孫佳培，彭 偉，西 娜，謝聰欽

1.中國人民解放軍總醫(yī)院第四醫(yī)學(xué)中心骨科醫(yī)學(xué)部派駐第八醫(yī)學(xué)中心，北京 100091; 2.中國人民解放軍總醫(yī)院第四醫(yī)學(xué)中心骨科醫(yī)學(xué)部關(guān)節(jié)外科，北京 100048； 3.河北北方學(xué)院，河北 張家口 076250； 4.中國人民解放軍總醫(yī)院醫(yī)療保障中心藥劑科，北京 100853

道路交通傷、工傷、軍事訓(xùn)練傷等直接和間接暴力因素均會導(dǎo)致骨缺損。調(diào)查結(jié)果顯示，骨折不愈合和骨缺損是骨科創(chuàng)傷中最具挑戰(zhàn)性的臨床問題之一，骨折后骨不連或骨缺損的發(fā)生率逐漸增加[1]。研究表明免疫排斥導(dǎo)致骨移植物的不愈合、延遲愈合和成骨脆弱是多種移植方式失敗的首要原因，失敗率在10%～50%[2]。脫細(xì)胞骨基質(zhì)(aceller bone matrix,ACBM)作為骨組織工程領(lǐng)域中少數(shù)保留骨小梁等自體骨結(jié)構(gòu)的同時(shí)又具有天然孔隙率、去除免疫原性的支架材料，本身具備其他材料沒有的優(yōu)勢。去除細(xì)胞成分的ACBM主要成分是無機(jī)物和膠原[3]，在未來骨缺損修復(fù)研究領(lǐng)域具有較好的發(fā)展前景。近三十年，人們不斷地嘗試采用不同的技術(shù)和方法將具有各自特性的物質(zhì)元素與ACBM相復(fù)合，有效地改善單一材料誘導(dǎo)成骨能力差、復(fù)合材料強(qiáng)度低和骨細(xì)胞增殖分化緩慢等缺點(diǎn)，制成多功能復(fù)合材料應(yīng)用于骨缺損臨床治療，推進(jìn)了修復(fù)骨缺損研究的進(jìn)展。

ACBM復(fù)合材料滿足理想骨移植物四項(xiàng)基本條件[4]:(1)彈性模量和正常組織接近，避免骨折和應(yīng)力遮擋;(2)骨傳導(dǎo)、骨誘導(dǎo)和組織相容性好，有利于骨愈合；(3)能夠逐漸降解和吸收，并被正常骨組織替代；(4)移植物低免疫原性，不與宿主發(fā)生免疫排斥反應(yīng)。排除傳統(tǒng)的骨移植方式，骨組織工程ACBM材料具有良好生物性能和理化性能，能保持骨骼結(jié)構(gòu)完整、機(jī)械力學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定并降低骨抗原性。本綜述對近幾年ACBM復(fù)合材料的代表性研究進(jìn)行分類回顧，列舉相應(yīng)的臨床實(shí)驗(yàn)，并根據(jù)目前的研究發(fā)展對ACBM復(fù)合材料的研究方向進(jìn)行綜述。

1 ACBM與有機(jī)骨材料復(fù)合

有機(jī)骨材料主要包括高分子材料和復(fù)合材料，高分子材料分為天然和人工合成材料，ACBM與高分子材料復(fù)合形成新型骨缺損修復(fù)材料，具有來源廣泛易獲取、方便加工、性質(zhì)穩(wěn)定、降解周期可以調(diào)節(jié)等特性，研究發(fā)現(xiàn)新型材料具備良好的成骨效應(yīng)和生物相容性，能夠達(dá)到骨組織工程對骨修復(fù)的要求[5]。

