miR-135a/b靶向SIRT1調(diào)控葡萄膜黑色素瘤細(xì)胞的遷移

林永 楊汝森 葉菊秀 陳曉燕

作者單位：溫州醫(yī)科大學(xué)附屬眼視光醫(yī)院 眼視光學(xué)和視覺科學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，溫州 325027

葡萄膜黑色素瘤（Uveal melanoma，UM）是一種起源于成人眼內(nèi)葡萄膜黑色素細(xì)胞的惡性腫瘤[1]。國內(nèi)的UM發(fā)病率和死亡率僅次于視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤，位居眼內(nèi)惡性腫瘤第2位。其惡性程度高，50%的UM患者可經(jīng)血液轉(zhuǎn)移至肝臟、皮膚、肺等部位，轉(zhuǎn)移后致死率極高[2]。但目前其發(fā)病機(jī)制尚不清楚。

MicroRNA（miRNA）是一類長(zhǎng)度為20～24 個(gè)核苷酸的非編碼單鏈小RNA，它通過與目標(biāo)基因的mRNA 3' 非編碼區(qū)域（3' untranslated region，3' UTR）結(jié)合抑制其翻譯和表達(dá)[3]。有文獻(xiàn)報(bào)道，miRNA參與調(diào)控許多生理和病理過程，如胚胎發(fā)育[4]、視網(wǎng)膜發(fā)育[5]、衰老[6]和心臟疾病[7]等。有研究發(fā)現(xiàn)microRNA在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中也具有重要的調(diào)控作用，它通過抑制靶基因的表達(dá)來發(fā)揮對(duì)腫瘤抑制或促進(jìn)作用[8]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)多個(gè)miRNA，如miR-34a[9]、miR-137[10]、miR-182[11]、miR-124a[12]、miR-142-3p[13]、miR-127[14]在UM中表達(dá)水平明顯下調(diào)，對(duì)UM細(xì)胞的增殖和遷移具有重要的調(diào)控作用。這些研究均表明microRNAs是UM發(fā)生發(fā)展的重要調(diào)控因子。

microRNA-135（miR-135）家族包含miR-135a和miR-135b這2個(gè)高度同源體。2個(gè)同源體具有相同的種子序列，預(yù)示miR-135a/b可能具有相同的靶基因和作用途徑。本研究主要檢測(cè)miR-135a/b在人UM中的表達(dá)水平變化，探索miR-135a/b對(duì)UM細(xì)胞遷移的調(diào)控作用和機(jī)制，為臨床上抑制UM轉(zhuǎn)移率提供靶向藥物參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞 人眼UM細(xì)胞M23由美國紐約醫(yī)學(xué)院胡誕寧教授惠贈(zèng)；人眼UM細(xì)胞SP6.5由加拿大魁北克免疫學(xué)研究中心提供；HEK293細(xì)胞購于美國標(biāo)準(zhǔn)生物品收藏中心（ATCC）細(xì)胞庫。

1.1.2 組織標(biāo)本 3對(duì)UM組織由溫州醫(yī)科大學(xué)附屬眼視光醫(yī)院提供，腫瘤組織為實(shí)驗(yàn)組，其對(duì)應(yīng)的癌旁組織為對(duì)照組。該研究已通過溫州醫(yī)科大學(xué)附屬眼視光醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)（批號(hào)：溫醫(yī)大眼視光倫審2022研第102號(hào)），并獲得患者及家屬知情同意。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

