類器官培養(yǎng)技術(shù)在呼吸系統(tǒng)疾病中的應(yīng)用*

李曉娜， 齊先梅， 張?zhí)锾穑?王婧

類器官培養(yǎng)技術(shù)在呼吸系統(tǒng)疾病中的應(yīng)用*

李曉娜， 齊先梅， 張?zhí)锾穑?王婧△

（中國醫(yī)學(xué)科科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院，北京 100010）

類器官；呼吸系統(tǒng)疾??；干細(xì)胞

呼吸系統(tǒng)主要負(fù)責(zé)人體與外界的氣體交換，包括上呼吸道和下呼吸道。上呼吸道由鼻、咽和喉組成，下呼吸道從近端到遠(yuǎn)端由氣管、支氣管、細(xì)支氣管和肺泡組成。氣管和支氣管由假復(fù)層纖毛柱狀上皮、基底細(xì)胞、杯狀細(xì)胞和棒狀細(xì)胞組成；細(xì)支氣管除了上述細(xì)胞外，還有肺神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞；肺泡則主要由肺泡I型上皮細(xì)胞（alveolar type I cells， AT1）和肺泡II型上皮細(xì)胞（alveolar type II cells， AT2）組成。AT1扁而寬大，參與構(gòu)成氣-血屏障；AT2為立方形或圓形，主要功能為分泌表面活性物質(zhì)，降低肺泡表面張力，維持肺泡形態(tài)。呼吸系統(tǒng)的病變會導(dǎo)致多種臨床癥狀：咳嗽、氣喘、呼吸困難、呼吸衰竭、胸痛等，給患者帶來嚴(yán)重負(fù)擔(dān)。

類器官，又稱3D組織培養(yǎng)物，是由體外干細(xì)胞生長而成的三維組織衍生物，具有特定器官的多種關(guān)鍵細(xì)胞類型和相似的組織結(jié)構(gòu)，可以重現(xiàn)該器官的功能。更多的數(shù)據(jù)證明，相比傳統(tǒng)的2D細(xì)胞培養(yǎng)模式，3D細(xì)胞培養(yǎng)更能模擬體內(nèi)的組織情況，在結(jié)構(gòu)和細(xì)胞信號傳導(dǎo)方面都與體內(nèi)情況更加相似，在作為疾病模型進(jìn)行分子機(jī)制研究和藥物分析、甚至發(fā)展再生器官移植方面都有著巨大的潛力［1］。類器官的概念最早在1946年提出，用于描述囊性畸胎瘤［2］。2009年，Sato等［3］利用Lgr5+上皮細(xì)胞培養(yǎng)出無間質(zhì)隱窩-絨毛結(jié)構(gòu)類器官，此后，這一技術(shù)飛速發(fā)展，建立了多種腸道疾病模型，例如腸癌、小腸囊性纖維化、小腸感染性疾病、克羅恩病、潰瘍性結(jié)腸炎等，為相應(yīng)的疾病研究提供了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

在這篇綜述中，我們將對近年來類器官的發(fā)展及其在肺癌、肺纖維化和肺部感染性疾病的研究進(jìn)展做出總結(jié)，為今后類器官在呼吸系統(tǒng)疾病中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 肺類器官的發(fā)展歷程