1.1ACBM與殼聚糖(chitosan，CS)復(fù)合 CS是殼質(zhì)的N-去乙?；a(chǎn)物，是一種類似纖維樣的熱塑性聚合物，可被殼聚糖酶和氨基葡萄糖酶降解為葡萄糖。在過去的幾十年里，CS因其生物相容性、生物降解性、低毒性和與細(xì)胞外基質(zhì)的相似性而在骨組織工程中引起廣泛的關(guān)注[6]，有利于新骨形成后復(fù)合材料的降解。劉昊[7]運(yùn)用聯(lián)合脫細(xì)胞方法處理豬股骨干獲得ACBM，定性分析之后，采用冷凍干燥法和溶液共混制得ACBM-殼聚糖(ACBM-CS)支架，并對復(fù)合支架的組織學(xué)、免疫組織化學(xué)、掃描電鏡、孔隙率、力學(xué)性能等進(jìn)行分析，結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)組數(shù)據(jù)均在理想范圍，符合構(gòu)建工程骨復(fù)合材料的基本條件，滿足人工骨移植治療的要求。對復(fù)合材料進(jìn)行熱原試驗(yàn)、細(xì)胞毒性試驗(yàn)和細(xì)胞-支架粘附復(fù)合培養(yǎng)顯示材料具有良好的生物相容性，支架細(xì)胞長勢良好，能夠在短時(shí)間內(nèi)誘導(dǎo)新骨形成。因此ACBM-CS復(fù)合材料擁有良好的骨缺損修復(fù)潛力。

1.2ACBM同RGD肽復(fù)合 RGD肽別名精氨酰-甘氨酰-天冬氨酸，廣泛存在于細(xì)胞外基質(zhì)蛋白中，如纖維連接蛋白、玻璃體蛋白、骨橋蛋白和骨涎蛋白。可以與整合素細(xì)胞表面受體相互作用，啟動(dòng)細(xì)胞黏附和細(xì)胞擴(kuò)散。在骨組織工程應(yīng)用中，研究表明RGD序列表面修飾能增強(qiáng)骨髓基質(zhì)細(xì)胞黏附，促進(jìn)體外成骨細(xì)胞分化，在體內(nèi)刺激骨形成[8]。Zhang等[9]在ACBM-RGD肽支架上接種骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cell，BMSC)，利用RGD肽能夠提高間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells,MSCs)的黏附率的特性，觀察通過RGD 肽表面修飾的 ACBM 是否促進(jìn)了組織工程骨的生長效率。通過一系列實(shí)驗(yàn)室操作將RGD肽共價(jià)偶聯(lián)到ACBM支架上，暴露的天冬氨酸和谷氨酸的羧基團(tuán)用適當(dāng)體積的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳化二亞胺鹽酸鹽(EDC)和1-羥基吡咯烷-2,5-二酮(NHS)激活并在室溫磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffer saline，PBS)中溶解15min，抗黏附多肽(GRGDS)在室溫PBS中孵育2h，并在風(fēng)干之前徹底沖洗ACBM支架盤以去除多余的EDC/NHS，通過以上操作調(diào)整表面RGD適宜的濃度。利用流式技術(shù)對接種到ACBM-RGD肽支架和天然ACBM支架表面的 MSCs的細(xì)胞附著進(jìn)行量化， 結(jié)果顯示，在 3 、6 、12h，ACBM-RGD肽支架上黏附的MSCs的百分比分別是天然ACBM支架上的1.23、2.74和2.17倍,并且原生ACBM支架上的MSCs基本是球形且分布較少，相較于RGD肽修飾的ACBM支架上細(xì)胞分布廣泛。對RGD肽共價(jià)偶聯(lián)的ACBM支架進(jìn)一步分析，結(jié)果表明RGD肽共價(jià)偶聯(lián)對ACBM支架進(jìn)行的是有效修飾，促進(jìn)了MSC的初始附著、擴(kuò)散和黏附形成。同時(shí)RGD序列促進(jìn)了骨化信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的啟動(dòng)，導(dǎo)致MSC增殖增加。由此可見，用RGD肽修飾功能性ACBM可以有效地促進(jìn)MSCs在ACBM上的黏附，從而達(dá)到促進(jìn)成骨作用，是改善最終細(xì)胞-材料相互作用的可行方法，可作為組織工程骨在臨床應(yīng)用中的新思路進(jìn)一步探索。

