PMA-qPCR方法快速檢測(cè)細(xì)菌性果斑病菌活菌的研究

郝芳敏， 丁偉紅， 馬二磊， 嚴(yán)蕾艷， 黃蕓萍， 王毓洪， 臧全宇

(寧波市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院 寧波瓜菜育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 浙江 寧波 315040)

細(xì)菌性果斑病(bacterial fruit blotch，BFB)由西瓜噬酸菌Acidovoraxcitrulli引起[1]，是在全球范圍內(nèi)危害西甜瓜產(chǎn)業(yè)的一種毀滅性細(xì)菌病害。該病害在西甜瓜整個(gè)生育期都能發(fā)生，西甜瓜的葉片、果實(shí)和幼莖都會(huì)受害，病害發(fā)生初期表現(xiàn)為葉片出現(xiàn)水漬狀斑點(diǎn)，隨后病斑擴(kuò)大變?yōu)楹稚珘乃啦“?，最后致整個(gè)葉片枯萎；果實(shí)受侵染會(huì)出現(xiàn)水浸狀凹陷斑點(diǎn)，嚴(yán)重時(shí)果實(shí)出現(xiàn)腐爛并致使種子帶菌[2]，對(duì)西甜瓜產(chǎn)業(yè)造成了極為嚴(yán)重的產(chǎn)量和經(jīng)濟(jì)損失。

細(xì)菌性果斑病是典型的種傳細(xì)菌性病害[3]，是我國(guó)的植物檢疫性病害，防治細(xì)菌性果斑病最有效的方法是生產(chǎn)和使用無(wú)菌種子，使用健康種子可以有效的降低果斑病的暴發(fā)風(fēng)險(xiǎn)[4]。因此，建立一套快速、簡(jiǎn)便、靈敏的檢測(cè)方法是當(dāng)務(wù)之急。當(dāng)前國(guó)內(nèi)外對(duì)于細(xì)菌性果斑病的檢測(cè)方法包括免疫富集PCR[5-6]、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)[7]、免疫磁性分離PCR[8-9]、免疫凝聚試紙條[10]、實(shí)時(shí)熒光定量PCR[11]等方法。然而以上方法，均不能區(qū)分檢測(cè)到的細(xì)菌性果斑病菌是活菌還是死菌，容易出現(xiàn)假陽(yáng)性，因此，急需建立一種快速有效檢測(cè)樣品中細(xì)菌性果斑病菌活菌的方法。疊氮溴化丙錠(propidium monoazide，PMA)是一種特異性的活性染料，在強(qiáng)光下與死細(xì)胞DNA進(jìn)行不可逆的共價(jià)結(jié)合，阻礙死細(xì)胞DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增[12]。使用PMA對(duì)菌懸浮液進(jìn)行預(yù)處理后提取該DNA，結(jié)合qPCR進(jìn)行擴(kuò)增。qPCR擴(kuò)增后的Ct值為活細(xì)胞的Ct值，排除了死細(xì)胞的干擾[13]。

本研究以細(xì)菌性果斑病菌的定量檢測(cè)為出發(fā)點(diǎn)，利用PMA對(duì)活/死細(xì)胞具有選擇性的特性，結(jié)合熒光定量PCR進(jìn)行細(xì)菌性果斑病菌的檢測(cè)。對(duì)PMA作用于細(xì)菌性果斑病菌的最佳濃度及曝光時(shí)間進(jìn)行摸索，然后對(duì)田間的西甜瓜種子進(jìn)行細(xì)菌性果斑病菌的活菌檢測(cè)，旨在建立一種快速、靈敏、特異性強(qiáng)且可定量檢測(cè)細(xì)菌性果斑病菌的方法。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

供試Acidovoraxcitrulli菌株pslbtw36由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所趙廷昌研究員饋贈(zèng)，供試甜瓜種子材料為田間隨機(jī)收集的西州蜜25種子。

