不同造模方式誘導(dǎo)的糖尿病小鼠肝腎組織中脂質(zhì)異位沉積情況的研究*

劉露， 扈臘英， 王貴芳， 常雪冰， 黃亞莉， 宋鈴榆， 周宇霞， 郭兵

不同造模方式誘導(dǎo)的糖尿病小鼠肝腎組織中脂質(zhì)異位沉積情況的研究*

劉露， 扈臘英， 王貴芳， 常雪冰， 黃亞莉， 宋鈴榆， 周宇霞△， 郭兵△

（貴州醫(yī)科大學(xué)病理生理學(xué)教研室/貴州省常見慢性疾病發(fā)病機(jī)制及藥物研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 貴州 貴陽 550025）

觀察比較高脂飲食（high-fat diet， HFD）、鏈脲佐菌素（streptozocin， STZ）聯(lián)合HFD（HFD/STZ）、單側(cè)腎臟切除術(shù)（unilateral nephrectomy， UNx）+HFD/STZ和/小鼠4種糖尿病模型小鼠肝腎組織中脂質(zhì)異位沉積情況。選取8周齡C57BL/6小鼠，隨機(jī)分為正常飲食（normal chow diet， NCD）組（=10）、HFD組（=10）、HFD/STZ組（=10）和UNx+HFD/STZ組（=12）。NCD組給予NCD飼養(yǎng)；HFD組、HFD/STZ組和UNx+HFD/STZ組給予HFD飼養(yǎng)，誘導(dǎo)小鼠出現(xiàn)肥胖和胰島素抵抗，且HFD/STZ組和UNx+HFD/STZ組給予55 mg/kg STZ腹腔注射，后以HFD飼養(yǎng)至40周齡。選取10周齡/小鼠和野生型小鼠各8只，NCD飼養(yǎng)至40周齡。記錄分析小鼠血糖和體重變化；收集血液樣本測(cè)定甘油三酯（triglyceride， TG）含量；肝腎組織樣本石蠟包埋后進(jìn)行蘇木精-伊紅染色觀察組織病理變化；免疫熒光染色和Western blot檢測(cè)脂滴包被蛋白2的表達(dá)；油紅O染色和尼羅紅染色觀察脂滴沉積情況。HFD組小鼠體重顯著升高（<0.05），血糖水平和血清TG含量升高不顯著（>0.05）；HFD/STZ組、Unx+HFD/STZ組及/組血糖水平和血清TG含量顯著升高（<0.05），且肝腎組織中存在大量脂質(zhì)異位沉積，均能誘導(dǎo)小鼠發(fā)生糖尿病肝腎臟損傷，其中Unx+HFD/STZ組最嚴(yán)重；HFD組腎臟未見明顯脂質(zhì)沉積，肝臟存在大量脂質(zhì)沉積。Unx+HFD/STZ組小鼠的肝腎脂質(zhì)沉積最嚴(yán)重，但存在死亡率較高、小鼠狀態(tài)差等缺點(diǎn)。單純HFD飲食的小鼠是研究非酒精性脂肪性肝病合適的模型。HFD/STZ和模型小鼠出現(xiàn)糖尿病腎臟脂毒性且呈現(xiàn)糖尿病腎病的腎臟病理改變，類似于2型糖尿病患者，適用于研究糖尿病及其并發(fā)癥。

糖尿?。恢|(zhì)沉積；脂毒性；鏈脲佐菌素；單側(cè)腎臟切除術(shù)

糖尿?。╠iabetes mellitus， DM）是一種慢性代謝性疾病，其特征是異常升高的血糖水平（高血糖癥），在大多數(shù)情況下，DM會(huì)導(dǎo)致外周組織如心血管系統(tǒng)、視網(wǎng)膜、神經(jīng)系統(tǒng)、肝臟和腎臟等發(fā)生許多的并發(fā)癥［1］。除了高血糖癥之外，其他代謝因素如游離脂肪酸（free fatty acids， FFA）水平的增加、脂聯(lián)蛋白（adiponectin）表達(dá)量的減少也會(huì)加快疾病的進(jìn)程［2］。而脂質(zhì)代謝紊亂可能導(dǎo)致大量脂質(zhì)積累，一旦超過脂肪組織的儲(chǔ)存能力，多余的脂質(zhì)將沉積到非脂肪組織如心肌、胰腺、骨骼肌、肝臟和腎臟中，激活了生脂和生糖細(xì)胞信號(hào)通路，導(dǎo)致組織細(xì)胞功能障礙，正常生理過程遭到破壞，稱為脂毒性（lipotoxicity）［3-4］。

2型糖尿?。╰ype 2 diabetes mellitus， T2DM）的發(fā)生發(fā)展與肥胖導(dǎo)致的脂肪因子水平改變有關(guān)，而肥胖和高脂血癥是慢性腎?。╟hronic kidney diseases， CKD）最常見的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，腎臟近端小管細(xì)胞更是脂質(zhì)積聚的主要部位之一，這提示腎實(shí)質(zhì)中的脂質(zhì)積聚對(duì)腎功能有害［2-3］。肝臟是一種胰島素敏感組織，可通過調(diào)節(jié)葡萄糖利用和糖異生之間的相互作用維持體內(nèi)葡萄糖水平，在糖尿病及其并發(fā)癥的病程中起著重要的作用，而胰島素抵抗也通過多種機(jī)制影響肝臟脂質(zhì)代謝，包括促進(jìn)肝臟中的脂肪從頭合成等［5］。研究表明，脂毒性可通過激活炎癥、氧化應(yīng)激、線粒體功能障礙和細(xì)胞死亡對(duì)肝、腎組織產(chǎn)生毒性作用［6-7］。