2 ACBM與無機(jī)金屬材料復(fù)合

無機(jī)材料種類豐富，生物學(xué)性能多樣，和ACBM復(fù)合的無機(jī)材料可以概括為以下幾類：生物陶瓷(如β-磷酸三鈣 β-TCP、多晶氧化鋁、單晶氧化鋁等)，碳基材料(如石墨碳、碳納米管、玻璃碳、介孔二氧化硅)，金屬(如Sr、Zn、Mg、Ai)，金屬氧化物(如Fe3O4、TiO2、Na2O等)，非金屬(如C、F、Si)等。研究發(fā)現(xiàn)，將ACBM與無機(jī)材料復(fù)合，可以進(jìn)一步增強(qiáng)ACBM的機(jī)械性能，賦予新的促成骨效應(yīng)。

2.1ACBM與鎂合成復(fù)合材料 ACBM與鎂形成的復(fù)合材料除了具備ACBM硬度高的優(yōu)點(diǎn)，研究表明，Mg2+對骨修復(fù)的初始促成骨益處可以超越其負(fù)面影響，一方面增強(qiáng)成骨細(xì)胞作用，另一方面降低破骨細(xì)胞活動(dòng)[10-12]，并且微環(huán)境中Mg2+的濃度越高，對原位骨再生的促進(jìn)能力也越強(qiáng)，功能原理主要是通過刺激成骨細(xì)胞分化和BMSC的增殖[13]。同樣要注意純鎂材料的缺點(diǎn)是在體內(nèi)快速降解，會導(dǎo)致與新骨的形成過程不匹配[14]。利用鎂離子這一特性，李彪等[15]制備出添加鎂離子的脫細(xì)胞牛骨基質(zhì)(acellular bovine bone matrix，ABBM)復(fù)合材料。首先剔除軟組織的新鮮牛股骨，采用高速切割機(jī)切割獲得小立方體狀骨松質(zhì)，經(jīng)過高壓水槍去除血液以及骨髓后置于-80℃下、70℃超聲振蕩等處理，清洗后置于冷凍干燥機(jī)進(jìn)行凍干。最后浸泡在含鎂溶液中，滅菌后得到復(fù)合了鎂離子的ABBM。對ABBM-Mg復(fù)合材料的性能進(jìn)行檢測，X射線衍射分析表明浸泡鎂離子溶液后ABBM中的成分分布有所差別，主要成分是羥基磷灰石，和Ofudje等[16]及Predoi等[17]的實(shí)驗(yàn)結(jié)論相同；掃描電鏡和能譜儀觀察對比ABBM微細(xì)結(jié)構(gòu)、抗壓強(qiáng)度、三維孔隙結(jié)構(gòu)等發(fā)現(xiàn)復(fù)合前后并未有明顯改變，即復(fù)合材料前ACBM所具有的成骨優(yōu)點(diǎn)仍然存在，材料中的Mg2+在體外緩慢釋放，維持了微環(huán)境Mg2+濃度的穩(wěn)定，有助于持續(xù)穩(wěn)定發(fā)揮促成骨作用。研究表明，鎂離子結(jié)合ABBM所形成的復(fù)合材料可以有效促進(jìn)BMSC的增殖，解決了ABBM單個(gè)材料骨誘導(dǎo)性低的缺陷，為無機(jī)金屬材料參與骨缺損復(fù)合材料的制備開辟了良好開端。

2.2ACBM與鍶(Sr)合成復(fù)合材料 在過去幾十年中，各種生物活性因子已被認(rèn)為具有改善生物醫(yī)學(xué)材料生物性能和治療的潛力，尤其是在混合和無機(jī)材料領(lǐng)域。這些存在人體中的生物活性因子，因?yàn)榛瘜W(xué)穩(wěn)定性和低成本性而吸引人們進(jìn)一步探索。微量元素鍶具有骨跟蹤特性，在骨消化及代謝上具有雙重效果：一方面促進(jìn)骨祖細(xì)胞的分化增殖，另一方面阻止破骨細(xì)胞的終末分化。動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，鍶可以增加新骨形成[18-20]，并有實(shí)驗(yàn)表明，摻入Sr的Ca-Si基生物陶瓷(MSCs)支架可以提高骨質(zhì)疏松性骨間充質(zhì)干細(xì)胞(OVX BMSCs)的成骨和血管生成標(biāo)志物的表達(dá)水平[21]，同樣經(jīng)鍶摻雜處理后，ACBM的生物活性和礦物沉積速率也有所提高[22]。