2012年，Wong等［4］第一次描述了使用氣液界面培養(yǎng)的方法，由誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（induced pluripotent stem cells， iPSCs）培養(yǎng)出肺類器官。2015年，Dye等［5］報(bào)道了由人類多能干細(xì)胞（human pluripotent stem cells， hPSCs），包括胚胎多能干細(xì)胞（embryonic pluripotent stem cells， ESCs）和iPSC，培養(yǎng)出了人肺類器官（human lung organoids， HLOs），在培養(yǎng)過程中干細(xì)胞經(jīng)歷了內(nèi)胚層-前腸內(nèi)胚層-腹側(cè)前前腸球體各個(gè)階段。它的組織結(jié)構(gòu)與肺類似，擁有近端氣道的結(jié)構(gòu)和遠(yuǎn)端氣道的上皮結(jié)構(gòu)，包括氣道樣上皮、基底細(xì)胞、未成熟的纖毛細(xì)胞、包裹上皮細(xì)胞的肌成纖維細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞，還有未成熟的肺泡樣區(qū)域，類似于胎兒肺，可用于研究肺發(fā)育及作為疾病模型。2017年，Tan等［6］第一次嘗試以成人來源的細(xì)胞培養(yǎng)類器官，該研究證明，將成人的支氣管上皮細(xì)胞、肺成纖維細(xì)胞和肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞放置在恰當(dāng)?shù)娜S組織培養(yǎng)環(huán)境中，細(xì)胞將迅速自排列成為離散的上皮和內(nèi)皮結(jié)構(gòu)，且在結(jié)構(gòu)與功能上具有穩(wěn)定性。2019年，Miller等［7］通過將hPSCs進(jìn)行3個(gè)階段的培養(yǎng)，獲得了肺芽類器官與肺類器官。2020年，Salahudeen等［8］通過人肺組織獲得成體干細(xì)胞，培養(yǎng)出了肺類器官。

2 肺類器官的培養(yǎng)方法

類器官的細(xì)胞來源有兩個(gè)方面，一是多能干細(xì)胞，包括ESCs以及iPSCs，通過添加不同的細(xì)胞培養(yǎng)基、基質(zhì)膠、細(xì)胞因子、小分子化合物誘導(dǎo)其向特定器官的方向進(jìn)行分化，經(jīng)各個(gè)發(fā)育階段后分化為各種細(xì)胞；二是成體干細(xì)胞，包括基底細(xì)胞、分泌細(xì)胞和AT2。從組織活檢或手術(shù)切除的標(biāo)本中取出部分組織，在相應(yīng)環(huán)境下直接培養(yǎng)，使其生長為與其來源類似的組織結(jié)構(gòu)，該方法培養(yǎng)的類器官與干細(xì)胞來源類器官的形態(tài)和功能相似。

2.1胚胎干細(xì)胞來源肺類器官的培養(yǎng)方法由胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)得到肺類器官需要3個(gè)階段。第一階段hPSCs經(jīng)Activan A培養(yǎng)4 d后向內(nèi)胚層分化；第二階段改用Noggin、SB431542、SMO激動劑、FGF4和CHIR99021處理3 d，前腸形成前腸球體；第三階段將球狀的前腸球體分離至兩種不同條件的基質(zhì)膠滴，即將基質(zhì)膠滴在培養(yǎng)皿形成的半球結(jié)構(gòu)狀培養(yǎng)基中培養(yǎng)，分別形成肺類器官與肺芽類器官。前腸球體在添加FBS與FGF10的基質(zhì)膠中培養(yǎng)得到肺類器官，其具有氣道樣結(jié)構(gòu)、周圍間質(zhì)和肺泡祖細(xì)胞。前腸球體在添加FGF7、ATRA、CHIR99021和Step 20B的基質(zhì)膠中培養(yǎng)得到肺芽尖類器官，針穿處理得到均質(zhì)的肺芽尖端祖細(xì)胞，未針穿處理得到具有遠(yuǎn)端-近端之分的肺芽狀結(jié)構(gòu)［7］。

2.2成體干細(xì)胞來源肺類器官的培養(yǎng)方法機(jī)械分離距離臟胸膜1 cm處的人肺組織，用豬彈性蛋白酶，脫氧核糖核酸酶和Normocin洗滌孵育，得到成體干細(xì)胞，在添加-乙酰半胱氨酸、1× B27、NOGGIN（BMP拮抗劑）、EGF和TGF-β抑制劑A83-01的DMEM/F12培養(yǎng)基中培養(yǎng)，經(jīng)攪拌、過濾、裂解紅細(xì)胞等步驟后，用10倍體積的降生長因子基底膜提取物Ⅱ重懸，將混懸液以50 μL液滴置于24孔板。單細(xì)胞測序顯示培養(yǎng)出的細(xì)胞包括SFTPC+的AT2細(xì)胞、KRT5+的基底細(xì)胞、SCGB1A1+的Club細(xì)胞。以初始細(xì)胞分裂率計(jì)算，培養(yǎng)的基底肺類器官擴(kuò)張上限為219（524 288倍），肺泡擴(kuò)張上限為216（65 536倍）［8］。Zhang等［9］分離小鼠原代肺泡細(xì)胞，使用SV40大T抗原的逆轉(zhuǎn)錄病毒進(jìn)行處理，產(chǎn)生非致瘤性且保持長期活性的肺泡細(xì)胞，進(jìn)一步篩選AT2亞群，建立肺類器官，證明其能具有AT2細(xì)胞特性，可用于建模肺部疾病。