胎牛血清（Fetal bovine serum，F(xiàn)BS）、Dulbecco's Modified Eagle Medium（DMEM）培養(yǎng)基均購于美國GIBICO公司；0.05%胰酶、轉(zhuǎn)染試劑（LipofectamineTMRNAi/MAX Reagent）均購于美國Invitrogen公司；miRNA mimics及其陰性對(duì)照購于美國Ambion公司；小干擾RNA（Small interference RNA，siRNA）購于廣州市銳博生物科技有限公司；抗體SIRT1、β-肌動(dòng)蛋白（β-ACTIN）均購于美國Cell Signaling Technology公司。雙螢光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)試劑盒（Dual Luciferase Reporter Assay System）購于美國Promega公司；硝酸纖維素膜購于美國GE Healthcare公司；實(shí)時(shí)定量PCR試劑購于美國ABI公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 RNA提取和熒光定量RT-PCR 用Trizol法提取細(xì)胞或組織中的Total RNA，采用Nano Drop One檢測(cè)RNA的純度和濃度。每個(gè)樣品取20 ng total RNA加入到ABI High Capacity cDNA Archive Kit配制的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系中，放入PCR儀進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)（25 ℃溫育30 min；42 ℃溫育30 min；85 ℃變性5 min）。取1 μl逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，加入10 μl的2×PCR master mix和1 μl Taqman Assay Mix探針，混合均勻，進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)（95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性30 s和60 ℃延伸1 min，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果按照-ΔΔCt法進(jìn)行相對(duì)表達(dá)水平的計(jì)算分析。以U6作為內(nèi)參。

1.3.2 細(xì)胞培養(yǎng) 人UM細(xì)胞（M23 和SP6.5）、HEK293的培養(yǎng)基為含10% FBS、100 U/ml青霉素和100 U/ml鏈霉素的DMEM。將細(xì)胞置于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔1天換1次培養(yǎng)液，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.3 microRNA和siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞 將M23、SP6.5 接種于12 孔板中，待細(xì)胞長(zhǎng)至融合度為30%～40%時(shí)，每孔加入用基礎(chǔ)培養(yǎng)液稀釋的Lipofectamine RNAi/MAX和microRNA mimics/siRNA（終濃度為50 nmol/L）混合液。轉(zhuǎn)染8 h后更換細(xì)胞培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。同時(shí)，轉(zhuǎn)染無義miRNA序列（Negative control,NC）或者無義siRNA序列（siRNA negative control,siNC）作為陰性對(duì)照組。microRNA mimics和siRNA及其陰性對(duì)照的序列見表1。

表1.miRNA mimics和siRNA的序列Table 1.Sequences of miRNA mimics and siRNA

1.3.4 劃痕實(shí)驗(yàn) 將細(xì)胞接種于6孔板生長(zhǎng)至融合度為100%時(shí)，在孔板中央位置標(biāo)記劃痕，100倍顯微鏡下拍照記錄遷移前細(xì)胞面積。細(xì)胞培養(yǎng)基中降低血清濃度至0.1%，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。顯微鏡下觀察細(xì)胞遷移情況，拍照記錄劃痕位置（遷移后面積）。采用生物學(xué)軟件Image J分析細(xì)胞遷移的距離。遷移距離相對(duì)值=（遷移前細(xì)胞面積-遷移后細(xì)胞面積）/遷移前細(xì)胞面積×100%。

1.3.5 Transwell實(shí)驗(yàn) 將細(xì)胞接種于6 cm平皿，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)用0.05%的胰酶消化收集并計(jì)數(shù)。取3×104個(gè)細(xì)胞接種于Transwell小室內(nèi)，上室加入低濃度血清培養(yǎng)基，下室加入完全培養(yǎng)基，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，讓細(xì)胞進(jìn)行自由遷移。24 h后棄去上室和下室中的培養(yǎng)基，加入4%多聚甲醛溶液室溫固定細(xì)胞30 min。固定結(jié)束后，加入1%結(jié)晶紫染色5～10 min，用棉花簽拭去小室上層的細(xì)胞，保留小室下面穿膜的細(xì)胞。倒置相差顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野拍照，記錄穿膜的細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.6 雙螢光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn) 將包含miR-135a/b結(jié)合位點(diǎn)的SIRT1 mRNA 3' UTR片段插入pMIRREPORT 質(zhì)粒載體構(gòu)建野生型重組子，命名為SIRT1-WT。將結(jié)合位點(diǎn)經(jīng)過點(diǎn)突變的SIRT1 mRNA 3' UTR片段插入pMIR-REPORT質(zhì)粒載體構(gòu)建突變型重組子，命名為SIRT1-MUT。將重組質(zhì)粒與miR-135a/b mimics或陰性對(duì)照（Negative control，NC）共同轉(zhuǎn)染至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HEK293細(xì)胞，培養(yǎng)48 h后按照Promega公司的雙螢光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)試劑盒的方法進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.7 Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)水平 將RIPA裂解液加入培養(yǎng)的細(xì)胞中進(jìn)行裂解，離心去除細(xì)胞碎片和其他雜質(zhì)，取10 μl裂解樣品與上樣緩沖液混合，沸水浴變性5 min后進(jìn)行變性聚丙烯酰胺凝膠電泳。電泳完成后，將凝膠中的蛋白條帶轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，再用5%脫脂牛奶封閉液封閉3 h。封閉后的膜依次進(jìn)行SIRT1抗體和二抗的孵育，在Odyssey紅外激光成像儀上條帶成像。