Huang等[23]基于鍶元素通過離子交換摻入十分耗時(shí)的特性，考慮到復(fù)雜的骨組織結(jié)構(gòu)和苛刻的裝飾條件(如高溫、酸性pH下，生物化學(xué)成分尤其是生長因子和羥基磷灰石容易被破壞)，開發(fā)了一種簡單易行的涂裝方法，用于在溫和條件下進(jìn)行ACBM表面裝飾。羧甲基纖維素(carboxymethyl cellulose，CMC)是一種具有良好生物相容性、優(yōu)異的親和性和較強(qiáng)的離子螯合能力的陰離子多糖。研究表明，CMC不會對骨植入物的骨誘導(dǎo)性產(chǎn)生不利影響[24-25]。另一物質(zhì)多巴胺(dopamine，DOPA)同樣具有良好的生物相容性和良好的粘附能力，被認(rèn)為是生物材料表面修飾的理想黏附分子[26]。將Sr在溫和條件下同CMC和DOPA合成有機(jī)涂層復(fù)合材料CMC-DOPA-Sr，ACBM浸入DOPA溶液，然后在真空爐(中國上海躍進(jìn))中干燥，將聚多巴薄膜涂覆到ACBM涂層表面，最終獲得ACBM-Sr復(fù)合支架，兩者的結(jié)合彌補(bǔ)了ACBM作為骨缺損修復(fù)支架的低成骨誘導(dǎo)性。利用ICP-OES光譜法(Vista-MPX，USA)測量發(fā)現(xiàn)ACBM-Sr支架表現(xiàn)出持續(xù)的鍶離子釋放曲線，保證了治療環(huán)境中持續(xù)穩(wěn)定的鍶離子環(huán)境。此外，將復(fù)合支架材料植入小鼠皮下模型中組織相容性良好，未發(fā)生排斥反應(yīng)。支架組織學(xué)染色顯示，所有支架的大孔中均發(fā)現(xiàn)豐富的纖維結(jié)締組織。生長培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，測定人BM-MSCs的成骨基因表達(dá)情況， ACBM-Sr涂層組較ACBM相比，包括Runx2、骨保護(hù)素和骨橋蛋白在內(nèi)的成骨基因的表達(dá)顯著增加。這些結(jié)果表明，ACBM-Sr支架促進(jìn)體外成骨分化，為ACBM可復(fù)合多種材料提供了一種簡單而溫和的可行性方案，針對具有復(fù)雜結(jié)構(gòu)和易損部位的修復(fù)提供了新的選擇。

3 ACBM與組織細(xì)胞聯(lián)合形成的骨材料

骨組織工程主要分為三部分：種子細(xì)胞、復(fù)合支架和生長活性調(diào)節(jié)因子。種子細(xì)胞在組織工程中的作用位居首位，一般來說，具有免疫反應(yīng)弱、增值能力強(qiáng)、抗原性低、分化潛能大等特點(diǎn)，最重要的是能夠建立穩(wěn)定的細(xì)胞系[27]。不同種子細(xì)胞和ACBM結(jié)合后形成的支架材料特點(diǎn)具有多樣性。

3.1ACBM與誘導(dǎo)成骨樣細(xì)胞的復(fù)合材料 近年來，隨著骨缺損患者的增多，人們與骨組織工程的關(guān)系越來越密切，研究人員進(jìn)一步將視線轉(zhuǎn)移到BMSC強(qiáng)大的增殖分化能力上，通過體外誘導(dǎo)BMSC獲得的成骨樣細(xì)胞被應(yīng)用于骨組織工程。李康杰[28]設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)誘導(dǎo)形成成骨樣細(xì)胞，誘導(dǎo)后的細(xì)胞種植到ACBM，兩種材料的復(fù)合證明體外誘導(dǎo)的細(xì)胞與大鼠股骨ACBM具有一定的相容性，為進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)打下基礎(chǔ)。滅菌殺毒后的ACBM用PBS沖洗，浸入L-DMEM培養(yǎng)液中，然后置于含有CO2的培養(yǎng)箱中，一段時(shí)間后取出，在24孔板中分別培養(yǎng)24、48、72h。將分化來的細(xì)胞按照一定的濃度種植到ACBM，放入培養(yǎng)箱，獲得供移植使用的骨修復(fù)材料。掃描電鏡觀察誘導(dǎo)分化的細(xì)胞分布勻稱，長勢良好，形態(tài)無顯著差異。實(shí)驗(yàn)中將先前制備好的帶有成骨樣細(xì)胞的ACBM植入Welis大鼠股骨模型，微型接骨板固定，10mL氨芐西林沖洗骨缺損處。8周后對大鼠股骨缺損處采用熒光顯微鏡觀察、HE和甲苯胺藍(lán)染色等處理，結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組生成的新骨較對照組多，生成新骨速度快且長勢良好，結(jié)果表明，添加了生物活性細(xì)胞的ACBM較單純ACBM修復(fù)具備更強(qiáng)的促進(jìn)骨形成的能力，ACBM和誘導(dǎo)成骨樣細(xì)胞復(fù)合材料在骨修復(fù)領(lǐng)域中具有廣闊的發(fā)展前景，同BMSC其他誘導(dǎo)分化細(xì)胞是否具有同樣功能值得更深層次的探索。

