可見(jiàn)，外泌體在不同腫瘤的發(fā)生發(fā)展、治療、療效評(píng)價(jià)中均扮演著重要的角色。

3 外泌體在肺腺癌早期診斷中的作用

近年來(lái)，隨著人們對(duì)肺部體檢的重視以及CT用于肺癌篩查，肺結(jié)節(jié)檢出率增高[16]，但肺結(jié)節(jié)良惡性鑒別是臨床難點(diǎn)，腫瘤性肺結(jié)節(jié)大多是早期肺腺癌，治療效果遠(yuǎn)好于中晚期，因此在肺結(jié)節(jié)中鑒別出早期肺癌是至關(guān)重要的，目前臨床多根據(jù)影像學(xué)特征進(jìn)行鑒別，誤診誤治和過(guò)度診治共存。單純依據(jù)影像學(xué)鑒別有一定程度誤差，與體液檢測(cè)結(jié)合或可使其鑒別能力有進(jìn)一步提升，從而降低臨床誤診率。

體液外泌體中含有多種類(lèi)型的信號(hào)分子，其用于肺腺癌早期診斷時(shí)不僅可以從多種信號(hào)分子維度進(jìn)行檢測(cè)，還是一種非侵入式的診斷方法[17]。Zhu等[18]采用熒光共振能量轉(zhuǎn)移的方法從體液中的獲取外泌體，為外泌體用于腫瘤的診斷奠定了基礎(chǔ)。另外將外泌體中的信號(hào)分子進(jìn)行聯(lián)合檢測(cè)可能成為一種新的方式。

3.1 外泌體核酸

3.1.1外泌體miRNA 如何有效獲取體內(nèi)外泌體中的miRNA是開(kāi)展外泌體診斷的前提。通過(guò)基于小扁豆凝集素磁珠的聚焦捕獲策略，可以從血清中分離聚焦的外泌體，并且通過(guò)進(jìn)一步研究，其內(nèi)的miRNA在進(jìn)行肺腺癌早期診斷時(shí)表現(xiàn)優(yōu)越[19]。蘇曉桉[20]通過(guò)對(duì)比分析1期肺腺癌患者與健康患者血漿外泌體中miR-17-5p、miR-100-3p、miR-30a-3p的水平發(fā)現(xiàn)肺腺癌觀察組的miR-17-5p表達(dá)相對(duì)高，而miR-100-3p表達(dá)相對(duì)低，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，進(jìn)一步建立ROC曲線結(jié)果表明miR-17-5p、miR-100-3p用于診斷早期肺腺癌篩查的曲線下面積(area under the curve，AUC)值分別為0.870、0.777，而將miR-17-5p與miR-100-3p聯(lián)合進(jìn)行診斷的AUC值可達(dá)0.905，優(yōu)于單一外泌體診斷，可能作為早期肺腺癌診斷標(biāo)志物。陶瑞[21]發(fā)現(xiàn)，血漿外泌體來(lái)源的miR-125b-5p、miR-1-3p、miR-218-5p、miR-99a-5p及miR-9-5p在鑒別孤立性肺結(jié)節(jié)的良惡性上表現(xiàn)優(yōu)越，并且當(dāng)miR-1-3p與miR-99a-5p聯(lián)合診斷時(shí)的靈敏度和特異度均可達(dá)到100%，可以輔助影像學(xué)檢查，進(jìn)一步提升良惡性鑒別能力。肺腺癌與肺肉芽腫的影像學(xué)特征有相似之處，如果能有效地鑒別能大大降低臨床誤診率，研究通過(guò)對(duì)比肺腺癌與肺肉芽腫患者血清外泌體發(fā)現(xiàn)，miR-139-5p、miR-30a-3p、miR-378a、miR-502-5p、miR-17、miR-100、miR-151a-5p表達(dá)在肺腺癌患者中高于肺肉芽腫患者，但仍需更多的樣本進(jìn)行驗(yàn)證[22]。因此，外泌體miRNA在早期肺腺癌的診斷方面有著獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)和巨大的潛在價(jià)值。