1.3.8 慢病毒載體過表達(dá)SIRT1 委托上海吉?jiǎng)P基因醫(yī)學(xué)科技股份有限公司將SIRT1基因表達(dá)序列插入慢病毒載體構(gòu)建為重組的過表達(dá)慢病毒載體，命名為L(zhǎng)v-SIRT1。同時(shí)構(gòu)建插入了無義序列的重組慢病毒載體作為NC，命名為L(zhǎng)v-NC。將Lv-SIRT1或者Lv-NC稀釋使感染復(fù)數(shù)（Multiplicity of infection，MOI）達(dá)到10并加入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞培養(yǎng)液中，12 h后更換新培養(yǎng)液。感染3～4 d后，熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白的表達(dá)情況以評(píng)估慢病毒載體的感染效率。待細(xì)胞生長(zhǎng)至100%融合度時(shí)，收集細(xì)胞重新接種于孔板中培養(yǎng)，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)研究。采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布且方差齊，采用表示。組間各數(shù)據(jù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-135a/b在UM中的表達(dá)水平

與癌旁組織相比，UM組織中miR-135a的表達(dá)水平下調(diào)約20倍（t=6.38，P=0.003），miR-135b的表達(dá)水平下調(diào)約30倍（t=23.26，P<0.001）。

2.2 miR-135a/b抑制UM細(xì)胞的遷移

與NC組相比，miR-135a/b轉(zhuǎn)染的M23和SP6.5細(xì)胞的miR-135a或miR-135b表達(dá)水平明顯升高（miR-135a：t=11.16、15.59，P<0.001;miR-135b：t=15.46、10.48，P<0.001），表明在UM細(xì)胞中成功過表達(dá)miR-135a和miR-135b。細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與NC組相比，miR-135a/b轉(zhuǎn)染的M23 和SP6.5 細(xì)胞遷移距離明顯減小且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（miR-135a：t=36.01，P<0.001；t=8.98，P=0.003；miR-135b：t=27.53，P<0.001；t=10.51，P=0.002），見圖1A。Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，M23和SP6.5細(xì)胞中miR-135a/b轉(zhuǎn)染組與NC組相比，其遷移細(xì)胞的數(shù)量明顯減少且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（miR-135a：t=7.04、7.02，P<0.001；miR-135b：t=5.01、7.32，P<0.01），見圖1B。