3 類器官在呼吸系統(tǒng)疾病中的應(yīng)用

由于類器官具有多種細(xì)胞類型及部分組織結(jié)構(gòu)，它被廣泛的應(yīng)用于各類疾病的研究。而在呼吸系統(tǒng)中，主要應(yīng)用于肺癌、肺部感染性疾病、肺纖維化疾病中。肺類器官用于呼吸系統(tǒng)疾病的機(jī)制及藥物篩選的相關(guān)研究，對進(jìn)一步對這些疾病有更深刻的認(rèn)識，提供了有力的支撐。

3.1類器官在肺癌中的應(yīng)用肺癌是最常見的癌癥，也是男性癌癥的主要原因，肺癌有多種類型，突變模式也多種多樣，這使得肺癌的研究與治療具有很大的難度。目前，在癌癥研究領(lǐng)域應(yīng)用的體外疾病模型主要有2D細(xì)胞培養(yǎng)癌細(xì)胞株、人源腫瘤異種移植模型（patient-derived tumor xenograft， PDXs）和腫瘤類器官（patient-derived organoids， PDOs）。癌細(xì)胞株具有操作簡單、成本較低的優(yōu)點(diǎn)，但由于其采用細(xì)胞二維培養(yǎng)的方式，使得肺癌的異質(zhì)性這一復(fù)雜特征得不到體現(xiàn)。PDXs是通過將患者腫瘤移植到免疫缺陷小鼠中得到的，在組織結(jié)構(gòu)上對原發(fā)性癌癥有著很大程度的還原，但由于其成本高昂、建模周期長且成功率不高而有所限制。目前，類器官已投入到多種癌癥的研究中，包括胃腸癌［10］、膀胱癌［11］、乳腺癌［12］等。PDOs是將患者癌組織培養(yǎng)成相應(yīng)的組織團(tuán)塊，與PDXs相比有它不可替代的優(yōu)勢：即建模成功率更高、建模時(shí)間更快以及成本更低。Weeber等［13］研究證實(shí)，PDOs在至少大塊癌癥組織的DNA水平上表現(xiàn)出原發(fā)腫瘤的特點(diǎn)；Sato等［14］發(fā)現(xiàn)，PDOs除了構(gòu)建時(shí)間較短外，在長時(shí)間的擴(kuò)張下依然能保持遺傳和形態(tài)上的穩(wěn)定。這些發(fā)現(xiàn)為腫瘤類器官的應(yīng)用提供了可靠的依據(jù)。Kim等［15］通過開發(fā)一種由于缺乏Wnt3a和Noggin而抑制正常細(xì)胞生長的基本培養(yǎng)基，創(chuàng)建了80個(gè)肺癌類器官樣本庫，包括5種肺癌亞型（腺癌、鱗癌、小細(xì)胞癌、腺鱗癌和大細(xì)胞癌）。這些肺癌類器官（lung cancer organoids， LCOs）維持著親本癌組織的遺傳特征，在HE染色與免疫組化分析中表現(xiàn)出與親本癌組織相似的形態(tài)及組織結(jié)構(gòu)，也能夠表達(dá)對應(yīng)各自組織類型的腫瘤標(biāo)志物，且形態(tài)學(xué)在培養(yǎng)長達(dá)超過6個(gè)月的情況下都沒有發(fā)生任何變化，進(jìn)一步采用小的活檢組織也得到了相應(yīng)的LCOs，證明臨床樣本也可以培養(yǎng)產(chǎn)生類器官。此外，將23個(gè)患者的上皮細(xì)胞樣本同時(shí)進(jìn)行2D細(xì)胞培養(yǎng)PDXs與LCOs，結(jié)果顯示2D細(xì)胞培養(yǎng)成功率最高（100%），LCOs培養(yǎng)的成功率（87%）高于PDXs（3%），但LCOs培養(yǎng)所需時(shí)間（4周），明顯短于PDXs（3～6月），總的來說，從建模成功率、建模時(shí)間、建模成本三個(gè)方面，肺類器官優(yōu)勢明顯［15］。不僅如此，將PDOs移植到免疫缺陷小鼠體內(nèi)時(shí)，依然能夠成功構(gòu)建PDXs。