3.1.2外泌體circRNA circRNA是具有高度穩(wěn)定性和特異性的RNA，因此在腫瘤預(yù)測(cè)及治療靶點(diǎn)擁有較大的潛在價(jià)值[23]。Chen等[24]首次通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)發(fā)現(xiàn)肺腺癌患者血漿外泌體中circRNA表達(dá)存在差異性，且有潛在的circRNA-miRNA-mRNA相互影響。臨床常用腫瘤標(biāo)志物如癌胚抗原(carcino embryonic antigen，CEA)升高可見(jiàn)于肺腺癌，但其用于早期肺腺癌鑒別時(shí)敏感度和特異度均較低。Zhou等[25]發(fā)現(xiàn)外泌體circRAPGEF5在肺腺癌患者血清中表達(dá)較高，并且通過(guò)miR-1236-3p/ZEB1軸參與了肺腺癌的增殖和轉(zhuǎn)移，進(jìn)一步研究表明將外泌體circRAPGEF5與CEA聯(lián)合進(jìn)行檢測(cè)診斷肺腺癌要優(yōu)于單獨(dú)CEA檢測(cè)。Wang等[26]研究發(fā)現(xiàn)，circRNA-002178不但可在肺腺癌患者血漿外泌體中檢測(cè)到，并且在癌組織中的表達(dá)遠(yuǎn)高于癌旁組織，可能作為肺腺癌早期診斷的生物標(biāo)志物。因此，深入外泌體circRNA的差異表達(dá)機(jī)制，有利于在早期肺腺癌診斷中應(yīng)用。

3.1.3外泌體lncRNA lncRNA可調(diào)控肺腺癌的發(fā)生發(fā)展。Shen等[27]利用磁珠來(lái)分離血清中上皮細(xì)胞黏附分子陽(yáng)性的外泌體，發(fā)現(xiàn)外泌體lncRNA RP11-77G23.5不但在肺癌體內(nèi)高表達(dá)，促進(jìn)肺癌的發(fā)展，而且上皮細(xì)胞黏附分子特異性外泌體RP11-77G23.5還能區(qū)分肺腺癌和肺鱗癌亞型。目前對(duì)于lncRNA的研究還較少，需要更加深入的研究。

3.2 外泌體蛋白質(zhì)外泌體中含有較為豐富的來(lái)自親代細(xì)胞的蛋白質(zhì)，對(duì)外泌體蛋白質(zhì)的檢測(cè)是極具價(jià)值的一種肺腺癌診斷途徑[28]。目前常采用的外泌體蛋白提取方式有2種，一是運(yùn)用細(xì)胞外囊泡陣列中的抗體來(lái)捕捉肺癌外泌體，并用生物素偶聯(lián)的方法測(cè)量和觀測(cè)外泌體蛋白，驗(yàn)證了外泌體蛋白可單獨(dú)作為肺癌的診斷方法[29]，二是使用超速離心法分離血清外泌體，進(jìn)而用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用和生物信息學(xué)分析，不僅對(duì)于鑒定早期、晚期肺腺癌患者和健康對(duì)照者血清中表達(dá)改變的潛在外泌體蛋白有可觀的收效，也開(kāi)辟了通過(guò)外泌體蛋白進(jìn)行靶向治療的路徑[30]。部分肺結(jié)節(jié)常一步一步發(fā)展為中晚期肺癌，在肺結(jié)節(jié)中甄別出早期肺癌，進(jìn)行早期治療是臨床上重要的工作[31]。鐘榮斌等[32]發(fā)現(xiàn)NSCLC患者與肺良性結(jié)節(jié)患者血漿外泌體中存在多種差異表達(dá)蛋白質(zhì)分子，對(duì)于區(qū)分良性肺結(jié)節(jié)和NSCLC方面可能具有潛在的診斷價(jià)值。

綜上，外泌體miRNA、circRNA、lncRNA和蛋白質(zhì)在早期肺腺癌的診斷以及鑒別診斷中有著巨大的潛在價(jià)值，有望成為臨床中早期肺腺癌的診斷生物標(biāo)志物。