3.2ACBM與兔胎兒成骨細(xì)胞的復(fù)合材料 一項(xiàng)研究將胎兒成骨細(xì)胞與成人原代成骨細(xì)胞和骨髓骨祖細(xì)胞的增殖能力進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)胎兒成骨細(xì)胞以更高的速度增殖，堿性磷酸酶表達(dá)水平更高，是真正的成骨細(xì)胞祖細(xì)胞[29]，此外胎兒細(xì)胞還具有良好的免疫調(diào)節(jié)活性[30]。根據(jù)這一研究結(jié)論，Rashmi等[31]將牛股骨通過冷凍-解凍循環(huán)方法制備異種脫細(xì)胞骨移植基質(zhì)，在妊娠21d健康新西蘭白兔進(jìn)行原代成骨細(xì)胞培養(yǎng)及脫細(xì)胞基質(zhì)上細(xì)胞接種，剖宮產(chǎn)后，在全麻下用6mg/kg甲苯噻嗪肌肉注射，10min后用60mg/kg氯胺酮誘導(dǎo)胎仔，無菌1%PBS環(huán)境下采集兔胎兒。將胎兒顱骨和長骨切成小塊，骨片經(jīng)過處理后，第20天細(xì)胞開始從骨片中爬出，將細(xì)胞顆粒懸浮液浮在培養(yǎng)基中，并接種在每個(gè)支架上，放置在37℃由5%CO2組成的增濕大氣中保存。掃描電鏡觀察脫細(xì)胞支架孔隙結(jié)構(gòu)清晰，孔隙連通性良好，支架中成骨細(xì)胞在基質(zhì)粘附均勻緊密，膠原纖維排列不規(guī)則，波浪交叉成網(wǎng)狀。在低倍鏡下，新鮮松質(zhì)骨孔隙模糊，高倍鏡下，能夠觀察到排列較整齊，緊密且扁平的膠原纖維。利用多種注射技術(shù)將成骨細(xì)胞主動(dòng)接種到支架上后，可以在相差顯微鏡下觀察到增殖旺盛的細(xì)胞活動(dòng)。綜上所述，脫細(xì)胞牛松質(zhì)基質(zhì)同兔胎兒成骨細(xì)胞復(fù)合，細(xì)胞活力和粘附作用不受影響，體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，脫細(xì)胞牛骨基質(zhì)完全能夠充當(dāng)成骨細(xì)胞增殖和制備復(fù)合骨移植替代物的模板，利用細(xì)胞播種的多重注射技術(shù)可以成功且均勻地將細(xì)胞播種到支架上，這種細(xì)胞-生物材料組織結(jié)構(gòu)為骨移植手術(shù)的未來方向提供了新的指引。