此外，除了肺癌造模方面的優(yōu)勢，肺類器官在肺癌的機(jī)制研究中也做出了相應(yīng)的貢獻(xiàn)：Lazarus等［16］開發(fā)了一種敲除基因的基底細(xì)胞的肺類器官，并且證明了是一種鱗癌基因。在藥物研究方面，具有人體生理結(jié)構(gòu)，并且可由患者組織直接培養(yǎng)的肺類器官具有篩選治療藥物的作用［17］。源于患者的肺類器官可以作為藥物高通量篩選或個(gè)體化用藥的藥物效果檢測手段［18］。肺類器官與其他新技術(shù)的結(jié)合也使研究方法更為多樣化：Hai等［19］使用CRISPR-Cas9技術(shù)對小鼠來源的肺類器官進(jìn)行基因重編輯，刪除多個(gè)腫瘤抑制基因，通過與患者來源的細(xì)胞系進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)其在基因與表型水平上與人類肺鱗狀細(xì)胞癌相接近，并以此模型闡明免疫檢查點(diǎn)阻斷與DNA損傷誘導(dǎo)療法治療人類肺鱗狀細(xì)胞癌的假說。

相比2D細(xì)胞與PDXs，PDOs無疑是更為理想的癌癥模型，但是在指導(dǎo)臨床決策方面依然面臨挑戰(zhàn)。第一，PDOs與腫瘤的一致性目前尚無法確認(rèn)是主克隆還是亞克隆，難以避免腫瘤異質(zhì)性的問題，對治療的準(zhǔn)確性有所影響。第二，PDOs的技術(shù)難度相對較高且技術(shù)相對不成熟，前期投入成本較高，難以普遍投入研究，對治療的廣泛性有所影響。因此，細(xì)化PDOs中腫瘤發(fā)生過程、降低前期相應(yīng)研究成本則是PDOs所面臨的挑戰(zhàn)。

3.2類器官在肺部感染性疾病中的應(yīng)用肺部感染性疾病即肺炎，由病原體感染導(dǎo)致，包括病毒、細(xì)菌、真菌和寄生蟲，常導(dǎo)致發(fā)熱、咳嗽和咳痰等臨床癥狀，部分病原體還可通過呼吸道飛沫傳播，造成不同程度的流行，對公共衛(wèi)生安全造成威脅。我們對近年來肺類器官在肺部感染性疾病中的研究進(jìn)行總結(jié)，包括新型冠狀病毒、呼吸道合胞病毒、隱孢子蟲和腸道71型病毒等導(dǎo)致的肺炎。