2.3 miR-135a/b靶向SIRT1 mRNA 3' UTR調(diào)控SIRT1蛋白表達(dá)水平

利用miRNA靶基因預(yù)測(cè)網(wǎng)站Targetscan（http://www.targetscan.org/）對(duì)miR-135a和miR-135b的靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)和篩選，發(fā)現(xiàn)miR-135a和miR-135b的種子序列與SIRT1 mRNA 3' UTR中一段序列高度配對(duì)，見圖2A。將miR-135a/b在細(xì)胞中過表達(dá)后，Western blot的結(jié)果顯示M23細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-135a/b組比NC組SIRT1 蛋白的表達(dá)水平明顯下調(diào)且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（miR-135a：t=9.93，P<0.001；miR-135b：t=4.66，P=0.006），轉(zhuǎn)染miR-135a/b的SP6.5細(xì)胞中SIRT1 蛋白的表達(dá)水平也比NC組的明顯下調(diào)且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（miR-135a：t=4.13，P=0.002；miR-135b：t=6.20，P<0.001），見圖2B。采用雙螢光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miR-135a/b是否能與其靶基因SIRT1 mRNA 3' UTR直接結(jié)合，結(jié)果顯示在轉(zhuǎn)染了重組子SIRT1-WT的HEK293 細(xì)胞中，miR-135a/b 組較NC組的螢光素酶熒光值被明顯抑制且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（miR-135a:t=2.88，P=0.028；miR-135b:t=4.99，P=0.003），見圖2C。反之，轉(zhuǎn)染了SIRT1-MUT的HEK293細(xì)胞中，miR-135a/b組較NC組的螢光素酶熒光值無差異（miR-135a: t=1.165，P=0.288；miR-135b:t=1.387，P=0.215），見圖2C。

圖1.miR-135a/b抑制葡萄膜黑色素細(xì)胞的遷移A：劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-135a/b對(duì)M23、SP6.5 細(xì)胞遷移能力的影響；B：Transwell實(shí)驗(yàn)分析miR-135a/b對(duì)M23、SP6.5細(xì)胞遷移能力的影響（標(biāo)尺=100 μm）Figure 1.miR-135a/b inhibited the migration of uveal melanoma cellA: The effect of miR-135a/b on the migration of M23 or SP6.5 was determined by scratch experiment;B: The effect of miR-135a/b on the migration of M23 or SP6.5 was determined by Transwell assay (bar=100 μm).

圖2.miR-135a/b靶向結(jié)合SIRT1 mRNA 3' UTRA：miR-135a/b與SIRT1 mRNA 3' UTR的結(jié)合位點(diǎn)；B：過表達(dá)miR-135a/b抑制SIRT1蛋白的表達(dá)水平；C：雙螢光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miR-135a/b靶向結(jié)合SIRT1 mRNA 3' UTR。a，與NC組比較，P<0.05；b，與NC組比較，P<0.01Figure 2. miR-135a/b targeted combined to SIRT1 mRNA 3' UTRA: The binding site of miR-135a/b with SIRT1 mRNA 3' UTR;B: The over expression of miR-135a/b inhibited the protein expression level of SIRT1;C: Dual-Luciferase reported assay was used to confirm the binding of miR-135a/b with SIRT1 mRNA 3' UTR.a,compared with negative control (NC)group,P<0.05;b,compared with NC group,P<0.01.

2.4 下調(diào)的SIRT1抑制UM細(xì)胞的遷移

Western blot結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染后UM細(xì)胞中的SIRT1 蛋白表達(dá)水平被下調(diào)了90%，見圖3A。進(jìn)一步采用劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell檢測(cè)細(xì)胞遷移能力。劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與NC組相比，SIRT1 siRNA轉(zhuǎn)染組的M23 細(xì)胞的遷移距離明顯小于NC組且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（siSIRT1-I：t=13.88，P=0.001；siSIRT1-II：t=31.20，P<0.001），SP6.5細(xì)胞具有一致的結(jié)果（siSIRT1-I：t=11.78，P<0.001；siSIRT1-II：t=6.27，P=0.008），見圖3B。Transwell檢測(cè)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-135a/b的M23細(xì)胞遷移數(shù)量較NC組明顯減少且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（siSIRT1-I：t=7.57，P<0.001；siSIRT1-II：t=5.58，P=0.002），SP6.5 細(xì)胞具有一致的結(jié)果（siSIRT1-I：t=4.66，P=0.002；siSIRT1-II：t=3.25，P=0.011），見圖3C。