根據(jù)國際糖尿病基金會(huì)（international diabetes foundation， IDF）的數(shù)據(jù)，預(yù)計(jì)到2025年受T2DM影響的人數(shù)將增加到3.8億［8］。超過80%被診斷為T2DM的人是肥胖的，而早期DM患者，通過降低10%的體重可使肥胖個(gè)體的臨床糖尿病消失［9］。因此，研究T2DM的發(fā)病與脂質(zhì)沉積的關(guān)系尤為重要。

動(dòng)物模型是科學(xué)研究中重要的工具，為了復(fù)制與人類病程最相似的疾病動(dòng)物模型，為預(yù)防糖尿病及其并發(fā)癥提供新策略，目前常選擇小鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，其生理結(jié)構(gòu)與人類極為相似，且遺傳資源非常豐富，造模方式包括單純高脂飼料（high-fat diet， HFD）喂養(yǎng)、鏈脲佐菌素（strepyozocin， STZ）注射聯(lián)合HFD喂養(yǎng)（HFD/STZ）、/小鼠以及近年出現(xiàn)的單側(cè)腎臟切除術(shù)（unilateral nephrectomy， UNx）+HFD/STZ聯(lián)合誘導(dǎo)［10］。這些模擬人類T2DM的方法各有利弊。本研究將觀察對(duì)比以上4種不同造模方式誘導(dǎo)的DM模型小鼠肝、腎組織脂質(zhì)沉積的嚴(yán)重程度，為深入研究T2DM與脂質(zhì)沉積的關(guān)系選擇更合適的動(dòng)物模型提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材料和方法

1　材料與試劑

1.1動(dòng)物SPF級(jí)10周齡/小鼠和野生型（wild-type， WT）小鼠各8只，雄性，體重（32±5） g，購自江蘇集萃藥康生物科技股份有限公司，合格證編號(hào)為202110143；SPF級(jí)8周齡C57BL/6小鼠42只，雄性，體重（20±3） g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司，合格證編號(hào)為110322210102108625。所有動(dòng)物研究實(shí)驗(yàn)方案均經(jīng)貴州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（文件編號(hào)：2000058），并按照美國國立衛(wèi)生研究院指南進(jìn)行實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的護(hù)理和使用。所有小鼠每4～5只一籠，飼養(yǎng)在標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室條件和溫度下，可自由飲水，予正常飼料（normal chow diet， NCD）飼養(yǎng)或60 kcal%的HFD飲食。

1.2主要試劑尼羅紅（Nile red）染料（Sigma-Aldrich，貨號(hào)：19123）；抗GAPDH抗體（貨號(hào)：PMK053S）和辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG（貨號(hào)：PMK-014-090M）均購自Biopm；細(xì)胞甘油三酯（triglyceride， TG）含量酶法測(cè)定試劑盒（Applygen，貨號(hào)：E1013）；抗脂滴包被蛋白2（perilipin 2， PLIN2）抗體（Proteintech，貨號(hào)：15294-1-AP）；Smart-ECL Enhanced Solution I、II（Smart-Lifesciences，貨號(hào)：H31500-1、H31500-2）；BCA蛋白測(cè)定試劑盒（Thermo，貨號(hào)：U1289373）；Immobilon-NC轉(zhuǎn)移濾膜（Millipore，貨號(hào)：HATF00010）；RIPA裂解液（組織）（貨號(hào)：P0013B）和Western Ⅰ抗稀釋液（貨號(hào)：P0023A-100ml）均購自Beyotime；甲醇（Kermel，貨號(hào)：867-56-1）；抗熒光衰減封片劑（含DAPI）（Solarbio，貨號(hào)：S2110）；無毒快速油紅O（oil red O）染液（Jiancheng Biotech，貨號(hào)：D027-1）；Alexa FluorTM555標(biāo)記羊抗兔IgG（Invitrogen，貨號(hào)：A21429）；高脂飼料（Dyets，60 kcal%）；STZ（Aladdin，貨號(hào)：S110910）；異氟烷（RWD，貨號(hào)：R510-22）。

1.2主要儀器電泳儀電源（Liuyi Biotech，型號(hào)：DYY-7C型）；化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（Tanon，型號(hào)：ChemiDoc）；激光共聚焦顯微鏡（Olympus，型號(hào)：FV3000）；正置顯微鏡（Olympus，型號(hào)：BX53）；小鼠麻醉揮發(fā)罐（MSS，型號(hào)：MSS-3）。

2　模型構(gòu)建

2.1分組選取8周齡C57BL/6小鼠42只，隨機(jī)分組為NCD組（=10）、HFD組（=10）、HFD/STZ組（=10）和UNx+HFD/STZ組（=12）；隨機(jī)選取10周齡/小鼠8只，WT小鼠8只作為對(duì)照組。

2.2造模方法以空腹血糖濃度≥16.7 mmol/L為DM小鼠模型構(gòu)建成功［11］；NCD組始終給予NCD；HFD組自第9周起給予HFD飼養(yǎng)至40周；HFD/STZ聯(lián)合誘導(dǎo)組先予以HFD飲食喂養(yǎng)12周，小鼠出現(xiàn)胰島素抵抗且體重顯著增加后腹腔注射STZ［小鼠饑餓8 h后，以55 mg/kg的劑量腹腔注射STZ，STZ溶解于50 mmol/L檸檬酸鈉緩沖液（pH 4.4）中，每天1次，連續(xù)注射3 d，注射完畢后2 h允許進(jìn)食］，后繼續(xù)給予HFD飼養(yǎng)至40周；UNx+HFD/STZ組選擇8周齡小鼠在異氟烷麻醉狀態(tài)下行UNx，術(shù)后存活12只，術(shù)后適應(yīng)性喂養(yǎng)1周再腹腔注射STZ，劑量同上，后以HFD飼養(yǎng)至40周齡［10］，見圖1。/小鼠和WT型小鼠均以NCD飼養(yǎng)至40周。記錄分析小鼠空腹血糖（小鼠禁食10 h后，針刺取小鼠尾靜脈血，經(jīng)血糖儀測(cè)定空腹血糖值）和體重變化，采集血液樣本經(jīng)試劑盒測(cè)定甘油三酯（triglyceride， TG）含量，采集肝腎組織樣本進(jìn)行蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin， HE）染色觀察形態(tài)變化，免疫熒光（immunofluorescence， IF）染色和Western blot法檢測(cè)PLIN2的表達(dá)，oil red O染色和Nile red染色觀察脂滴沉積情況。

Figure 1.　Diagram of diabetic mouse models.

