鐵皮石斛內(nèi)生真菌及其代謝產(chǎn)物研究進展

方余慧， 曹鵬， 鄒慧熙， 閻秀峰， 李楠

(溫州大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院 城市水污染生態(tài)治理技術(shù)國家地方聯(lián)合工程研究中心 浙江省水環(huán)境與海洋生物資源保護重點實驗室， 浙江 溫州 325035)

鐵皮石斛(DendrobiumofficinaleKimura et Migo)是蘭科(Orchidaceae)多年生草本植物，廣泛用作傳統(tǒng)藥材[1]，被譽為“九大仙草之首”[2]。據(jù)《中國藥典》記載，鐵皮石斛內(nèi)含豐富的活性物質(zhì)，具有多種生物學(xué)功效?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)大量研究也表明，石斛中含有豐富的多糖、生物堿、氨基酸、酚類等活性成分[3]，具有抗氧化、抗菌、抑制腫瘤、保肝、抗炎等作用[4]。隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的快速發(fā)展，人們對鐵皮石斛的認識和研究也在逐步深入，這為鐵皮石斛的產(chǎn)業(yè)化種植提供了理論基礎(chǔ)。盡管鐵皮石斛在我國入藥歷史悠久，但其生長緩慢，病害時常發(fā)生，嚴重影響鐵皮石斛的產(chǎn)量和品質(zhì)。目前，生產(chǎn)上對于鐵皮石斛病害的防治仍以化學(xué)農(nóng)藥防治為主，但長期使用會引起農(nóng)藥殘留、破壞原有植物內(nèi)外部生態(tài)平衡、病菌耐藥性增強等一系列問題[5]。而研究表明，以內(nèi)生真菌制備的生防菌制劑不僅具有抗病促生長、長效無污染等諸多優(yōu)點，且適用于工業(yè)化、規(guī)?；a(chǎn)。

內(nèi)生真菌是指定殖在寄主植物健康組織內(nèi)，且不引起植物發(fā)病的真菌微生物[6]。研究表明，內(nèi)生真菌可以促進植物健康生長，其代謝產(chǎn)物的生物活性也已在多種植物中得到證實[7]。內(nèi)生真菌能通過提高養(yǎng)分利用率、固定生物氮和產(chǎn)生植物激素直接促進植物生長[8]，也能拮抗有害微生物，并通過抗菌、競爭或提高系統(tǒng)性抗性等方式間接保護植物健康。內(nèi)生真菌在鐵皮石斛的病害防治、人工栽培、引種馴化以及資源再生和保護等方面都具有重要的應(yīng)用價值和前景[9]。本文重點梳理已分離鑒定的鐵皮石斛內(nèi)生真菌多樣性及其共生關(guān)系，概括內(nèi)生真菌對鐵皮石斛生長發(fā)育及病害防治的作用，并歸納其代謝產(chǎn)物的生物學(xué)活性，推動鐵皮石斛規(guī)模化栽培、病害的綠色防治以及藥用價值的開發(fā)利用，促進石斛產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展具有長遠的現(xiàn)實意義。

1 鐵皮石斛內(nèi)生真菌的多樣性

鐵皮石斛含有豐富的內(nèi)生真菌，其涵蓋了半知菌亞門(Deuterornycotina)、擔子菌亞門(Basidiomycotina)和子囊菌亞門(Ascomycotina)[10]。學(xué)者們從鐵皮石斛中分離得到的主要內(nèi)生真菌種屬如表1所示，不同分離部位及產(chǎn)地均存在一定差異。

從2000年開始，郭順星等[11]從四川、云南、福建的野生鐵皮石斛根部分離得到內(nèi)生真菌14株，建立了石斛屬內(nèi)生真菌分離和鑒定的方法，開啟了鐵皮石斛內(nèi)生真菌的研究。Zhou等[12]從廣西鐵皮石斛中分離得到28株內(nèi)生真菌，結(jié)果顯示，分離的內(nèi)生真菌分別歸屬于鐮刀屬(Fusarium)，赤霉菌屬(Gibberella)，小球殼孢屬(Microsphaeropsis)，鏈格孢屬(Alternaria)，黑孢屬(Nigrospora)，炭疽屬(Colletotrichum)，小叢殼菌屬(Glomerella)等10個屬。