4 外泌體在肺腺癌治療中的應(yīng)用價(jià)值

4.1 外泌體是治療肺腺癌的潛在靶點(diǎn)根據(jù)外泌體在肺腺癌中的調(diào)控機(jī)制，可將其作為治療的潛在靶點(diǎn)。Zhang等[33]通過(guò)將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源的外泌體miR-506與肺腺癌細(xì)胞共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)外泌體miR-506可以在基于順鉑的熱療情況下作用于ATAD2/PI3K/AKT信號(hào)通路來(lái)干預(yù)肺腺癌細(xì)胞的生存狀態(tài)，進(jìn)一步的結(jié)果顯示miR-506通過(guò)下調(diào)ATAD2抑制PI3K/AKT信號(hào)通路，增強(qiáng)肺腺癌細(xì)胞對(duì)基于順鉑的熱療的敏感性，為肺腺癌的外泌體治療提供了潛在的治療靶點(diǎn)。鐵死亡是一種依賴于鐵離子和脂質(zhì)過(guò)氧化物大量累積的細(xì)胞程序性死亡方式。肺腺癌患者血漿外泌體可以增加肺腺癌細(xì)胞circRNA 101093的表達(dá)，進(jìn)而上調(diào)脂肪酸結(jié)合蛋白3的水平，幫助花生四烯酸、牛磺酸形成N-花生四烯酰?；撬釓?fù)合物，當(dāng)此復(fù)合物抵擋花生四烯酸摻入質(zhì)膜時(shí)，外泌體就會(huì)通過(guò)特異性地降低多不飽和脂肪酸脂質(zhì)過(guò)氧化的水平來(lái)減少活性氧的形成而抑制鐵死亡，因此阻斷外泌體可能有助于未來(lái)的肺腺癌治療[34]。

4.2 外泌體可用作藥物載體精準(zhǔn)殺傷癌細(xì)胞外泌體作為核酸載體的優(yōu)勢(shì)在于具有良好的藥代動(dòng)力學(xué)和免疫學(xué)特性，并且能夠穿透合成藥物載體難以穿透的生理屏障。細(xì)胞納米化的方法可能使外泌體成為一種通用的核酸載體用在轉(zhuǎn)錄操作的應(yīng)用中[35]。含有mRNA的外泌體增強(qiáng)了對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用，并提高了生存率。紫杉醇可通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)微管重組及抑制解聚阻滯細(xì)胞的有絲分裂來(lái)抑制肺腺癌細(xì)胞的增殖，采用iRGD對(duì)乳源外泌體進(jìn)行修飾，能使其靶向肺腺癌細(xì)胞，然后通過(guò)電穿孔將紫杉醇附著于iRGD修飾過(guò)的外泌體上形成外泌體電穿孔負(fù)載紫杉醇復(fù)合物用于肺腺癌，其選擇程度高只對(duì)腫瘤細(xì)胞有明顯的殺傷作用，而對(duì)正常細(xì)胞無(wú)明顯毒性[36]。

4.3 外泌體是藥物耐藥問(wèn)題的潛在靶點(diǎn)靶向治療是近些年用于肺腺癌敏感突變患者的一種新方法，與反復(fù)住院放化療相比較具有毒副作用較小和簡(jiǎn)便性等優(yōu)勢(shì)，使部分患者得到較佳治療。但靶向藥物普遍存在的耐藥性使部分患者無(wú)法獲得長(zhǎng)期緩解。Yuan等[37]通過(guò)分析腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞上清液中的外泌體發(fā)現(xiàn)，其與吉非替尼一樣能夠抑制肺腺癌細(xì)胞，但同時(shí)又可通過(guò)參與AKT、ERK1/2和STAT3信號(hào)通路的再激活來(lái)增強(qiáng)肺腺癌對(duì)吉非替尼的耐藥，因此阻斷肺癌患者腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞來(lái)源的外泌體可以減弱肺腺癌細(xì)胞對(duì)吉非替尼的耐藥?；熕幬锿瑯哟嬖谀退幮?，Zhang等[38]研究發(fā)現(xiàn)外泌體SNHG7在耐多西他賽的肺腺癌細(xì)胞中高表達(dá)，并通過(guò)誘導(dǎo)自噬和巨噬細(xì)胞M2型極化來(lái)增強(qiáng)肺腺癌細(xì)胞對(duì)多西他賽的耐藥性，因此抑制外泌體SNHG7可能是緩解耐藥的有效措施。

綜上，外泌體不僅可作為肺腺癌治療和藥物耐藥問(wèn)題方面的潛在靶點(diǎn)，還能被用作藥物載體特異性地殺傷肺腺癌細(xì)胞。

4.4 外泌體用作肺腺癌綜合治療的療效評(píng)價(jià)