圖3.下調(diào)的SIRT1抑制葡萄膜黑色素瘤細(xì)胞的遷移A：SIRT1 siRNA抑制M23和SP6.5細(xì)胞中SIRT1蛋白表達(dá)水平；B：劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)下調(diào)的SIRT1抑制M23和SP6.5細(xì)胞的遷移；C：Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)下調(diào)的SIRT1抑制M23和SP6.5細(xì)胞遷移（標(biāo)尺=100 μm）Figure 3.Down regulation of SIRT1 inhibited the migration of uveal melanoma cellsA: The expression of SIRT1 in uveal melanoma cells M23 and SP6.5 after SIRT1 siRNA transfection;B: The effect of SIRT1 knockdown on the migration of M23 or SP6.5 was determined by scratch experiment;C:The effect of SIRT1 knockdown on the migration of M23 or SP6.5 was determined by Transwell assay (bar=100 μm).

2.5 過表達(dá)SIRT1可減弱miR-135a/b對(duì)UM細(xì)胞遷移的抑制作用

miR-135a/b+Lv-SIRT1 感染組M23 和SP6.5細(xì)胞中的SIRT1 蛋白表達(dá)水平明顯高于miR-135a/b+Lv-NC感染組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（miR-135a+Lv-SIRT1：t=7.57，P=0.002；t=4.58，P=0.011;miR-135b+Lv-SIRT1：t=14.87，P<0.001；t=4.39，P=0.012），見圖4A。Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，miR-135a/b+Lv-SIRT1感染組M23 和SP6.5 細(xì)胞的遷移數(shù)量多于miR-135a/b+Lv-NC感染組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（miR-135a+Lv-SIRT1：t=4.10，P=0.003；t=2.75，P=0.025；miR-135b+Lv-SIRT1：t=2.99，P=0.018；t=2.49，P=0.037），見圖4B。

3 討論

miR-135家族包括miR-135a和miR-135b這2個(gè)高度同源體，在多種腫瘤中都顯示表達(dá)水平異常。miR-135a在結(jié)直腸癌[15]、乳腺癌[16]、肝癌[17]中的表達(dá)水平均顯著升高；但在卵巢癌[18]、胰腺癌[19]、骨肉瘤[20]中的表達(dá)水平卻明顯下調(diào)。miR-135b在非小細(xì)胞肺癌[21]、胃癌[22]中表達(dá)水平明顯升高。目前，關(guān)于miR-135a/b在UM中的表達(dá)水平是否有異常的研究鮮見報(bào)道。本研究在UM組織中檢測(cè)到miR-135a/b表達(dá)顯著下調(diào)，提示miR-135a/b具有抑制UM的作用。過表達(dá)miR-135a/b能夠抑制UM細(xì)胞的遷移能力，提示miR-135a/b在UM的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。有研究報(bào)道，腫瘤組織中的轉(zhuǎn)錄因子和長(zhǎng)鏈非編碼RNA可調(diào)控miR-135a的轉(zhuǎn)錄，從而引發(fā)異常的表達(dá)水平[23]。在UM中，對(duì)miR-135a/b的轉(zhuǎn)錄調(diào)控仍有待深入的研究。

圖4.過表達(dá)SIRT1可減弱miR-135a/b對(duì)葡萄膜黑色素細(xì)胞的遷移抑制作用A：M23和SP6.5細(xì)胞中慢病毒過表達(dá)SIRT1蛋白；B：Transwell檢測(cè)上調(diào)的SIRT1促進(jìn)M23、SP6.5的細(xì)胞遷移（標(biāo)尺=100 μm）Figure 4.Over expression of SIRT1 suppressed the inhibition effect of miR-135a/b on the migration of uveal melanoma cellsA: The lentivirus overexpressed SIRT1 protein in M23 and SP6.5 cells;B: Transwell assay detected the promotion of cell migration caused by overexpression of SIRT1 in M23 and SP6.5 (bar=100 μm).