3.2.1新型冠狀病毒?。╟oronavirus disease 2019， COVID-19）為了研究COVID-19的發(fā)病機(jī)制，Han等［20］利用hPSCs培養(yǎng)出包括AT1、AT2、基質(zhì)細(xì)胞、增殖細(xì)胞、少量神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞及氣道上皮細(xì)胞的類器官，接種嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒2（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-COV-2）24 h后，在感染的肺類器官中檢測到大量復(fù)制的病毒RNA，證實(shí)用肺類器官可建立COVID-19疾病模型。此外，SARS-COV-2感染的肺類器官基因集富集分析發(fā)現(xiàn)IL-17的信號通路發(fā)生改變，且可誘導(dǎo)多種趨化因子包括CXCL2、CCL2、CXCL3等上調(diào)，這些結(jié)果都與COVID-19患者肺組織發(fā)生的分子改變一致［20］。Salahudeen等［8］培養(yǎng)了一種來源于成人AT2或Krt5+基底層細(xì)胞的遠(yuǎn)端肺類器官，對基底層來源的類器官進(jìn)行單細(xì)胞測序后發(fā)現(xiàn)，有一部分ITGA6+、ITGB4+有絲分裂的細(xì)胞，其中TNFRSF12Ahi的部分展現(xiàn)出豐富的克隆活性，這為培養(yǎng)遠(yuǎn)端肺類器官的來源細(xì)胞有指導(dǎo)意義。接著他們制作了尖端外極性的類器官，即將SARS-COV-2的作用靶點(diǎn)血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2（angiotensin-converting enzyme 2， ACE2）暴露于外表面，對SARS-COV-2的感染有了更準(zhǔn)確的研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Club細(xì)胞在COVID-19中是重要的作用靶點(diǎn)。同樣的，Pei等［21］使用人的ESCs來源的肺類器官發(fā)現(xiàn)其能夠支持SARS-COV-2完成完整的感染與傳播，SARS-COV-2能夠感染它的纖毛細(xì)胞、棒狀細(xì)胞和AT2。在COVID-19的治療方面，Han等［20］利用類器官建立的COVID-19疾病模型對化學(xué)分子進(jìn)行高通量篩選，確定了2種美國食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)的治療COVID-19的候選藥物：伊馬替尼和麥考酚酸。接著，Han等［22］又通過使用hPSCs建立了SARS-COV-2易感的肺及腸的相應(yīng)類器官，通過對美國食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)的相應(yīng)藥品進(jìn)行高通量篩選，進(jìn)一步確定了伊馬替尼、霉酚酸和鹽酸阿那平可以作為SARS-COV-2的抑制劑。Samuel等［23］則通過培養(yǎng)人類胚胎干細(xì)胞來源的肺類器官，證明抗雄激素藥物可以減少ACE2的表達(dá)，降低男性對SARS-COV-2的易感性。在COVID-19的相關(guān)研究中，類器官不僅在建模方面提供了可靠的方式，避免了物種差異引起的研究偏差，也通過高通量篩選的方式在治療中提供了積極的提示。

3.2.2呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus， RSV）感染RSV是多見于新生兒及6個(gè)月以下嬰兒下呼吸道感染的RNA病毒，以飛沫和密切接觸傳播，主要靶點(diǎn)為假復(fù)層纖毛上皮細(xì)胞，造成下呼吸道上皮細(xì)胞的腫脹、脫落并因此阻塞小氣道，造成細(xì)支氣管炎及肺炎，導(dǎo)致呼吸困難。臨床上，這種疾病尚缺特效的治療方法［24］。目前沒有可供研究RSV感染的疾病模型，而肺類器官經(jīng)歷了肺發(fā)育中的各個(gè)階段，更接近發(fā)育中的肺，對兒童呼吸道感染疾病的研究而言是更好的病理生理研究模型。Chen等［25］通過建立肺芽類器官，觀察呼吸道合胞病毒對類器官的感染是否具有人體感染的特征，研究顯示，RSV會造成肺芽類器官氣道上皮細(xì)胞的腫脹及脫落，這與先前在人類氣道上皮細(xì)胞系研究以及病理標(biāo)本中的表現(xiàn)一致，證明了以肺芽類器官作為載體研究呼吸道合胞病毒的可行性。Porotto等［26］使用RSV感染源自hPSCs的肺類器官，同樣發(fā)現(xiàn)受感染細(xì)胞脫落進(jìn)入肺腔；當(dāng)感染副流感病毒后，全基因組測序表明病毒基因不會出現(xiàn)其他模型中發(fā)生的改變，核苷酸一致性不會由于選擇壓力而發(fā)生改變，進(jìn)一步證實(shí)模型的特異性。然而以肺類器官探索RSV的機(jī)制以及治療方面還有待深入的研究。在RSV的相關(guān)研究中，肺類器官在建立可靠的研究模型上提供了重要的方式，接近發(fā)育肺的狀態(tài)更符合其感染模式，為后續(xù)的機(jī)制探究提供了可能。