供試菌株在LA培養(yǎng)基上活化，置于28 ℃培養(yǎng)箱24 h，挑單菌落于LB液體培養(yǎng)基，28 ℃搖培12 h。

1.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

本研究采用探針?lè)晒舛縋CR進(jìn)行檢測(cè)[14]，上游引物A.citrulli-FP：5′-CTGATAATCCTCGGC TCAACAA-3′；下游引物A.citrulli-RP：5′-TGA GCGCATTTCTGACGAG-3′；探針A.citrulli-P：FAM-AAGAAATACGCCCTCGCCAATCTCC-BHQ1[14]，對(duì)菌株pslbtw36的基因組DNA進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)，擴(kuò)增片段大小為121 bp，符合實(shí)時(shí)熒光定量PCR的擴(kuò)增條件。將A.citrulli菌株pslbtw36基因組DNA按10倍梯度依次稀釋至30 ng·μL-1、3 ng·μL-1、300 pg·μL-1、30 pg·μL-1、3 pg·μL-1、300 fg·μL-1、30 fg·μL-1和3 fg·μL-1，直接取稀釋后的1 μL基因組DNA進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，每個(gè)濃度3次重復(fù)，PCR反應(yīng)體系：1 μL DNA模板、0.4 μL正向引物A.citrulli-FP(20 μmol·L-1)、0.4 μL反向引物A.citrulli-RP(20 μmol·L-1)、10 μL 2×TransStart? Tip Green qPCR SuperMix(全式金，北京)、0.4 μL Passive Reference Dye Ⅱ，用ddH2O定容至20 μL，在PCR儀中進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性30 s；94 ℃變性5 s，50 ℃退火30 s，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)。熒光定量PCR擴(kuò)增完成后，根據(jù)Ct值與其相對(duì)應(yīng)的基因組DNA濃度對(duì)數(shù)值構(gòu)建線性回歸方程，以基因組DNA濃度的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，Ct值為縱坐標(biāo)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3 PMA-qPCR樣品前處理

PMA的配制：將PMA在黑暗條件下溶于二甲基亞砜(DMSO)溶液，配制成1 mg·mL-1的母液，用錫箔紙包裹置于-20 ℃避光保存?zhèn)溆谩?/p>

細(xì)菌性果斑病菌活菌和死菌的制備：將新鮮A.citrulli菌懸液濃度調(diào)至1×107mL-1，并將菌懸液平均分為2份，一份靜置備用，另一份置于100 ℃水浴10 min進(jìn)行熱致死，并取100 μL熱致死的菌懸液涂布于LA固體培養(yǎng)基上，置于28 ℃培養(yǎng)箱48 h，驗(yàn)證熱致死效果后備用。

PMA處理：將PMA在避光條件下加入菌懸液中，輕微振蕩混勻，在黑暗中靜置10 min，再將菌液取出開(kāi)蓋置于冰上，距離燈管15 cm，650 W鹵鎢燈持續(xù)曝光10 min使PMA光解。將處理后的菌懸液置于100 ℃水浴鍋加熱10 min以釋放DNA，再作為模板進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)。

1.4 病原菌活細(xì)胞對(duì)PMA染料的耐受能力測(cè)定

將PMA避光加入到含有500 μL濃度為1×107mL-1細(xì)菌性果斑病菌A.citrulli活細(xì)胞菌懸液的1.5 mL離心管中，使PMA的終濃度分別為0、0.5、1、3、6、9、12和24 μg·mL-1，并按照1.3做PMA的靜置、曝光處理，進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)中PMA抑制死細(xì)胞的最低濃度測(cè)定

將PMA避光加入到含有500 μL濃度為1×107mL-1的細(xì)菌性果斑病菌A.citrulli死細(xì)胞菌懸液的1.5 mL離心管中，使PMA的終濃度分別為0、0.5、1、3、6、9、12和24 μg·mL-1，并按照1.3做PMA的靜置、曝光處理，進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)。

1.6 不同曝光時(shí)間對(duì)PMA處理效果的影響

PMA染料的作用原理是在高強(qiáng)度的可見(jiàn)光曝光處理后，可與死細(xì)胞DNA進(jìn)行不可逆的共價(jià)結(jié)合，阻礙死細(xì)胞DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。為研究不同曝光時(shí)間對(duì)PMA處理效果的影響，將PMA分別避光加入到含有500 μL濃度為1×107mL-1細(xì)菌性果斑病菌A.citrulli死細(xì)胞和活細(xì)胞菌懸液的1.5 mL離心管中，使PMA的終濃度為9 μg·mL-1(經(jīng)過(guò)篩選出的最適濃度)，按照1.3節(jié)做PMA的靜置、曝光處理，分別將曝光時(shí)間設(shè)為0、1、3、5、8、10、15 min，并將處理后的菌懸液進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)。