3　實(shí)驗(yàn)方法

3.1HE染色觀察各組肝、腎組織形態(tài)變化將切片放在80 ℃恒溫箱內(nèi)烤片30 min，后于二甲苯Ⅰ和Ⅱ內(nèi)分別靜置15 min脫蠟，再分別放入100%、100%、90%、80%、70%乙醇內(nèi)依次脫水各2 min，再用純水洗2 min×3次；片子置于蘇木精染液中2 min，鏡下觀察染色情況，染色效果滿意即可自來水終止染色，自來水返藍(lán)；再將片子置于伊紅染液中染色2 min，鏡下觀察，染色效果滿意即可；將切片放入70%乙醇中約3秒鐘，再依次于95%、100%和100%乙醇內(nèi)各脫水1 min，二甲苯Ⅰ和Ⅱ內(nèi)各透明5 min；中性樹膠封片，鏡下觀察。

3.2試劑盒檢測(cè)血清、肝及腎組織蛋白中TG含量組織樣本收集后，按比例每1 mg組織加20 μL裂解液，取50 mg組織勻漿后靜置裂解10 min，4 ℃、15 493×離心15 min，取上清轉(zhuǎn)移至新1.5 mL離心管中，經(jīng)BCA蛋白測(cè)定試劑測(cè)定蛋白含量，取50 μL上清于新離心管，70 ℃加熱10 min，367×室溫離心5 min，取10 μL上清或血清用96孔微板法經(jīng)酶標(biāo)儀測(cè)定值，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算TG含量（按試劑盒說明書配制工作液）。

3.3Western blot法檢測(cè)PLIN2蛋白水平組織樣本收集后，加入1 mL RIPA裂解液，冰上裂解1 h，每隔10 min渦旋震蕩一次，后4 ℃、15 493×離心15 min，棄沉淀，上清分裝保存，用BCA試劑盒測(cè)定蛋白吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算蛋白濃度，加入適量2×上樣緩沖液，充分混勻，于100 ℃中金屬浴中加熱7～10 min。所得蛋白樣品經(jīng)SDS-PAGE分離，轉(zhuǎn)膜，使用0.1% TBST配制50 g/L的脫脂牛奶封閉1 h，0.1% TBST洗膜，5 min×3次，分別孵育Ⅰ抗（GAPDH抗體，1∶5 000；PLIN2抗體，1∶1 500），4 ℃垂直搖床孵育過夜。第2天，回收Ⅰ抗后，0.1% TBST洗膜10 min×3次，常溫孵育相應(yīng)的辣根過氧化物酶標(biāo)記的Ⅱ抗（1∶8 000）1 h；0.1% TBST洗膜10 min×3次；ECL化學(xué)發(fā)光法顯色，Tanon化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)曝光。ImageJ軟件統(tǒng)計(jì)灰度值。

3.4oil red O染色觀察各組肝、腎組織中脂質(zhì)沉積情況組織樣本收集后，經(jīng)OCT于-20 ℃冷凍包埋，切片，厚度8 μm，切片恢復(fù)至室溫后，組化筆圈出組織位置，滴加油紅染料（按試劑盒配制），靜置染色15 min，PBS洗5 min×3次，擦干復(fù)染蘇木素2 min，自來水返藍(lán)10 min，擦干，封片。顯微鏡下觀察。

3.5Nile red染色觀察各組肝、腎組織中脂質(zhì)沉積情況組織樣本收集后，經(jīng)OCT于-20 ℃冷凍包埋，切片，厚度8 μm，切片恢復(fù)至室溫后，PBS洗5 min×3次，滴加Nile red染料（Nile red粉末按0.1 g/L溶解于DMSO，后使用20%甘油稀釋為0.01 mg/L即為工作液），靜置避光染色2 h，PBS避光洗5 min×3次，擦干，抗熒光淬滅封片劑（含DAPI）封片，激光共聚焦顯微鏡下觀察。

3.6IF染色觀察各組肝、腎組織中PLIN2蛋白表達(dá)情況組織樣本收集后，經(jīng)OCT于-20 ℃冷凍包埋，切片，厚度8 μm，切片恢復(fù)至室溫后，PBS洗5 min×3次，4%多聚甲醛固定15 min，PBS洗5 min×3次，0.2% Triton打孔10 min，室溫孵育Ⅰ抗（PLIN2抗體，1∶200）2 h，PBS洗5 min×3次，室溫避光孵育對(duì)應(yīng)熒光Ⅱ抗（1∶200）1 h，PBS洗5 min×3次，擦干，抗熒光淬滅封片劑（含DAPI）封片，激光共聚焦顯微鏡下觀察。

4　統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

GraphPad Prism 8.3軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。組間均數(shù)比較使用單因素方差分析及LSD-檢驗(yàn)。以<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1　各DM模型小鼠體重、血糖及血清TG變化情況

為評(píng)估DM小鼠模型構(gòu)建效果，分別記錄40周時(shí)各組DM小鼠血糖和體重變化。與WT組比較，/組血糖、體重以及血清TG含量均顯著升高（<0.05）；HFD組小鼠體重較NCD組顯著升高（<0.05），血清TG含量和空腹血糖水平無顯著差異（>0.05）；與NCD組比較，HFD/STZ和UNx+HFD/STZ組小鼠體重?zé)o顯著差異（>0.05），空腹血糖水平及血清TG含量顯著升高（<0.05），見表1。

表1　各組DM模型小鼠體重、空腹血糖水平及血清TG含量

BW： body weight； FBG： fasting blood glucose； TG： triglyceride.#<0.05WT group：*<0.05NCD group.