4.4.1外科手術(shù)的療效評(píng)價(jià) 目前針對(duì)肺腺癌的治療多采用的是以手術(shù)為主的綜合治療，治療后療效評(píng)價(jià)關(guān)乎治療方案是否需要調(diào)整，直接影響患者預(yù)后。Xue等[39]發(fā)現(xiàn)在健康個(gè)體和肺腺癌患者血漿外泌體中一些基因存在差異性表達(dá)，將肺腺癌患者治療前后的外泌體進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)肺腺癌患者中miR-484顯著表達(dá)且在術(shù)后降低。Wu等[40]通過(guò)建立Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型發(fā)現(xiàn)，與健康對(duì)照組相比，肺腺癌患者血清外泌體miR-1290顯著上調(diào)，在進(jìn)行手術(shù)切除后顯著降低。因此，手術(shù)前后外泌體變化是肺腺癌手術(shù)療效評(píng)價(jià)的潛在指標(biāo)。

4.4.2免疫治療的療效評(píng)價(jià) 對(duì)于PD-L1陽(yáng)性的肺腺癌患者采用PD-L1抑制劑進(jìn)行治療。Chen等[41]發(fā)現(xiàn)外泌體miR-16-5p含量和PD-L1表達(dá)可能存在負(fù)相關(guān)，采用PD-L1抑制劑治療后，當(dāng)出現(xiàn)PD-L1水平升高也就是血清外泌體miR-16-5p水平降低時(shí)，肺腺癌患者的總生存率和無(wú)進(jìn)展生存率會(huì)增加。Yang等[42]發(fā)現(xiàn)血小板蛋白2(thrombospondin 2，THBS2)是來(lái)源于特定的癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞亞群的蛋白，且高侵襲性的肺腺癌細(xì)胞可優(yōu)先通過(guò)外泌體分泌THBS2來(lái)減少免疫細(xì)胞浸潤(rùn)從而促進(jìn)肺腺癌的發(fā)生發(fā)展，因此在臨床中THBS2高表達(dá)常預(yù)示著患者對(duì)免疫治療反應(yīng)差和治療后生存期短。

4.4.3化療的療效評(píng)價(jià) 化療是腫瘤治療常采用的一種治療方式。鉑類(lèi)是肺腺癌常采用的化療藥物，Yuwen等[43]通過(guò)對(duì)采用鉑類(lèi)化療患者體內(nèi)外泌體的分析發(fā)現(xiàn)，對(duì)鉑類(lèi)耐藥患者循環(huán)外泌體miR-425-3p水平較高，認(rèn)為其可以作為預(yù)測(cè)鉑類(lèi)藥物化療臨床療效的生物標(biāo)志物。Peng等[44]發(fā)現(xiàn)乳酸脫氫酶C4在肺腺癌組織中的表達(dá)量顯著高于癌旁組織，通過(guò)進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)肺腺癌患者血清來(lái)源外泌體中乳酸脫氫酶C4的表達(dá)與藥物治療呈負(fù)相關(guān)，與肺腺癌復(fù)發(fā)呈正相關(guān)，是判斷治療效果的獨(dú)立因素。

綜上，外泌體作為一種新型、無(wú)創(chuàng)的檢查手段，為評(píng)估肺腺癌綜合治療的效果開(kāi)辟了新路徑，但仍需要大量的研究來(lái)證實(shí)。

5 小結(jié)與展望

綜上，外泌體在肺腺癌早期診斷和治療中均扮演著重要角色，本文對(duì)外泌體用于肺結(jié)節(jié)良惡性鑒別、在肺腺癌治療潛在靶點(diǎn)及療效評(píng)價(jià)中的作用作了簡(jiǎn)單介紹。但目前外泌體在肺腺癌的研究中仍有些許的不足，如外泌體檢測(cè)方法不夠簡(jiǎn)便、快捷、有效和低成本，關(guān)于肺腺癌的早期診斷、治療等的樣本量太小，仍需更多的試驗(yàn)樣本來(lái)證明可行性。希望隨著對(duì)外泌體更加深入的研究，多源外泌體聯(lián)合檢測(cè)以及外泌體作為藥物載體能夠解決目前臨床診斷、耐藥等問(wèn)題，使其更早應(yīng)用于臨床，造福廣大患者。