1.7 死、活細(xì)胞混合體系的PMA-qPCR檢測(cè)

為驗(yàn)證PMA-qPCR具有區(qū)分活、死細(xì)胞的能力，將PMA-qPCR用于檢測(cè)不同比例的死、活細(xì)胞混合液。將新鮮的細(xì)菌性果斑病菌A.citrulli配制成濃度為1×106mL-1的菌懸液，并于100 ℃水浴10 min進(jìn)行熱致死，并分別加入不同濃度的新鮮活體菌懸液，使活細(xì)胞濃度占菌懸液總濃度的不同比例。活、死細(xì)胞菌懸液按照1×105∶1×105、1×104∶1×105、1×103∶1×105、1×102∶1×105、1×101∶1×105、1×100∶1×105、1×10-1∶1×105、1×10-2∶1×105等體積混合均勻后，分別用傳統(tǒng)的熒光定量PCR和PMA-qPCR檢測(cè)。PMA-qPCR需要在混合后的菌懸液中避光加入PMA，使PMA的終濃度為9 μg·mL-1(經(jīng)過(guò)篩選出的最適濃度)，按照1.3節(jié)做PMA的靜置、曝光處理，并進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)。

1.8 PMA-qPCR檢測(cè)的假陽(yáng)性驗(yàn)證

將新鮮的細(xì)菌性果斑病菌A.citrulli配制成濃度為1×104、1×103、1×102、1×101、1×100、1×10-1mL-1和1×10-2mL-1的菌懸液，在100 ℃水浴10 min進(jìn)行熱致死，分別采用傳統(tǒng)熒光定量PCR、PMA-qPCR和平板培養(yǎng)計(jì)數(shù)法進(jìn)行檢測(cè)。PMA-qPCR需要在菌懸液中避光加入PMA，使PMA的終濃度為9 μg·mL-1(經(jīng)過(guò)篩選出的最適濃度)，按照1.3節(jié)做PMA的靜置、曝光處理，并將處理后的菌懸液進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)。

1.9 自然感染甜瓜種子的PMA-qPCR檢測(cè)

為評(píng)估PMA-qPCR法在田間自然感染的甜瓜種子的檢測(cè)效果，從田間收集不同材料的甜瓜種子進(jìn)行檢測(cè)。首先每份材料取300 g的種子用pH值7.0的0.01 mol·L-1的磷酸緩沖液浸沒(méi)，室溫振蕩4 h(100 r·min-1)，再4 ℃浸泡過(guò)夜，再將浸泡液1 000 r·min-1離心1 min，去沉淀，上清液10 000 r·min-1離心10 min，棄上清，取沉淀，用無(wú)菌水進(jìn)行懸浮，制成需要體積的懸浮液。取上清置于新的1.5 mL離心管中，分為a、b、c 3份。a組不做處理，直接進(jìn)行qPCR檢測(cè)，b組用終濃度為9 μg·mL-1的PMA處理，并進(jìn)行靜置、曝光，再進(jìn)行qPCR檢測(cè)，c組置于100 ℃水浴10 min進(jìn)行熱致死處理，加入終濃度為9 μg·mL-1的PMA靜置、曝光處理，之后進(jìn)行qPCR檢測(cè)。所有樣品均要進(jìn)行細(xì)菌性果斑病的選擇培養(yǎng)基EBBA平板分離培養(yǎng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR的靈敏度檢測(cè)及標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