表1 鐵皮石斛內(nèi)生真菌分類

胡克興等[13]采用形態(tài)學(xué)鑒定和分子生物學(xué)鑒定的方法，結(jié)合菌落培養(yǎng)特征和分生孢子大小、顏色、形態(tài)和產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)類型等顯微特征以及內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列(ITS)進行系統(tǒng)發(fā)育分析，對鐵皮石斛生長活性的內(nèi)生真菌進行鑒定，確定其分類地位。他們從鐵皮石斛的根、莖和葉中分離得到67株內(nèi)生真菌，分別歸屬于16個屬，其中Fusarium和Alternaria為鐵皮石斛內(nèi)生真菌的優(yōu)勢種群。其內(nèi)生真菌在鐵皮石斛根、莖、葉中的分布存在較大差別，具有一定的組織差異性。Hou等[14]分離得到8株內(nèi)生真菌，分別屬于擬盤菌屬(Pestalotiopsis)，曲霉菌屬(Eurotium)，棘殼孢屬(Pyrenochaeta)，鬼傘屬(Coprinellus)，鱗傘屬(Pholiota)，柔膜菌屬(Helotiales)，鏈格孢屬(Alternaria)，他們對鐵皮石斛幼苗有促進生長作用。毛益婷等[15]研究表明，野生鐵皮石斛內(nèi)生真菌的種類和數(shù)量在根、莖、葉中的分布具有明顯差異。

由此可見，對于鐵皮石斛內(nèi)生真菌的多樣性體現(xiàn)在多個維度，包括菌種多樣性和分布多樣性。豐富的微生物多樣性直接影響了植物健康和生長發(fā)育。因此，研究鐵皮石斛內(nèi)生真菌多樣性具有深遠意義。

2 鐵皮石斛與其內(nèi)生真菌的互作關(guān)系

2.1 內(nèi)生真菌對鐵皮石斛抗病害的影響

研究表明，許多內(nèi)生真菌可以通過與病原菌競爭生態(tài)位和營養(yǎng)物質(zhì)產(chǎn)生抗菌代謝物，作為植物防御的組成部分并誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗微生物或免疫化合物等途徑使病原菌無法得到正常的營養(yǎng)供給而消亡，從而增強宿主抵御病害的能力[16]。目前，有研究表明,內(nèi)生真菌對嚴重危害鐵皮石斛產(chǎn)量和質(zhì)量的白絹病、炭疽病、圓斑病均有顯著的抑制作用。

白絹病又稱菌核性根腐病或菌核性苗枯病，危害苗木和幼樹的根莖部，影響水分和養(yǎng)分的吸收，導(dǎo)致植物生長不良，嚴重時枝葉全部枯萎死亡，嚴重危害鐵皮石斛的品質(zhì)及產(chǎn)量[17]。研究表明，鐵皮石斛白絹病是由齊整小核菌(Sclerotiumrolfsii)和翠雀小核菌(Sclerotiumdelphinii)引起的[18]。周瑩等[19]從鐵皮石斛中篩選得到6株可以較好抑制翠雀小核菌活性的內(nèi)生真菌，其中Trichodermapolysporum抑制作用最強，可以定殖在鐵皮石斛根、莖、葉等組織，有效抑制白絹病的發(fā)生。

炭疽病主要危害鐵皮石斛的嫩葉，也可導(dǎo)致莖部腐爛及折斷[20]。研究結(jié)果表明，從鐵皮石斛中分離出對石斛炭疽病的病原菌——膠孢炭疽菌(Colletotrichumgloeosporioides)具有較強的抑制效果的內(nèi)生真菌[21-22]，其中菌株Ceriporiasp. F102、Rigidoporussp. F27、Termitomycessp. F103和Peniophorasp. F122的抑制率均高于80%。

圓斑病嚴重危害鐵皮石斛的葉片，導(dǎo)致葉片脫落。李梅蓉等[23]發(fā)現(xiàn)，鐵皮石斛內(nèi)生真菌尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)對圓斑病的致病菌——露濕漆斑菌(Myrotheciumroridum)的菌絲生長有較好的抑制作用，且持續(xù)時間較長。