miRNA是通過結(jié)合靶基因的mRNA 3' UTR來抑制下游蛋白翻譯和表達(dá)，從而改變下游各種信號(hào)調(diào)控途徑，進(jìn)而影響細(xì)胞的各種生物學(xué)進(jìn)程。有研究表明，miR-135a/b亦是通過抑制其下游靶基因的蛋白翻譯和表達(dá)，從而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移，最終形成對(duì)腫瘤的調(diào)控作用。Chen等[24]研究表明，miR-135a靶向BMI1 和KLF4 抑制骨肉瘤細(xì)胞的遷移和侵襲，從而控制腫瘤細(xì)胞向肺部轉(zhuǎn)移；Hu等[25]發(fā)現(xiàn)，miR-135b靶向大腫瘤抑制激酶2（Large tumor suppressor kinase 2，LATS2）調(diào)控皮膚黑色素瘤細(xì)胞的增殖和遷移。本研究發(fā)現(xiàn)，在UM細(xì)胞中miR-135a和miR-135b通過與SIRT1 mRNA 3' UTR靶向結(jié)合從而抑制UM細(xì)胞的遷移能力。SIRT1是第III類煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（Nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+）依賴的組蛋白去乙?；福苷{(diào)節(jié)多種細(xì)胞的生物學(xué)進(jìn)程，包括細(xì)胞周期、遷移、凋亡、代謝和自噬等[26]。SIRT1在多種腫瘤中高表達(dá)，與腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移密切相關(guān)[27]。本課題組的前期研究發(fā)現(xiàn)，與正常的UM細(xì)胞相比，SIRT1在UM細(xì)胞中高表達(dá)并促進(jìn)UM細(xì)胞的增殖，敲減SIRT1可以抑制其增殖[28]。本研究中，在UM細(xì)胞中過表達(dá)miR-135a/b能夠抑制SIRT1的蛋白水平表達(dá)且抑制UM細(xì)胞的遷移能力。下調(diào)的SIRT1能否調(diào)控UM細(xì)胞的遷移能力呢？進(jìn)一步通過小干擾RNA下調(diào)SIRT1 的表達(dá)水平也能夠明顯抑制UM細(xì)胞的遷移能力。在過表達(dá)miR-135a/b的基礎(chǔ)上，上調(diào)SIRT1的表達(dá)水平能夠減弱miR-135a/b對(duì)UM 細(xì)胞遷移能力的抑制作用。綜上所述，miR-135a/b是通過下調(diào)靶基因SIRT1的表達(dá)水平來發(fā)揮其對(duì)UM細(xì)胞遷移能力的抑制作用。SIRT1在miR-135a/b調(diào)控UM細(xì)胞遷移能力上具有至關(guān)重要的作用，其下游的分子調(diào)控機(jī)制還需要進(jìn)一步的探索。

越來越多的研究證明，miRNAs與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，有望成為新一代藥物模式用于癌癥的治療[29-32]。與轉(zhuǎn)移相關(guān)的miRNA可通過直接靶向結(jié)合具有調(diào)控癌細(xì)胞遷移、侵襲功能的靶基因來抑制腫瘤轉(zhuǎn)移。miR-135a/b能夠靶向結(jié)合SIRT1抑制UM細(xì)胞的遷移，提示miR-135a/b可用于抑制UM轉(zhuǎn)移的候選靶標(biāo)分子。

利益沖突申明本研究無任何利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明林永：參與收集數(shù)據(jù)，參與選題、設(shè)計(jì)及資料的分析和解釋；撰寫論文；對(duì)編輯部的修改意見進(jìn)行修改。楊汝森：參與收集數(shù)據(jù)和實(shí)施研究。葉菊秀：參與采集數(shù)據(jù)和實(shí)施研究。陳曉燕：參與選題、設(shè)計(jì)及資料的分析和解釋；撰寫論文；修改論文中關(guān)鍵性結(jié)果、結(jié)論，根據(jù)編輯部的修改意見進(jìn)行修改