3.2.3隱孢子蟲感染隱孢子蟲病是一種人獸共患寄生蟲病，感染呼吸道表現(xiàn)為劇烈呼吸道癥狀。對免疫力低下的人群老人，幼兒，孕婦甚至有著致命的威脅，1986年被世界衛(wèi)生組織定為懷疑艾滋病的指標(biāo)之一。然而，目前所存在的體外寄生蟲-病原體相互作用系統(tǒng)由于可培養(yǎng)時(shí)間較短，難以完整的模擬隱孢子蟲在人體內(nèi)的感染周期，使研究其病理生理機(jī)制遇到阻礙。類器官由于其可在體外培養(yǎng)時(shí)間較長，能夠作為寄生蟲感染方面的疾病模型。Heo等［27］發(fā)現(xiàn)隱孢子蟲可以感染腸道和肺類器官，證明隱孢子蟲主要作用于分化的小腸細(xì)胞，將隱孢子蟲的感染階段卵囊微注射入類器官，免疫熒光共染和透射電子顯微鏡顯示其在小腸類器官中可以完成有性及無性生殖階段；在類器官中生命周期所形成的卵囊也被證明具有與動物來源相似的感染能力。無獨(dú)有偶，Dutta等［28］開發(fā)了隱孢子蟲感染至肺類器官中的方法，用微注射使得隱孢子蟲在可以在體外實(shí)驗(yàn)中成功完成整個(gè)生命周期，這使得肺部寄生蟲病的研究在尋找合適的體外疾病模型上取得了進(jìn)步。與呼吸道胞病毒相同，以肺類器官探索隱孢子蟲感染的相關(guān)機(jī)制及治療還有待進(jìn)一步探索。在隱孢子蟲感染的相關(guān)研究中，肺類器官能夠完成體外隱孢子蟲完整的感染周期，使得對該疾病的研究取得了階段性的突破。

3.2.4腸道71型病毒（enterovirus 71， EV71）感染EV71主要感染腸道及呼吸道，以糞口途徑和飛沫傳播，導(dǎo)致腹瀉以及呼吸道癥狀，同時(shí)會在腸道及呼吸道復(fù)制進(jìn)入血液進(jìn)行其他部位的二次感染，例如神經(jīng)系統(tǒng)。肺水腫以及肺部病變在EV71致死病例中是常見的［29］。然而，小鼠模型，例如常用的hSCARB2轉(zhuǎn)基因小鼠并不能很好的模擬EV71在腸道及呼吸道中的復(fù)制，這使EV71感染宿主細(xì)胞的研究阻力重重［30］。Van等［31］使用氣道類器官，對EV71感染人氣道進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)VP1-145為EV1感染的關(guān)鍵因素，并第一次在人體模型中證明這種病毒應(yīng)變依賴的復(fù)制動力學(xué)特征。在EV71感染的相關(guān)研究中，肺類器官能夠模擬人體內(nèi)感染EV71的過程，更為準(zhǔn)確的疾病類型的建立，為進(jìn)一步的研究提供了可能。

感染性疾病需要研究細(xì)胞-病原體間的相互作用的方式，類器官則成為觀察這一現(xiàn)象的絕佳選擇，在感染性疾病中有很大的研究空間，但是依然存在不足。第一，感染性疾病不只感染肺部，往往伴隨著其他器官的變化。以COVID-19為例，多器官衰竭是重癥患者的最后結(jié)局，想要發(fā)現(xiàn)這個(gè)過程中各個(gè)器官及系統(tǒng)的相互作用，類器官則無法滿足。隱孢子蟲及EV71感染也對胃腸道有著不可忽視的強(qiáng)烈作用，不同類型的類器官模型在此種情況下將難以建立聯(lián)系，且在人體內(nèi)，不同器官間的聯(lián)系主要通過血液和淋巴循環(huán)建立，類器官缺乏相應(yīng)循環(huán)組成也成為形成這一問題的關(guān)鍵點(diǎn)。第二，疫苗作為感染性疾病的重要預(yù)防方式，現(xiàn)階段依然主要依賴動物模型，類器官在此方向還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不足。