3.3ACBM與重組人骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(rhBMP-2)的復(fù)合材料 rhBMP-2只有同載體緩釋結(jié)合才能發(fā)揮成骨作用，并且不被吸收、降解或體液稀釋[32]。孫新君等[33]利用人纖維蛋白原凝膠(FBG)復(fù)合具有骨誘導(dǎo)活性的rhBMP-2和ACBM材料，進(jìn)一步構(gòu)建rhBMP-2緩釋載體并觀察緩釋效果。利用BMSC在體外可被顯著擴(kuò)增，產(chǎn)生堿性磷酸酶、骨鈣素和I型膠原等物質(zhì)的特性，研究人員設(shè)置不含rhBMP-2培養(yǎng)液的ACBM作為對照組，觀察rhBMP-2/ACBM復(fù)合材料對體外培養(yǎng)的BMSCs增殖和分化的影響。并采用復(fù)合材料修補(bǔ)兔橈骨缺損部位，觀察骨缺損部位的成骨效果。將ACBM浸入消毒的rhBMP-2，溶入FBG液中制備復(fù)合載體，ELISA試劑盒顯示，添加rhBMP-2組AKP和骨鈣素含量明顯增高。術(shù)后4、8周X線攝片、單光子發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層成像術(shù)(SPECT)和組織學(xué)檢測，結(jié)果顯示復(fù)合rhBMP-2/ACBM材料組4周骨痂大量形成，8周骨缺損局部密度均增加，12周X線片可見新骨塑形。其中在術(shù)后4～8周可以觀察到大量新生骨和軟骨，骨缺損中心有多個(gè)骨化中心。由此可見，添加rhBMP-2復(fù)合材料具有良好的促進(jìn)骨修復(fù)能力，增強(qiáng)細(xì)胞粘附后的延伸和活性表達(dá)。細(xì)胞培養(yǎng)顯示，緩釋載體釋放的rhBMP-2雖然不能直接促進(jìn)MSCs增殖分化，但可以間接作用于MSCs，增強(qiáng)其促成骨誘導(dǎo)及活性表達(dá)的能力，這些結(jié)論都為rhBMP-2/ACBM復(fù)合材料治療骨缺損提供了應(yīng)用基礎(chǔ)。

4 多種材料聯(lián)合ACBM形成的復(fù)合材料

4.1ACBM同可注射共聚物聚乙二醇-聚己內(nèi)酯-聚乙二醇(PEG-PCL-PEG，PECE)水凝膠復(fù)合 至今骨再生領(lǐng)域已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有幾種可被降解的聚合物。其中，可注射水凝膠聚合物擁有易于給藥、微創(chuàng)操作、患者方便和溫和條件下即可形成三維(3D)網(wǎng)絡(luò)的特性，使其在各個(gè)領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用[34-36]。最重要的是熱敏水凝膠可以在室溫或更低的溫度下自由注射，并可在原位形成凝膠庫來修補(bǔ)組織中任意形狀的缺損，因?yàn)槠湓隗w溫環(huán)境下更易在受損組織形成空腔形狀的特性，使得熱敏水凝膠在骨再生領(lǐng)域的應(yīng)用成為可能。

Ni等[37]以e-CL為原料，以Sn(Oct)2為催化劑，由聚乙二醇衍生物引發(fā)開環(huán)共聚等一系列操作獲得聚乙二醇-聚己內(nèi)酯二嵌段共聚物，進(jìn)一步偶聯(lián)獲得研究所需的PECE共聚物[38-39]。PECE三嵌段共聚物溶解在二氯甲烷中，用石油醚從濾液中再沉淀兩次以進(jìn)一步純化[39-40 ]，按照一定比例溶解在離子水中，得到純PECE水凝膠[39]，最終將ACBM顆粒加入PECE水凝膠中成功制備擁有良好生物相容性的可注射熱敏ACBM/PECE復(fù)合物材料。掃描電鏡檢查表明，ACBM/PECE復(fù)合材料中ACBM含量差異不會影響三維多孔結(jié)構(gòu)，表明水凝膠復(fù)合材料有著良好的生物相容性。為了評估復(fù)合材料對骨再生的作用效果，實(shí)驗(yàn)中將ACBM/PECE水凝膠復(fù)合材料植入新西蘭大白兔顱骨缺損處，設(shè)置PECE水凝膠填充另一側(cè)缺損作為對照，其余操作處理均保持一致，連續(xù)觀察兩周發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組一般活動(dòng)、能量、頭發(fā)、糞便、行為模式等表現(xiàn)均優(yōu)于對照組，利用數(shù)字X光機(jī)(德國西門子)、mCT80(瑞士巴塞爾斯多夫斯康科醫(yī)療股份公司)等儀器對實(shí)驗(yàn)組兔進(jìn)行測量，顱骨修復(fù)速度和成骨情況均優(yōu)于對照組，意味著ACBM/PECE水凝膠復(fù)合材料較單一材料具有更好的應(yīng)用前景，有助于狹小部位骨缺損的注射型填充修復(fù)。