2　HE染色觀察各組DM模型小鼠腎組織形態(tài)變化

HE染色結(jié)果顯示，與NCD組和WT組比較，HFD組出現(xiàn)了腎小管的增生和肥大；/、HFD/STZ和UNx+HFD/STZ組偶可見蛋白管型，細(xì)胞外膜基質(zhì)增加，伴有腎小管代償性和（或）失代償性擴(kuò)張，腎間質(zhì)中存在大量淋巴細(xì)胞、單核-巨噬細(xì)胞等炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，可見局灶狀甚至片狀腎小管萎縮；UNx+HFD/STZ組存在部分腎小管腔擴(kuò)張，且可見急慢性炎癥，見圖2。

Figure 2.　The pathological changes of kidney tissues of DM mice in each group （HE staining）. Scale bar=200 μm （black） or 100 μm （red）.

3　各組DM模型小鼠腎組織中脂質(zhì)沉積情況及TG含量測(cè)定

oil red O及Nile red染色結(jié)果顯示，與NCD和WT組比較，HFD組小鼠腎組織中未見明顯脂滴沉積，而/、HFD/STZ和UNx+HFD/STZ組小鼠腎組織中存在大量脂滴沉積，其中UNx+HFD/STZ脂滴沉積較多；低倍鏡下觀察HFD/STZ和UNx+HFD/STZ組oil red O染色可見，脂滴大多沉積在腎臟皮質(zhì)與髓質(zhì)交界處，見圖3。

Figure 3.　The lipid deposition in kidney tissues of DM mice in each group. A and B： oil red O staining， scale bar=200 μm （black） or 100 μm （red）； C and D： Nile red staining， scale bar=50 μm.

IF-PLIN2和Western blot結(jié)果與oil red O染色和Nile red染色結(jié)果一致，與NCD和WT組比較，HFD組PLIN2表達(dá)量較少，/、HFD/STZ和UNx+HFD/STZ組PLIN2表達(dá)水平較高，見圖4A、B、D。經(jīng)試劑盒測(cè)定腎臟組織中TG含量，結(jié)果顯示，與NCD和WT組比較，HFD組TG含量較少，而/、HFD/STZ和UNx+HFD/STZ組TG含量較高，其中UNx+HFD/STZ組TG含量最高，見圖4C。

Figure 4.　The PLIN2 expression and TG content in kidney tissues of DM mice in each group. A and B： the expression of PLIN2 in each group was determined by IF （scale bar=50 μm）； C： the TG content in each group； D： the expression of PLIN2 was determined by Western blot. Mean±SD. n=3. **P<0.01 vs NCD group； ##P<0.01 vs WT group.

4　HE染色觀察各組DM模型小鼠肝組織形態(tài)變化

HE染色結(jié)果顯示，NCD與WT組肝臟血竇較為清晰，以中央靜脈為中心肝索呈現(xiàn)放射狀，肝細(xì)胞核位于細(xì)胞中央，細(xì)胞質(zhì)豐富且結(jié)構(gòu)清晰；HFD組肝細(xì)胞出現(xiàn)脂肪變性，肝細(xì)胞體積明顯增大，淋巴細(xì)胞、單核-巨噬細(xì)胞等炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)不明顯；/組存在輕度脂肪變性，肝細(xì)胞體積稍增大，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)不明顯；HFD/STZ組存在肝細(xì)胞點(diǎn)狀壞死和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；UNx+HFD/STZ組肝細(xì)胞體積明顯增大呈空泡狀，肝索排列紊亂，肝血竇狹窄甚至消失，少見正常肝細(xì)胞，無法判斷炎性細(xì)胞浸潤(rùn)程度，見圖5。

Figure 5.　The pathological changes of liver tissues of DM mice in each group （HE staining）. Scale bar=200 μm （black） or 100 μm （red）.

5　各組DM模型小鼠肝組織中脂質(zhì)沉積情況及TG含量測(cè)定

oil red O和Nile red染色結(jié)果顯示，NCD和WT組僅存在極少量脂滴；HFD組肝細(xì)胞內(nèi)存在大量脂滴沉積，脂滴小而多；UNx+HFD/STZ組存在大量脂滴沉積，脂滴大而多；HFD/STZ和組脂滴少且為點(diǎn)狀，見圖6。

Figure 6.　The lipid deposition in liver tissues of DM mice in each group. A and B： oil red O staining， scale bar=200 μm （black） or 100 μm （red）； C and D： Nile red staining， scale bar=50 μm.

IF-PLIN2和Western blot結(jié)果顯示，與NCD和WT組比較，UNx+HFD/STZ組PLIN2表達(dá)水平較高，HFD組次之，見圖7A、B、D。經(jīng)試劑盒測(cè)定肝臟組織蛋白中TG含量，結(jié)果顯示，與NCD和WT組比較，UNx+HFD/STZ組TG含量高于HFD組，HFD組TG含量略高于和HFD/STZ組，見圖7C。

Figure 7.　The PLIN2 expression and TG content in liver tissues of DM mice in each group. A and B： the expression of PLIN2 in each group was determined by IF （scale bar=50 μm）； C： the TG content in each group； D： the expression of PLIN2 was determined by Western blot. Mean±SD. n=3. **P<0.01 vs NCD group； ##P<0.01 vs WT group.