將細(xì)菌性果斑病菌A.citrulli基因組DNA濃度調(diào)至30 ng·μL-1，進(jìn)行10倍梯度稀釋，使?jié)舛确秶来螢?0 ng·μL-1、3 ng·μL-1、300 pg·μL-1、30 pg·μL-1、3 pg·μL-1、300 fg·μL-1、30 fg·μL-1和3 fg·μL-1。分別取1 μL不同濃度的基因組DNA作為模板進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增。結(jié)果表明，當(dāng)DNA濃度>300 fg·μL-1時(shí)，熒光定量PCR擴(kuò)增Ct值均小于35，當(dāng)濃度<300 fg·μL-1時(shí)，Ct值大于35，為無(wú)效值(圖1)。所以認(rèn)為熒光定量PCR的檢測(cè)下限為300 fg·μL-1，以A.citrulli基因組DNA濃度的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，Ct值為縱坐標(biāo)，建立回歸方程，回歸方程為y=-3.255 9x+44.614，相關(guān)系數(shù)R2=0.997 9，線性關(guān)系良好，因此，在后期研究中可根據(jù)熒光定量PCR的Ct值來(lái)計(jì)算檢測(cè)樣品對(duì)應(yīng)的基因組DNA濃度。

圖1 熒光定量PCR擴(kuò)增Acidovorax citrulli基因組DNA的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 抑制死細(xì)胞qPCR擴(kuò)增的PMA最適濃度優(yōu)化

根據(jù)PMA阻礙死細(xì)胞DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增的原理，進(jìn)行PMA處理死細(xì)胞DNA的濃度篩選，既可抑制死細(xì)胞DNA的擴(kuò)增，又不會(huì)影響活細(xì)胞DNA的擴(kuò)增。首先將細(xì)菌性果斑病菌A.citrulli菌懸液濃度調(diào)至1×107mL-1，一組做熱致死處理，另一組不做處理，分別加入不同濃度的PMA預(yù)處理，并進(jìn)行qPCR擴(kuò)增。結(jié)果表明，當(dāng)PMA終濃度≤12 μg·mL-1時(shí)，A.citrulli活細(xì)胞DNA的qPCR擴(kuò)增Ct值與不加PMA初始對(duì)照之間無(wú)顯著差異(圖2)；當(dāng)PMA終濃度≥9 μg·mL-1時(shí)，A.citrulli死細(xì)胞DNA的qPCR擴(kuò)增Ct值不再顯著升高(圖3)。因此，當(dāng)PMA終濃度為9 μg·mL-1時(shí)，既能完全抑制A.citrulli菌懸液死細(xì)胞DNA擴(kuò)增，又對(duì)活細(xì)胞DNA擴(kuò)增無(wú)顯著影響，表明PMA濃度為9 μg·mL-1時(shí)，可作為PMA-qPCR檢測(cè)區(qū)分A.citrulli的純培養(yǎng)死、活細(xì)胞的最適濃度。

柱上無(wú)相同字母者表示差異明顯(P<0.05)，圖3～5同。圖2 不同濃度PMA對(duì)細(xì)菌性果斑病菌活細(xì)胞DNA熒光定量PCR擴(kuò)增的影響

圖3 不同濃度PMA對(duì)細(xì)菌性果斑病菌死細(xì)胞DNA熒光定量PCR擴(kuò)增的影響

2.3 PMA最佳曝光時(shí)間優(yōu)化

根據(jù)PMA在強(qiáng)光下與死細(xì)胞DNA進(jìn)行不可逆的共價(jià)結(jié)合，阻礙死細(xì)胞DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增的原理，通過(guò)設(shè)置不同的曝光時(shí)間來(lái)篩選PMA預(yù)處理最佳的曝光時(shí)間。結(jié)果表明，當(dāng)曝光時(shí)間從1 min逐漸延長(zhǎng)至15 min時(shí)，PMA對(duì)活細(xì)胞DNA的qPCR擴(kuò)增均無(wú)影響(圖4)；而PMA對(duì)死細(xì)胞處理中，當(dāng)曝光時(shí)間為8 min時(shí)，可完全抑制死細(xì)胞DNA的qPCR擴(kuò)增，Ct值不再發(fā)生變化(圖5)。因此，本研究中PMA染料的曝光最佳時(shí)間為8 min，PMA的最適濃度為9 μg·mL-1，可完全抑制1×107mL-1細(xì)菌性果斑病菌A.citrulli菌懸液死細(xì)胞DNA的擴(kuò)增，且對(duì)活細(xì)胞DNA的擴(kuò)增無(wú)顯著影響。