由此可見，內(nèi)生真菌可以幫助宿主鐵皮石斛適應(yīng)生物脅迫，增強其抵御病害的能力。

2.2 內(nèi)生真菌對鐵皮石斛生長發(fā)育的影響

研究表明，石斛內(nèi)生真菌在寄主植物細胞內(nèi)交叉?zhèn)鬟f，在植物寄主的生長發(fā)育、抗性以及各種生物刺激和脅迫中發(fā)揮重要作用[24]。大多數(shù)內(nèi)生真菌來源于其寄主植物的生長環(huán)境，包括根際微生物、飄浮在空氣中的真菌孢子以及昆蟲和動物的攝食過程[25-26]。這些內(nèi)生真菌可以侵入植物根表皮細胞并定殖于細胞內(nèi)，形成厚壁孢子或高度分叉的菌絲，誘導(dǎo)寄主植物產(chǎn)生吲哚乙酸等各種生長激素，引發(fā)根系分支，增加根系吸收面積，提高植物攝取土壤養(yǎng)分的能力，從而增加宿主植物的株高、干重等，促進提前開花，因此，內(nèi)生真菌對促進植物生長具有重要的意義[27]。

高微微[28]將植物的原球莖、試管苗與內(nèi)生真菌開唇蘭小菇、石斛小菇和蘭小菇進行雙重培養(yǎng)，監(jiān)測到原球莖有明顯增殖，鐵皮石斛苗的生長量高于對照3～5倍，說明小菇屬內(nèi)生真菌能夠促進鐵皮石斛原球莖及幼苗的生長。朱彥明等[29]從石斛根部分離到毛殼菌屬(ChaetomiumKunze)、蠟殼耳屬(Sebacina)、踝節(jié)菌屬(Talaromyces)3種真菌，對鐵皮石斛種苗生長發(fā)育都有顯著的促進作用。同時，研究者將鐵皮石斛接種到有瘤菌根菌液的培養(yǎng)液中，發(fā)現(xiàn)鐵皮石斛生長更加旺盛并且營養(yǎng)成分顯著提高，極大促進了鐵皮石斛組培苗的生長[30-31]。

由此可見，有效內(nèi)生真菌與鐵皮石斛共培養(yǎng)可縮短鐵皮石斛生長周期，增加其中藥材資源的應(yīng)用。

3 鐵皮石斛內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)物及其作用

許多內(nèi)生真菌可以代謝產(chǎn)生多種具有生物活性的天然化合物，這些化合物可直接或間接應(yīng)用于各種疾病的治療。自Stierle等[33]從植物內(nèi)生真菌中提取出具有抗癌作用的活性物質(zhì)紫杉醇以來，內(nèi)生真菌及其代謝產(chǎn)物的生物活性便引起了廣泛關(guān)注。

研究表明，內(nèi)生真菌可以產(chǎn)生多種生物活性代謝物，包括萜類、醌類、吲哚生物堿、聚酮化合物和非核糖體肽類等[34]。Yu等[35]采用高效液相色譜法和紫外分光光度計法對鐵皮石斛內(nèi)生真菌的菌絲體或發(fā)酵液中的糖類和黃酮類化合物進行檢測，結(jié)果表明，21種真菌的乙酸乙酯提取物均含有黃酮類化合物，其中菌株DO49產(chǎn)生柚皮素，菌株DO23、DO81和DO83產(chǎn)生蘆丁，21株菌株的水溶性提取物均含有多糖。Wu等[36]從鐵皮石斛內(nèi)生真菌Pestalotiopsis代謝產(chǎn)物中分離得到2種新的具有抗真菌活性和細胞毒性的單萜類化合物以及3種已知化合物，其中4種化合物對白色念珠菌、新生隱球菌、紅色毛癬菌、煙曲霉均顯示出顯著的抗真菌活性。徐迪等[37]從鐵皮石斛內(nèi)生真菌發(fā)酵液中分離得到15個環(huán)肽和苯環(huán)衍生物，其中3種具有一定的腫瘤抑制活性。