討論

高甘油三酯血癥（hypertriglyceridemia）是DM人群中常見的血脂異常［12-13］。TG主要儲(chǔ)存在脂滴（lipid droplets， LDs）中，其生理性脂解幾乎只發(fā)生在脂肪組織中，調(diào)節(jié)取決于能量需求。一旦該過程遭到破壞，過多的脂質(zhì)將以脂滴的形式大量積聚在非脂肪組織中（如肝臟、腎臟和心臟）［14-15］。近年來研究顯示，降脂類藥物（如貝特類、他汀類）對(duì)DM有益［16］。盡管DM患者的血脂異常不僅存在于腎臟中，還存在于腎外組織（如肝臟、胰腺和心臟）中，但肝臟和腎臟是身體中少數(shù)能夠從其他能量底物（如甘油）產(chǎn)生葡萄糖的器官［3］。因此研究DM病程中肝腎組織脂質(zhì)沉積尤為重要，選擇合適的動(dòng)物模型是其重要的部分。

本研究構(gòu)建HFD、HDF/STZ、UNx+HDF/STZ以及小鼠這4種相關(guān)的DM模型以探討選擇何種模型小鼠研究肝腎脂質(zhì)沉積最為合適。通過比較分析小鼠體重和血糖判斷DM小鼠成模情況。而PLIN2已被證明與細(xì)胞內(nèi)TG有高親和力［17-18］，TG是脂滴的主要成分，是脂質(zhì)代謝紊亂的定量蛋白［19］，所以本研究選擇通過血清TG含量、PLIN2表達(dá)水平和脂滴沉積情況評(píng)估各組小鼠肝臟、腎臟中脂質(zhì)沉積水平，為選擇更合適的動(dòng)物模型提供依據(jù)。

糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy， DN）是T2DM一個(gè)重要且日益增長(zhǎng)的并發(fā)癥，可導(dǎo)致血漿脂質(zhì)水平的惡化，是終末期腎病（end-stage renal disease， ESRD）的主要原因［20-22］。在小鼠實(shí)驗(yàn)中，持續(xù)的HFD飼養(yǎng)早期小鼠脂肪組織充分膨脹以儲(chǔ)存多余的熱量，當(dāng)超過脂肪組織的儲(chǔ)存能力，多余的脂質(zhì)可沉積到非脂肪組織（如腎臟）中［23］。而超過腎臟能量需求的FFA將酯化為TG，以LDs的形式沉積［24］。有研究表明，經(jīng)動(dòng)靜脈FFA濃度差實(shí)驗(yàn)，提示FFA增多時(shí)，腎臟可將多余脂質(zhì)轉(zhuǎn)入血液以保護(hù)腎臟，具體機(jī)制尚不清楚，理論上有可能是近端小管從初級(jí)尿液中攝取重要的親脂性化合物（如維生素）并通過脂蛋白將其運(yùn)輸回到循環(huán)中［24］。單純的HFD喂養(yǎng)可能是在小鼠中模擬早期T2DM的最佳飲食，能導(dǎo)致小鼠肥胖、輕微的高脂血癥及嚴(yán)重的胰島素抵抗和腎臟脂質(zhì)積聚，其局限性在于造模時(shí)間較長(zhǎng)且病理效果不穩(wěn)定［6］。在本研究中HFD組腎臟中尚未見明顯脂質(zhì)沉積和組織形態(tài)變化，可能與飼養(yǎng)周期尚短有關(guān)。若想模擬具有DM病理變化特征仍需注射STZ誘導(dǎo)［19］。STZ可直接破壞胰島β細(xì)胞功能，不能正常釋放胰島素，導(dǎo)致小鼠出現(xiàn)極高的血糖水平，導(dǎo)致腎臟對(duì)葡萄糖的攝取增加，同時(shí)產(chǎn)生過量的氧化劑，并削弱抗氧化機(jī)制等，引起腎小管萎縮、壞死和腎毒性，導(dǎo)致上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)分化和細(xì)胞外基質(zhì)沉積等，最后致腎實(shí)質(zhì)破壞和腎功能喪失［25-26］。在血糖升高、胰島功能破壞的雙重作用下，脂質(zhì)沉積加重，腎臟不能進(jìn)行代償，導(dǎo)致TG含量進(jìn)一步增高。而血脂異常本身不足以導(dǎo)致腎損傷，但可通過引起腎脂肪毒性直接影響腎臟，也可通過引起全身炎癥和氧化應(yīng)激、血管損傷以及激素和其他具有腎臟作用的信號(hào)分子的變化間接損傷腎臟組織及其功能［24］。故而HFD/STZ和UNx+HFD/STZ組存在大量脂質(zhì)異位沉積、腎小管的萎縮及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)等病理改變，HDF/STZ聯(lián)合誘導(dǎo)的T2DM動(dòng)物模型模擬了人類典型的自然疾病發(fā)展和代謝特征，可以有效的模擬T2DM的特征，被認(rèn)為是T2DM合適的動(dòng)物模型［5］。有研究表明，單獨(dú)UNx只誘導(dǎo)了少量的腎小球病變和輕微的腎功能下降，而STZ+UNx則具有協(xié)同作用［10］。近期有研究表明，TG水平與DN病程呈正相關(guān)［27］。且UNx+HFD/STZ小鼠胰島細(xì)胞遭到嚴(yán)重破壞，比其他組更早出現(xiàn)糖尿病表現(xiàn)［28］。在本研究中UNx+HFD/STZ誘導(dǎo)的糖尿病小鼠，不僅存在極高的血糖水平，小鼠體重減輕，糖尿病癥狀明顯，小鼠狀態(tài)較差，血清及肝腎組織中TG含量均處于較高水平，腎小球病變和腎功能減退更為迅速，病程更為嚴(yán)重，提示UNx+HFD/STZ模型鼠更適合于研究由T2DM引起的DN。而疾病晚期，小鼠精神狀態(tài)差，食欲不振，能量攝入不足，加速了蛋白質(zhì)的分解代謝，發(fā)生低蛋白血癥型營養(yǎng)不良，出現(xiàn)持續(xù)負(fù)氮平衡、腸道微生物障礙、尿毒癥毒素累積等可能是小鼠體重減輕的原因［29］。/小鼠為瘦素受體（leptin receptor，）缺陷型肥胖基因型小鼠，被認(rèn)為是較好的T2DM模型小鼠，食物攝入量增加和能量消耗減少，可出現(xiàn)高血糖癥、食欲過盛、脂肪肝、胰島素抵抗等疾病表現(xiàn)［30-31］。因此本實(shí)驗(yàn)中40周齡的/小鼠腎臟出現(xiàn)大量脂質(zhì)異位沉積以及腎小管的萎縮及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)等病理改變。