圖4 不同PMA曝光時(shí)間對(duì)細(xì)菌性果斑病菌活細(xì)胞DNA熒光定量PCR擴(kuò)增的影響

圖5 不同PMA曝光時(shí)間對(duì)細(xì)菌性果斑病菌死細(xì)胞DNA熒光定量PCR擴(kuò)增的影響

2.4 混合體系中PMA-qPCR對(duì)活細(xì)胞的選擇性擴(kuò)增

將細(xì)菌性果斑病菌A.citrulli死細(xì)胞(1×105mL-1)與不同濃度活細(xì)胞等體積混合均勻，加入終濃度為9 μg·mL-1的PMA處理后進(jìn)行qPCR擴(kuò)增。隨著活細(xì)胞比例下降，Ct值呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢(shì)，檢測(cè)下限可達(dá)到1×103mL-1活細(xì)胞(圖6)。未經(jīng)PMA處理的死、活細(xì)胞混合體系直接進(jìn)行qPCR擴(kuò)增，無(wú)論活細(xì)胞比例如何變化，其qPCR擴(kuò)增的Ct值始終維持在一個(gè)穩(wěn)定水平，無(wú)顯著變化。因此，PMA-qPCR可以有效區(qū)分細(xì)菌性果斑病菌A.citrulli菌懸液中的死、活細(xì)胞，能夠選擇性的對(duì)活細(xì)胞DNA進(jìn)行擴(kuò)增，而傳統(tǒng)的qPCR無(wú)法區(qū)分死、活細(xì)胞，其檢測(cè)結(jié)果會(huì)對(duì)體系中的活細(xì)胞數(shù)目造成一定程度的高估。在活菌為2.0×101～2.0×106，其菌數(shù)與Ct值呈線性相關(guān)，回歸方程為y=-2.706 4x+43.404，相關(guān)系數(shù)為R2=0.982 7(圖7)。因此，可根據(jù)熒光定量PCR的Ct值來(lái)快速定量測(cè)定樣品對(duì)應(yīng)的活菌數(shù)。

柱上無(wú)相同大寫字母表示未加PMA處理間差異極顯著(P<0.01)；柱上無(wú)相同小寫字母表示加PMA處理間差異顯著(P<0.05)。圖6 活、死細(xì)胞混合體系中PMA-qPCR的選擇性擴(kuò)增

圖7 PMA-qPCR擴(kuò)增A. citrulli活菌細(xì)胞數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.5 PMA-qPCR檢測(cè)的假陽(yáng)性驗(yàn)證

為驗(yàn)證PMA-qPCR檢測(cè)方法對(duì)細(xì)菌性果斑病菌A.citrulli死細(xì)胞的檢測(cè)是否會(huì)出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果，將死細(xì)胞菌懸液設(shè)置8組不同濃度，分別進(jìn)行傳統(tǒng)熒光定量PCR、PMA-qPCR和平板培養(yǎng)計(jì)數(shù)法檢測(cè)。結(jié)果表明，當(dāng)用PMA-qPCR和平板培養(yǎng)計(jì)數(shù)法檢測(cè)8組滅活死細(xì)胞時(shí)，檢測(cè)結(jié)果均為陰性；而用傳統(tǒng)的熒光定量PCR檢測(cè)時(shí)，均能夠檢測(cè)到細(xì)菌性果斑病菌的存在(表1)。因此，在細(xì)菌性果斑病菌A.citrulli的死細(xì)胞DNA的檢測(cè)中，傳統(tǒng)的熒光定量PCR不能有效區(qū)分死、活細(xì)胞，而PMA-qPCR法僅能擴(kuò)增活細(xì)胞的DNA，未出現(xiàn)假陽(yáng)性擴(kuò)增結(jié)果；且使用平板培養(yǎng)計(jì)數(shù)法進(jìn)一步驗(yàn)證了PMA-qPCR的可靠性。

表1 不同方法對(duì)細(xì)菌性果斑病菌死細(xì)胞檢測(cè)效果比較

2.6 田間甜瓜種子的PMA-qPCR檢測(cè)