3.3類器官在肺纖維化中的應(yīng)用肺纖維化是一種肺組織在損傷后，肺部纖維化的肺間質(zhì)疾病。特發(fā)性肺纖維化（idiopathic pulmonary fibrosis， IPF）是致死性最強(qiáng)的肺纖維化疾病，有“類腫瘤疾病”之稱，病因尚不明確，最終使肺走向衰竭的道路［32］。相關(guān)動物模型主要包括藥物誘導(dǎo)、吸入粉塵，基因工程實(shí)現(xiàn)，但是在時(shí)間持續(xù)性、纖維化確診指標(biāo)、病理特點(diǎn)上都不能復(fù)制人類肺纖維化。IPF在病理學(xué)上表現(xiàn)為成纖維細(xì)胞大量增殖及膠原過度沉積，另外AT2也在IPF中發(fā)揮作用［33］。目前，類器官在肝纖維化［34］和囊性纖維化［35］的研究中都有所應(yīng)用，除了重現(xiàn)器官的結(jié)構(gòu)及功能，還能夠展現(xiàn)細(xì)胞與細(xì)胞、細(xì)胞與細(xì)胞基質(zhì)間的相互作用，在纖維化研究中有著獨(dú)特的優(yōu)勢。

Hermansky-Pudlak綜合征（Hermansky-Pudlak syndrome， HPS）相關(guān)性間質(zhì)性肺炎（HPS-associated interstitial pneumonia ， HPSIP），即HPS相關(guān)的基因隱性突變導(dǎo)致的間質(zhì)性肺炎，是一種類似于IPF的臨床實(shí)體，它們有重疊的表達(dá)特征。Xu等［36］發(fā)現(xiàn)在HPSIP與IPF的成人患者中，有異常近端標(biāo)志物的共表達(dá)。Strikoudis等［37］通過全基因組表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)HPSIP與IPS纖維化特征的一致性，在類器官中引入HPSIP相關(guān)的HPS突變都會引起纖維化發(fā)生，證明源自hPSCs的類器官可以作為纖維化肺疾病的模型，同時(shí)該研究還發(fā)現(xiàn)IL-11可能在肺纖維化過程中起到關(guān)鍵作用，可以作為治療纖維化的藥物靶點(diǎn)。這些證據(jù)使得HPSIP成為代替IPF研究的一種方式。除此之外，Suezawa等［38］通過使用hPSCs及原代人肺成纖維細(xì)胞建立了博來霉素誘導(dǎo)的肺纖維化模型。Wilkinson等［39］使用三維工程技術(shù)，將細(xì)胞黏附到肺泡囊模板上，通過旋轉(zhuǎn)重疊的作用實(shí)現(xiàn)組織結(jié)構(gòu)，在TGF-β的刺激下，形成明顯的瘢痕結(jié)構(gòu)，而這一現(xiàn)象在二維細(xì)胞中則不會出現(xiàn)。

類器官為IPF提供了更為精準(zhǔn)的研究模型，重現(xiàn)了IPF中經(jīng)典的瘢痕結(jié)構(gòu)，人源模型也消除了物種差異帶來的附加影響，避免了通過IPF動物模型得出的相關(guān)線索在人體試驗(yàn)中往往失敗的情況。肺類器官創(chuàng)建了IPF模型的長期培養(yǎng)，為慢性IPF的研究提供了可能，解除了目前體外IPF的研究局限于急性研究的窘境。作為IPF模型，肺類器官依然存在局限性：（1）IPF多發(fā)于中老年人，需要類器官有更高的成熟度才與疾病狀況更為吻合；（2）由于IPF病因未明，類器官培養(yǎng)過程又有多種補(bǔ)充劑的參與，對IPF的發(fā)生有更精確的定義才能避免添加物的干擾。