肝臟是脂肪酸代謝的中心器官，處理大量FFA，但僅以TG形式少量?jī)?chǔ)存。因此在本研究中可見WT和NCD組存在少量生理性脂質(zhì)儲(chǔ)存。由于進(jìn)食后，食物中TG主要被胰脂肪酶水解后，經(jīng)膽汁酸乳化形成乳糜微粒，轉(zhuǎn)運(yùn)到淋巴中，隨后進(jìn)入血液，導(dǎo)致餐后高血脂，故在收集血液前將小鼠禁食，自由飲水。轉(zhuǎn)運(yùn)到血漿中的FFA可被肝細(xì)胞攝取并在肝臟中重新進(jìn)行生物合成，以極低密度脂蛋白（very low-density lipoprotein， VLDL）的形式從肝臟輸出到血液中，根據(jù)能量需求經(jīng)過脂肪動(dòng)員和β氧化，為心臟、骨骼肌等提供能量，而胰島素抵抗現(xiàn)象已被證明能刺激肝細(xì)胞中TG的合成［19， 32］。在本實(shí)驗(yàn)中，可能由于飼養(yǎng)周期尚短，HFD組小鼠狀態(tài)良好，體重明顯增加，尚未出現(xiàn)明顯的高血糖癥或糖尿病并發(fā)癥，脂肪組織仍具備儲(chǔ)存FFA的能力，機(jī)體能量需求仍處于正常水平，尚未完全激活TG的分解代謝途徑，因此肝臟攝取并儲(chǔ)存了大量脂質(zhì)，而血清TG含量未見明顯升高。但在持續(xù)營養(yǎng)過剩的情況下，代謝途徑的活性改變會(huì)導(dǎo)致常見的慢性肝病——非酒精性脂肪性肝?。╪onalcohol fatty liver disease， NAFLD）［32］。近期研究表明，胰腺組織中脂肪含量的增加與肥胖程度為正相關(guān)關(guān)系，并被認(rèn)為會(huì)導(dǎo)致β細(xì)胞功能障礙，最終導(dǎo)致血糖水平惡化和治療失?。?3］。盡管如此，在小鼠DM模型的胰島組織中，少見脂滴沉積［34］。而肝臟中脂質(zhì)沉積與胰島素抵抗所引起的高胰島素血癥（hyperinsulinemia）密切聯(lián)系。T2DM的特征為相對(duì)胰島素缺乏，胰島素可抑制肝臟VLDL的產(chǎn)生和激活脂蛋白脂肪酶（lipoprotein lipase， LPL）以清除VLDL，而在胰島素嚴(yán)重缺乏的情況下，肝臟不能對(duì)高水平的FFA做出反應(yīng)［21］。LDs的巨自噬（macroautophagy）也被稱為脂噬（lipophagy）。當(dāng)LDs被運(yùn)送到自噬體，F(xiàn)FA在溶酶體加工過程中被釋放，發(fā)生脂噬的LDs隨著脂質(zhì)的分解代謝而收縮變?。?5-37］，可見自噬在減輕肥胖所致的脂肪組織慢性炎癥方面具有重要作用［38］。本實(shí)驗(yàn)各組模型小鼠肝組織中脂滴粒徑大小不一，可能與脂噬水平有關(guān)聯(lián)。HFD/STZ組小鼠體重降低，機(jī)體處于負(fù)氮平衡狀態(tài)，能量需求較大，肝臟及白色脂肪組織中儲(chǔ)存的TG分解釋放大量FFA，而機(jī)體存在組織器官的損傷，不能正常吸收利用FFA。因此該組小鼠脂質(zhì)沉積不如HFD組明顯，但血糖和血脂都處于較高水平，且存在一定程度的肝細(xì)胞損傷和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。而UNx+HFD/STZ組肝臟脂肪酸代謝平衡被嚴(yán)重破壞，脂質(zhì)沉積對(duì)機(jī)體無特異性損害，脂毒性通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、氧化應(yīng)激和線粒體損傷，最終處于脂毒性狀態(tài)的肝細(xì)胞發(fā)生凋亡，肝組織結(jié)構(gòu)遭到嚴(yán)重破壞［2］，導(dǎo)致血清、肝腎組織中TG含量均進(jìn)一步積累，最終發(fā)生嚴(yán)重的高甘油三酯血癥。/小鼠是較好的T2DM模型小鼠，因存在高血糖癥和高胰島素血癥，肝臟TG含量顯著增加，可能是由于基因的缺失，攝食過量而消耗過低，導(dǎo)致大量脂質(zhì)儲(chǔ)存。

綜上所述，UNx+HFD+STZ組小鼠肝、腎組織中脂滴沉積較HFD/STZ和/組顯著，且出現(xiàn)DM及其并發(fā)癥的典型表現(xiàn)特征，肝腎脂質(zhì)沉積及病理學(xué)改變最嚴(yán)重，但存在死亡率較高、小鼠狀態(tài)差等缺點(diǎn)。單純HFD飲食的小鼠肝臟中脂質(zhì)沉積較多，是研究NAFLD合適的模型。HFD/STZ和/模型小鼠出現(xiàn)典型糖尿病表現(xiàn)，肝腎組織中存在大量脂質(zhì)沉積以及DN的腎臟病理改變，類似于T2DM患者，適用于研究DM及其并發(fā)癥。

［1］ Demir S， Nawroth PP， Herzig S， et al. Emerging targets in type 2 diabetes and diabetic complications［J］. Adv Sci （Weinh）， 2021， 8（18）：e2100275.