內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)物可在一定程度上促進鐵皮石斛生長，對石斛的組成成分、生物活性和藥理活性等產(chǎn)生一定的影響。楊慧等[38]研究表明，鐵皮石斛內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)物可促進鐵皮石斛生長，且代謝產(chǎn)物加入的時間不同會對鐵皮石斛產(chǎn)生不同作用，具體表現(xiàn)在培養(yǎng)后期加入代謝產(chǎn)物對原球莖生長有促進作用，前期加入則對原球莖生長有抑制作用。林艷君等[39]用尖孢鐮刀菌誘導(dǎo)子處理鐵皮石斛原球莖，成功提高了石斛生物堿含量，且當誘導(dǎo)子濃度為200 mg·L-1時，總生物堿含量達到最大值，表明內(nèi)生真菌誘導(dǎo)子作為一種特定的化學(xué)信號，可以誘導(dǎo)特定基因的表達，在一定程度上影響調(diào)光系統(tǒng)，增強植物光合作用，從而活化特定的代謝途徑，促進代謝產(chǎn)物的合成和積累。

此外，內(nèi)生真菌自身也能夠產(chǎn)生與寄主植物相同或相似的代謝產(chǎn)物，可持續(xù)地獲得活性物質(zhì)，從而擺脫農(nóng)田、季節(jié)中的不利因素和病蟲害的限制。研究者從鐵皮石斛內(nèi)生真菌獲得了多種與宿主多糖結(jié)構(gòu)相似的內(nèi)生真菌多糖，具有良好的抗氧化和免疫調(diào)節(jié)活性，由于其成本效益和環(huán)境友好的特點，是極具商業(yè)競爭潛力的天然產(chǎn)物[40-47]。

綜上所述，鐵皮石斛內(nèi)生真菌的代謝產(chǎn)物不僅能促進鐵皮石斛生長，增加其藥用成分的合成與累積，更具有抗真菌、抗氧化、腫瘤抑制和免疫調(diào)節(jié)等活性，富含巨大的藥用潛能，有待科研人員對其進行多角度、多廣度、多深度的研究與應(yīng)用。

4 問題與展望

鐵皮石斛內(nèi)生真菌具有豐富的多樣性，其代謝產(chǎn)物蘊含巨大的開發(fā)潛能。已有大量的研究報道其代謝產(chǎn)物具有促生長、抗真菌、抗氧化、腫瘤抑制和免疫調(diào)節(jié)等活性。因此，研究鐵皮石斛內(nèi)生真菌及其代謝產(chǎn)物，對鐵皮石斛的實際生產(chǎn)應(yīng)用具有重要的意義和價值。

目前鐵皮石斛內(nèi)生真菌的分離鑒定方法已較為成熟，已報道的鐵皮石斛內(nèi)生真菌種類較多，但對于其內(nèi)生真菌的研究還存在以下不足：(1)隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，可以擺脫一些依靠形態(tài)學(xué)鑒定的不確定性，但對于一些難以培養(yǎng)的內(nèi)生真菌，其分離鑒定仍是一大難題；(2)初步的研究表明，內(nèi)生真菌可以促進鐵皮石斛的生長發(fā)育及協(xié)助抗病害，但對其促生及抗病機制研究較少且不深入；(3)由于內(nèi)生真菌的多樣性及復(fù)雜性，對其代謝產(chǎn)物的種類、功能及其生理活性還知之甚少，對其生物合成路徑、作用機制尚不明確。

面對這些難題，今后對于鐵皮石斛內(nèi)生真菌的研究應(yīng)包括以下幾個方面：(1)發(fā)展高通量測序技術(shù)，有針對性分離特異內(nèi)生真菌；(2)探討鐵皮石斛內(nèi)生菌與其共生關(guān)系，明確其與宿主植物相互作用的機理；(3)挖掘內(nèi)生真菌及其代謝產(chǎn)物，篩選分離出能產(chǎn)生與鐵皮石斛相同或相似生理活性成分的內(nèi)生真菌，對這些活性成分進行規(guī)?；l(fā)酵以獲取工業(yè)化生產(chǎn)的產(chǎn)物，進一步探索其生物合成途徑。

隨著鐵皮石斛產(chǎn)業(yè)飛速發(fā)展，關(guān)于其內(nèi)生真菌的研究也在逐步深入。通過開發(fā)綠色、安全、有效的內(nèi)生真菌及其代謝產(chǎn)物，拓展其在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、醫(yī)藥學(xué)材料等方面的應(yīng)用，可以為鐵皮石斛內(nèi)生真菌及其代謝產(chǎn)物的藥理作用研究和新藥開發(fā)提供參考。