4　總結(jié)與展望

作為干細(xì)胞領(lǐng)域近十年的研究熱點(diǎn)，類器官研究有著非常廣闊的發(fā)展前景。在藥物篩選方面，類器官的三維結(jié)構(gòu)較普通的細(xì)胞二維培養(yǎng)更接近人體的真實(shí)狀態(tài)，也有望作為精準(zhǔn)醫(yī)療篩選藥物的方法，對藥物使用的臨床前研究有著積極的意義；在疾病模型建立、機(jī)制研究方面，類器官能夠體現(xiàn)細(xì)胞-細(xì)胞、細(xì)胞-微環(huán)境，細(xì)胞-病原體的相互作用，因此，類器官可以建立個(gè)體化疾病模型以及發(fā)展個(gè)體化治療；在器官移植方面，雖然目前發(fā)展類器官移植還存在許多需要克服的困難，相信在未來的研究取得一步步的進(jìn)展后，類器官將有希望解決目前肺臟移植資源短缺的問題，挽救更多人的生命。另一方面，類器官但仍然存在許多挑戰(zhàn)。第一，人體是一個(gè)多器官多系統(tǒng)的復(fù)雜結(jié)構(gòu)，而類器官缺乏神經(jīng)、循環(huán)與免疫結(jié)構(gòu)，也無法進(jìn)行不同類器官間的共同建模，單一的器官不能準(zhǔn)確表示器官所處的實(shí)際環(huán)境。不過，最近Skylar-Scott等［40］通過使用嵌入3D打印技術(shù)將血管通道引入3D組織中，Workman等［41］發(fā)現(xiàn)了具有功能性腸神經(jīng)系統(tǒng)的多能干細(xì)胞衍生組織，這些新的技術(shù)和發(fā)現(xiàn)使這一難題有了解決的希望。第二，由ESCs以及iPSCs培育而來的類器官尚欠成熟，更接近于胎兒狀態(tài)，對于成人疾病的相關(guān)研究可能尚有不足。不過，Dye等［42］發(fā)現(xiàn)hPSC發(fā)展的HLOs體外培養(yǎng)時(shí)類似人胎肺組織，移植到免疫缺陷小鼠體內(nèi)后更像成人肺，而將HLOs置于生物人工微孔聚丙交酯-乙交酯支架，然后體內(nèi)移植能夠得到分泌細(xì)胞分化程度更高的肺上皮，接近天然成人肺；Magro-Lopez等［43］發(fā)現(xiàn)使用含有地塞米松的混合物（包含CHIR99021、FGF10、KGF、IBMX和8-bromo-cAMP）處理的肺及氣道上皮后，可使肺芽類器官成熟，具有更高級更復(fù)雜的結(jié)構(gòu)，這些研究可能在一定程度上對這一類器官欠成熟的解決有所幫助。第三，類器官的生長主要由已知肺發(fā)育相關(guān)的體外因子刺激產(chǎn)生，但對未知的發(fā)育環(huán)節(jié)尚不清楚，而目前其主要依賴于3D基質(zhì)膠培養(yǎng)，其中加入的動物成分不僅限制了培養(yǎng)條件，也造成了類器官在形狀、大小、組成上的異質(zhì)性。最近，Loebel等［44］使用了物理化學(xué)性質(zhì)較為穩(wěn)定的水凝膠培養(yǎng)人iPCSs衍生的AT2，發(fā)現(xiàn)其不僅能保持AT2的特性，還能降低肺類器官的異質(zhì)性，有望解決這一問題?？偠灾?，類器官的出現(xiàn)的確具有重大的意義，但是距離完全模擬體內(nèi)環(huán)境狀態(tài)仍然需要更多的探索。

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Application of organoid culture technology in respiratory diseases

LI Xiaona， QI Xianmei， ZHANG Tiantian， WANG Jing△

（，，100730，）

Organoid culture is a new biological technology， with significantly higher success rates and lower costs compared with the traditional 2D culture techniques. Organoids provide a new model for the study of organ development and disease as well as drug discovery. In this review， the research progress of organoids in respiratory diseases， such as lung cancer， pulmonary fibrosis and pulmonary infectious diseases， is summarized， and prospects of organoid application are discussed for the further study of respiratory diseases.

organoids； respiratory diseases； stem cells

R-33； R318.13； R56

A

10.3969/j.issn.1000-4718.2023.02.020

1000-4718（2023）02-0366-07

2022-07-15

2022-10-12

［基金項(xiàng)目］國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（No. 2021YFC2500700）；中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)（No. 2021RC310002）

Tel： 010-69156477； E-mail： wangjing@ibms.pumc.edu.cn

（責(zé)任編輯：余小慧，羅森）