［2］ Mota M， Banini BA， Cazanave SC， et al. Molecular mechanisms of lipotoxicity and glucotoxicity in nonalcoholic fatty liver disease［J］. Metabolism， 2016， 65（8）：1049-1061.

［3］ Opazo-Rios L， Mas S， Marin-Royo G， et al. Lipotoxicity and diabetic nephropathy： novel mechanistic insights and therapeutic opportunities［J］. Int J Mol Sci， 2020， 21（7）：2632.

［4］ Nishi H， Higashihara T， Inagi R. Lipotoxicity in kidney， heart， and skeletal muscle dysfunction［J］. Nutrients， 2019， 11（7）：1664.

［5］ Kim DY， Kim SR， Jung UJ. Myricitrin ameliorates hyperglycemia， glucose intolerance， hepatic steatosis， and inflammation in high-fat diet/streptozotocin-induced diabetic mice［J］. Int J Mol Sci， 2020， 21（5）：1870.

［6］ Gai Z， Wang T， Visentin M， et al. Lipid accumulation and chronic kidney disease［J］. Nutrients， 2019， 11（4）：722.

［7］ Yang P， Xiao Y， Luo X， et al. Inflammatory stress promotes the development of obesity-related chronic kidney disease via CD36 in mice［J］. J Lipid Res， 2017， 58（7）：1417-1427.

［8］ Muthulakshmi S， Saravanan R. Efficacy of azelaic acid on hepatic key enzymes of carbohydrate metabolism in high fat diet induced type 2 diabetic mice［J］. Biochimie， 2013， 95（6）：1239-1244.

［9］ Malone JI， Hansen BC. Does obesity cause type 2 diabetes mellitus （T2DM）？ Or is it the opposite？［J］. Pediatr Diabetes， 2019， 20（1）：5-9.

［10］ Uil M， Scantlebery AML， Butter LM， et al. Combining streptozotocin and unilateral nephrectomy is an effective method for inducing experimental diabetic nephropathy in the 'resistant' C57BL/6J mouse strain［J］. Scientific Reports， 2018， 8（1）：5542.

［11］ Barriere DA， Noll C， Roussy G， et al. Combination of high-fat/high-fructose diet and low-dose streptozotocin to model long-term type-2 diabetes complications［J］. Sci Rep， 2018， 8（1）：424.

［12］ Kane JP， Pullinger CR， Goldfine ID， et al. Dyslipidemia and diabetes mellitus： role of lipoprotein species and interrelated pathways of lipid metabolism in diabetes mellitus［J］. Curr Opin Pharmacol， 2021， 61：21-27.

［13］ Wu L， Parhofer KG. Diabetic dyslipidemia［J］. Metabolism， 2014， 63（12）：1469-1479.

［14］ Walther TC， Chung J， Farese RV Jr. Lipid droplet biogenesis［J］. Annu Rev Cell Dev Biol， 2017， 33：491-510.

［15］ Ryden M， Arner P. Subcutaneous adipocyte lipolysis contributes to circulating lipid levels［J］. Arterioscler Thromb Vasc Biol， 2017， 37（9）：1782-1787.

［16］ Sobczak AIS， Blindauer CA， Stewart AJ. Changes in plasma free fatty acids associated with type-2 diabetes［J］. Nutrients， 2019， 11（9）：2022.

［17］ Najt CP， Lwande JS， Mcintosh AL， et al. Structural and functional assessment of perilipin 2 lipid binding domain（s）［J］. Biochemistry， 2014， 53（45）：7051-7066.

［18］ Mcmanaman JL， Bales ES， Orlicky DJ， et al. Perilipin-2-null mice are protected against diet-induced obesity， adipose inflammation， and fatty liver disease［J］. J Lipid Res， 2013， 54（5）：1346-1359.

［19］ Verges B. Pathophysiology of diabetic dyslipidaemia： where are we？［J］. Diabetologia， 2015， 58（5）：886-899.

［20］ Glastras SJ， Chen H， Teh R， et al. Mouse models of diabetes， obesity and related kidney disease［J］. PLoS One， 2016， 11（8）：e0162131.

［21］ Hirano T. Pathophysiology of diabetic dyslipidemia［J］. J Atheroscler Thromb， 2018， 25（9）：771-782.

［22］ Samsu N. Diabetic nephropathy： challenges in pathogenesis， diagnosis， and treatment［J］. Biomed Res Int， 2021， 2021：1497449.

［23］ Heydemann A. An overview of murine high fat diet as a model for type 2 diabetes mellitus［J］. J Diabetes Res， 2016， 2016：2902351.

［24］ Bobulescu IA. Renal lipid metabolism and lipotoxicity［J］. Curr Opin Nephrol Hypertens， 2010， 19（4）：393-402.

［25］ Fischer AW， Cannon B， Nedergaard J. Leptin： is it thermogenic？［J］. Endocr Rev， 2020， 41（2）：232-260.

［26］ 吳藝璇， 彭維艷， 劉露， 等. 淫羊藿苷通過AMPK減輕脂肪酸誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞線粒體損傷［J］. 中國病理生理雜志， 2022， 38（1）：113-121.

Wu Yx， Peng WY， Liu L， et al. Icariin attenuates fatty acid-induced mitochondrial damage in renal tu?bular epithelial cells through AMPK signaling pathway［J］. Chin J Pathophysiol， 2022， 38（1）：113-121.

［27］ Chen D， Sun H， Lu C， et al. The association between hypertriglyceridemic-waist phenotype and chronic kidney disease： a cohort study and meta-analysis［J］. Sci Rep， 2022， 12（1）：1935.