4.2ACBM-CS與堿性細(xì)胞生長因子的復(fù)合材料 研究表明，MSCs在堿性成纖維細(xì)胞生長因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)的作用下可以增強(qiáng)其增殖和成骨分化能力[41-43]；另一方面，bFGF還可以促進(jìn)有絲分裂和血管再生，顯著加快血管內(nèi)皮細(xì)胞及成骨細(xì)胞等多種類型細(xì)胞的增殖及遷移。張志文等[3]進(jìn)行bFGF復(fù)合ACBM-CS支架骨修復(fù)的實(shí)驗(yàn)研究中，觀察比較負(fù)載與未負(fù)載bFGF的支架與未負(fù)載支架在治療骨缺損中的應(yīng)用效果。將ACBM-CS支架浸泡于含2mg/L bFGF的PBS溶液中[44],使溶液浸沒支架獲得生長因子復(fù)合支架。從微環(huán)境生長因子釋放水平、細(xì)胞增殖、細(xì)胞粘附、成骨相關(guān)因子檢測、影像學(xué)、組織學(xué)檢查等多個(gè)方面對生長因子復(fù)合支架進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，復(fù)合支架釋放生長因子的總量穩(wěn)定在一定水平，保證持續(xù)穩(wěn)定發(fā)揮誘導(dǎo)成骨分化功能；掃描電鏡下可觀察到支架表面細(xì)胞粘附緊密，同時(shí)細(xì)胞的偽足深入材料內(nèi)部，細(xì)胞長勢良好；成骨相關(guān)的生長因子例如Ⅰ型膠原、骨鈣素、骨橋蛋白及Runx2的mRNA表達(dá)明顯高于單一未復(fù)合生長因子組；影像學(xué)檢查可見生長因子支架組術(shù)后4周支架與宿主骨形成邊緣融合，8周骨密度較高，二者融合良好，12周時(shí)骨缺損部位基本恢復(fù)；組織學(xué)染色可見生長因子支架組新骨成骨面積大于對照組，骨缺損區(qū)域成熟骨細(xì)胞明顯增多，對照組結(jié)果稍差。研究表明，bFGF可以促進(jìn)間質(zhì)細(xì)胞、前成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞增殖分化，增強(qiáng)rhBMP、血管內(nèi)皮生長因子等成骨因子表達(dá)釋放，進(jìn)而誘導(dǎo)新骨形成[45-46]。將實(shí)驗(yàn)組材料通過手術(shù)植入到兔股骨缺損模型中觀察治療效果，X線片顯示：術(shù)后4周開始出現(xiàn)骨融合現(xiàn)象，成骨時(shí)間遠(yuǎn)遠(yuǎn)快于對照組，Lane-Sandhu X射線評分高于對照組。綜上所述，復(fù)合ACBM-CS支架的堿性生長因子治療骨缺損疾病，在具有良好機(jī)械性能的同時(shí)，還擁有較強(qiáng)的促進(jìn)MSCs增殖作用，兩者相互結(jié)合骨形成能力進(jìn)一步增強(qiáng)，針對其他能夠促進(jìn)骨形成的因子值得更深層次的研究。