使用PMA-qPCR檢測(cè)采集的10份甜瓜種子樣品，結(jié)果表明，待測(cè)樣品中有5份可檢測(cè)到細(xì)菌性果斑病菌A.citrulli，其Ct在19.46～33.64；將5份樣品活菌濃度換算為所對(duì)應(yīng)的基因組DNA濃度，為0.023～91.2 ng·μL-1，活菌個(gè)數(shù)在1.1～3.6 mL-1。采用平板分離培養(yǎng)法檢測(cè)這5份帶有果斑病菌活菌的樣品，均能分離到A.citrulli，驗(yàn)證了PMA-qPCR檢測(cè)的準(zhǔn)確性。同時(shí)，用傳統(tǒng)qPCR法可檢測(cè)到6份甜瓜種子帶有果斑病菌A.citrulli。這10份樣品進(jìn)行熱致死處理，用PMA-qPCR檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)所有檢測(cè)結(jié)果均為陰性(表2)。因此，PMA-qPCR可快速準(zhǔn)確地檢測(cè)甜瓜種子樣品中果斑病菌的活體狀態(tài)，從而代替平板分離培養(yǎng)法。

表2 田間甜瓜種子樣品的PMA-qPCR檢測(cè)

3 討論

瓜類細(xì)菌性果斑病是世界性檢疫性細(xì)菌病害，在全世界范圍內(nèi)普遍發(fā)生，目前已成為影響我國(guó)瓜類生產(chǎn)的主要病害之一，具有發(fā)病迅速、傳播速度快、防病難等特點(diǎn)，可造成我國(guó)瓜類生產(chǎn)上巨大的經(jīng)濟(jì)損失，一旦發(fā)病將難以控制，該病原菌可通過(guò)傷口和氣孔侵染瓜類子葉和果實(shí)[15]，可通過(guò)種子攜帶傳播，是一種種傳病害，因此，需在種子源頭上進(jìn)行檢測(cè)，以減少因種傳造成的損失。

近年來(lái)，PMA-qPCR技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于多種細(xì)菌的活死菌的鑒別檢測(cè)，肖妍等[16]建立的PMA-qPCR技術(shù)能有效地用于陜西獼猴桃潰瘍菌的活死菌檢測(cè)，王帥等[17]建立了一種適于青枯菌不同小種菌株活細(xì)胞快速檢測(cè)的PMA-qPCR方法。Tian等[14]在細(xì)菌性果斑病菌A.citrulli建立的PMA-qPCR活菌檢測(cè)技術(shù)，確立了PMA終濃度為3 μg mL-1曝光時(shí)間為5 min的PMA體系，能有效抑制1.0×106mL-1滅活死菌的擴(kuò)增，對(duì)活菌的擴(kuò)增沒(méi)有影響，檢測(cè)活菌的閾值為1.0×103mL-1。本試驗(yàn)以細(xì)菌性果斑病菌A.citrulli為研究對(duì)象，通過(guò)優(yōu)化PMA處理?xiàng)l件，實(shí)現(xiàn)檢測(cè)浙江地區(qū)細(xì)菌性果斑病菌A.citrulli活菌的目的。結(jié)果表明，PMA終濃度為9 μg·mL-1，最佳曝光時(shí)間為8 min的PMA預(yù)處理體系，能有效抑制1.0×107mL-1滅活死菌的擴(kuò)增，對(duì)活菌的擴(kuò)增沒(méi)有影響，相較于Tian等[14]的研究，增加了10倍死菌的檢測(cè)范圍。當(dāng)活菌數(shù)在2.0×101～2.0×106mL-1內(nèi)，qPCR反應(yīng)體系中活菌數(shù)與Ct值呈線性相關(guān)(R2=0.982 7)，相較于Tian等[14]的研究，檢測(cè)活菌的閾值從1.0×103mL-1下降到2.0×101mL-1，可以更加有效地檢測(cè)細(xì)菌性果斑病菌的活死菌。

本文建立的PMA-qPCR方法可在一定范圍內(nèi)有效去除細(xì)菌性果斑病死菌的干擾，定量檢測(cè)出活菌數(shù)量，研究結(jié)果可為植物細(xì)菌性果斑病的流行規(guī)律研究提供新的技術(shù)支撐，為細(xì)菌性果斑病活菌檢測(cè)提供了科學(xué)的參考依據(jù)，并能有效避免PCR檢測(cè)實(shí)際樣品可能造成的假陽(yáng)性結(jié)果，為瓜類繁殖材料的帶菌檢測(cè)與細(xì)菌性果斑病防控效果評(píng)價(jià)提供可靠的技術(shù)支撐。