［28］ Park KM， Hussein KH， Nam HS， et al. A novel mouse model of diabetes mellitus using unilateral nephrectomy［J］. Lab Anim， 2016， 50（2）：88-93.

［29］ Zha Y， Qian Q. Protein nutrition and malnutrition in ckd and esrd［J］. Nutrients， 2017， 9（3）：208.

［30］ Maekawa M， Maekawa T， Sasase T， et al. Pathophysiological analysis of uninephrectomizedmice as a model of severe diabetic kidney disease［J］. Physiol Res， 2022， 71（2）：209-217.

［31］ Berger C， Heyne HO， Heiland T， et al. A novel compound heterozygous leptin receptor mutation causes more severe obesity than inleprmice［J］. J Lipid Res， 2021， 62：100105.

［32］ Alves-Bezerra M， Cohen DE. Triglyceride metabolism in the liver［J］. Compr Physiol， 2017， 8（1）：1-8.

［33］ Inaishi J， Saisho Y. Beta-cell mass in obesity and type 2 diabetes， and its relation to pancreas fat： A mini-review［J］. Nutrients， 2020， 12（12）：3846.

［34］ Tong X， Dai C， Walker JT， et al. Lipid droplet accumulation in human pancreatic islets is dependent on both donor age and health［J］. Diabetes， 2020， 69（3）：342-354.

［35］ Filali-Mouncef Y， Hunter C， Roccio F， et al. The menage a trois of autophagy， lipid droplets and liver disease［J］. Autophagy， 2022， 18（1）：50-72.

［36］ Singh R， Kaushik S， Wang Y， et al. Autophagy regulates lipid metabolism［J］. Nature， 2009， 458（7242）：1131-1135.

［37］ Walther TC， Farese RV Jr. Lipid droplets and cellular lipid metabolism［J］. Annu Rev Biochem， 2012， 81：687-714.

［38］ 趙艷利， 毛雨， 康志強(qiáng)， 等. 瓜蔞皮提取物通過調(diào)控PI3K/AKT信號(hào)通路介導(dǎo)的自噬而減輕肥胖小鼠慢性炎癥［J］. 中國病理生理志， 2022， 38（1）：96-104.

Zhao YL， Mao Y， Kang ZQ， et al. Fructus Trichosanthis peel extract attenuates chronic inflammation inobese mice by regulating PI3K/AKT signaling pathway-mediated autophagy［J］. Chin J Pathophysiol， 2022， 38（1）：96-104.

Comparative study on lipid deposition in liver and kidney tissues of diabetic mice induced by different modeling methods

LIU Lu， HU Laying， WANG Guifang， CHANG Xuebing， HUANG Yali， SONG Lingyu， ZHOU Yuxia△， GUO Bing△

（，，550025，）

To observe the lipid deposition in liver and kidney tissues of diabetic mice.Diabetes mellitus models were induced by high-fat diet （HFD）， streptozocin （STZ） combined with HFD （HFD/STZ）， unilateral nephrectomy （Unx）+HFD/STZ and/mice. Eight-week-old C57BL/6 mice were randomly divided into normal chow diet （NCD） group （=10）， HFD group （=10）， HFD/STZ group （=10）， and Unx+HFD/STZ group （=12）. The mice in NCD group were fed with NCD. The mice in HFD group， HFD/STZ group and Unx+HFD/STZ group were fed with HFD. The mice in HFD/STZ group and Unx+HFD/STZ group were injected with STZ （55 mg/kg） and then continuously fed with HFD until to the 40th week. Ten-week-old/and wild-type mice （=8） were fed with NCD until to the 40th week. Blood glucose level， body weight and serum triglyceride （TG） level of each group were detected. Tissue sections of the liver and kidney were made via dehydration and paraffin embedding. After hematoxylin-eosin staining， the histopathological changes of the liver and kidney tissues were observed by microscopy. The expression of perilipin 2 was detected by immunofluorescence staining and Western blot. Lipid deposition was observed by oil red O staining and Nile red staining.In HFD group， the body weight of the mice was significantly increased （<0.05）， but the level of blood glucose and the content of serum TG were not significantly increased （>0.05）. In HFD/STZ group， Unx+HFD/STZ group andgroup， both blood glucose level and serum TG content were significantly increased （<0.05）， lipid deposition and tissue damage were observed in the liver and kidney tissues. The lipid deposition in the liver and kidney tissues was the most obvious in Unx+HFD/STZ group. In HFD group， lipid deposition was observed in the liver but not in the kidney.In the liver and kidney tissues， the lipid deposition is the most obvious in Unx+HFD/STZ group， but there are some shortcomings such as high mortality and poor state of mice. The HFD model is an ideal model to study nonalcohol fatty liver disease. The HFD/STZ andmodels are ideal models to study diabetes mellitus and its complications， which display lipotoxicity in the kidney， accompanied with the typical renal pathological changes of diabetic nephropathy， similar to the pathological change of type 2 diabetes mellitus patients.

diabetes mellitus； lipid deposition； lipotoxicity； streptozotocin； unilateral nephrectomy

R587.2； R363.2

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2023.02.010

1000-4718（2023）02-0276-11

2022-09-19

2022-11-03

［基金項(xiàng)目］國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（No. 82000741； No. 32160207）；貴州省科技廳計(jì)劃項(xiàng)目（黔科合基礎(chǔ)-ZK［2021］一般402號(hào)）；中國博士后科學(xué)基金資助項(xiàng)目（No. 2020M683374）；貴州省教育廳青年科技人才成長(zhǎng)項(xiàng)目（黔科KY字［2021］170號(hào)）；貴州醫(yī)科大學(xué)優(yōu)秀青年人才計(jì)劃（No. 2021105）

周宇霞 Tel： 18750238963； E-mail： zhouyuxia_27@163.com； 郭兵 Tel： 13908518950； E-mail： guobingbs@126.com

（責(zé)任編輯：宋延君，羅森）