4.3ACBM-CS與脂肪組織基質(zhì)血管基質(zhì)性成分形成復(fù)合材料 脂肪組織基質(zhì)血管性成分種類繁多，包括T細(xì)胞、外周血細(xì)胞及其他炎癥細(xì)胞等，脂肪多數(shù)來源干細(xì)胞并具備以下特點(diǎn)：分化變成脂肪細(xì)胞并促進(jìn)更新；分泌血管生長因子，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞修復(fù)血管損傷；不會隨著細(xì)胞數(shù)量改變其增殖分化功能；含量豐富，提取便捷和免疫抑制特性[47-48]，以上幾項(xiàng)特性奠定了脂肪組織基質(zhì)成分應(yīng)用于骨缺損修復(fù)的治療基礎(chǔ)。邵擎東等[49]根據(jù)脂肪組織血管基質(zhì)成分的特性研究其在骨組織工程中的應(yīng)用，提取制備原材料放置在適宜環(huán)境中保存，照射滅菌挑選生長良好的血管基質(zhì)細(xì)胞按照一定的濃度置于經(jīng)過處理的六孔板中，預(yù)濕培養(yǎng)液培養(yǎng)一段時(shí)間，最終得到血管基質(zhì)成分/ACBM/CS支架復(fù)合物。一般檢查發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組新西蘭大兔活躍度顯著高于對照組，其余無明顯差別；X線片結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組材料植入兔橈骨缺損模型2個(gè)月時(shí)呈明顯灰白色；病理切片觀察到骨小梁、少量長梭形細(xì)胞等骨形成細(xì)胞在中央管及周圍旺盛生長?？傊?，實(shí)驗(yàn)組相較于未添加基質(zhì)成分的對照組骨組織生長迅速，骨結(jié)構(gòu)清楚，細(xì)胞數(shù)量顯著增加。得出結(jié)論，添加基質(zhì)成分的支架對兔橈骨的修復(fù)效果遠(yuǎn)遠(yuǎn)強(qiáng)于未添加基質(zhì)成分組，脂肪組織基質(zhì)成分在骨組織的修復(fù)治療中具有較廣闊的應(yīng)用前景，值得進(jìn)一步探索。

5 結(jié)語

本文主要概括了ACBM與有機(jī)材料、無機(jī)金屬元素、組織細(xì)胞成分和多種材料聯(lián)合形成具備不同特性復(fù)合材料在骨缺損修復(fù)的應(yīng)用。ACBM骨修復(fù)材料在修復(fù)過程中會表現(xiàn)出各種不足，和ACBM相復(fù)合的天然生物衍生材料及人工合成生物高分子材料同樣不能單獨(dú)用于臨床骨缺損修復(fù)，但是兩類及以上材料復(fù)合可以擴(kuò)展原材料的功能，應(yīng)用于多種領(lǐng)域，本文歸納總結(jié)了所有同ACBM結(jié)合的天然或人工合成材料進(jìn)行敘述。首先，通過一系列方法去除骨組織中的細(xì)胞、脂類等，留下重要的細(xì)胞外基質(zhì)成分和細(xì)胞依附生長的骨結(jié)構(gòu)，制備得到仍然具備良好的骨傳導(dǎo)、骨誘導(dǎo)、生物相容性和適宜降解性的ACBM[50]。然后將ACBM與有機(jī)材料復(fù)合，增強(qiáng)間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)在ACBM表面黏附，促進(jìn)復(fù)合材料的誘導(dǎo)成骨能力；與金屬元素復(fù)合，Mg2+在骨形成中，有助于加快細(xì)胞增殖和成骨分化，抑制破骨細(xì)胞的活性[10-12]。Sr對骨的代謝具有雙重作用，一方面促進(jìn)骨祖細(xì)胞的增殖和分化，另一方面還能阻止破骨細(xì)胞的終末分化；與多種材料的復(fù)合都有不同程度促進(jìn)MSCs的增殖的功能，同加入種子細(xì)胞作用基本一致，最終均可以加快成骨速度和增強(qiáng)誘導(dǎo)骨形成能力。

綜上所述，與ACBM復(fù)合的材料本身都有不同程度的誘導(dǎo)成骨功能，采用特定方式復(fù)合不會影響ACBM結(jié)構(gòu)和性質(zhì)，還能進(jìn)一步增強(qiáng)骨形成能力，將兩種或多種材料在一定條件下構(gòu)建成一種較為完美的復(fù)合材料用于多種類型骨缺損治療。由此可見，可以將探索與ACBM相復(fù)合的材料為研究方向，兩種或多種材料通過一定方式合成新型復(fù)合材料，從而實(shí)現(xiàn)治療任何類型骨缺損的目的。

作者貢獻(xiàn)聲明：孫佳培：資料收集、論文撰寫和文獻(xiàn)檢索；彭偉：審校、研究指導(dǎo)；西娜、謝聰欽：綜述設(shè)計(jì)、論文修改