龍葵UNUSUAL FLORAL ORGANS類SnUFO2基因C端序列的保守性對花發(fā)育的影響

周佳圓，鐘 玉，努爾阿斯婭·伊馬木，崔敏龍，樸春蘭

（1.浙江農(nóng)林大學 園藝科學學院，浙江 杭州 311300；2.烏什縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，新疆 阿克蘇 843006）

花發(fā)育是植物完成生命周期的關(guān)鍵過程。植物從營養(yǎng)生長到生殖生長的轉(zhuǎn)變是對環(huán)境因素和遺傳因素的雙重響應，為了確保子代的正常繁殖，高等植物必須在最適的環(huán)境條件下開花[1]?；òl(fā)育分為成花誘導、成花啟動及花器官發(fā)育共3個階段[1]。植物通過外界環(huán)境和內(nèi)源激素變化感受到開花信號，刺激莖頂端分生組織 (shoot apical meristem，SAM)轉(zhuǎn)變?yōu)榛ㄐ蚍稚M織 (inflorescence meristem，IM)，隨后花序分生組織在花分生組織特征基因 (floral meristem identity gene)和花器官特征基因 (floral organ identity gene)的作用下形成一朵完整的花[2]。F-box蛋白是植物中最大的蛋白質(zhì)超家族之一，N端存在F-box結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域由40～60個氨基酸殘基組成，能和Skp1、Cullinl (CUL1)/Cdc53和Rbxl/Rocl/Hrtl結(jié)合形成Skp1-Cullin1-F-box (SCF)復合體參與泛素化過程；C端為底物結(jié)合區(qū)域，存在不同的結(jié)構(gòu)域，包括Kelch、LRR、FBD結(jié)構(gòu)域等，F(xiàn)-box蛋白的C端決定了底物識別的特異性，根據(jù)結(jié)合底物的不同，F(xiàn)-box蛋白發(fā)揮不同的作用[3?5]?？梢?，F(xiàn)-box蛋白形成的SCF復合體能參與植物生命周期的各個方面，如種子萌發(fā)、花發(fā)育、自交不親和性、生物脅迫和非生物脅迫以及光形態(tài)建成等[3, 6]。

UNUSUAL FLORAL ORGANS(UFO)基因是與花發(fā)育相關(guān)的F-box基因，是重要的花分生組織特征基因和花器官特征基因，依賴于LEAFY(LFY)基因發(fā)揮作用，并與LFY基因共同促進ABC模型中B類基因的表達，從而調(diào)控花瓣和雄蕊的發(fā)育[7?12]。除了LFY基因，UFO還能與ASK1結(jié)合形成 SCFUFO復合體對花瓣和雄蕊發(fā)育造成影響，ufo和ask1突變體都表現(xiàn)為花瓣和雄蕊發(fā)育不良[11]。在擬南芥Arabidopsis thaliana中UFO基因C末端區(qū)域是花瓣發(fā)育所必需的，而在百脈根Lotus japonicus和豌豆Pisum sativum中，UFO同源基因PROLIFERATING FLORAL ORGANS(PFO)和STAMINA PISTILLOIDA(STP)基因C端序列的缺失不僅對花瓣發(fā)育有影響，還對花分生組織確定性造成影響，形成次生花序[13?15]。

龍葵Solanum nigrum是茄科Solanaceae茄屬Solanum的1年生草本植物，花序結(jié)構(gòu)為聚傘花序[16]。目前對茄科的研究集中在番茄S.lycopersicum等經(jīng)濟作物上，在其他茄科植物中關(guān)于花發(fā)育的研究較為欠缺。龍葵生長周期短、植株矮小、遺傳轉(zhuǎn)化效率高且便于實驗室栽培，是理想的研究材料。通過對龍葵花發(fā)育的研究可以豐富茄科植物花發(fā)育的研究內(nèi)容，探討UFO基因在不同物種的調(diào)控機制，為UFO基因在茄科花發(fā)育的調(diào)控方面提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料

以野生型植株及其轉(zhuǎn)基因植株為材料，在室溫25 ℃及光周期16 h/8 h的條件下栽培，備用。

1.2 方法

1.2.1 基因序列獲得 根據(jù)龍葵轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)篩選出SnUFO2基因序列，設計上下游引物并利用在線網(wǎng)站NEBcutter (http://tools.neb.com/NEBcutter/index.php3)添加酶切位點BamHⅠ和SacⅠ以及保護堿基(表1)。引物序列送杭州有康生物科技有限公司合成。

表 1 基因克隆及RT-qPCR引物列表Table 1 Gene cloning and RT-qPCR primer list

利用RNA提取試劑盒(普洛麥格生物產(chǎn)品有限公司，上海)提取盛花期野生型龍葵植株相同生長時期花苞的 RNA，使用EasyScript?First-Strand cDNA Synthesis SuperMix 反轉(zhuǎn)錄試劑盒 (全式金生物技術(shù)有限公司，北京)獲得cDNA，以其為模板克隆SnUFO2基因。PCR反應程序：97 ℃預變性3 min；95 ℃變性 40 s，60 ℃ 退火 40 s，72 ℃ 延伸 1 min，35 個循環(huán)；72 ℃ 總延伸 10 min。PCR 產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測片段大小，并純化回收目的片段。目的片段連接到pEASY Blunt simple (全式金生物技術(shù)有限公司，北京)載體后，轉(zhuǎn)入大腸埃希菌Escherichia coliDH5α 感受態(tài)中(唯地生物技術(shù)有限公司，上海)。通過菌落PCR篩選陽性單菌落，搖菌送杭州擎科生物有限公司測序。測序返回數(shù)據(jù)拼接后與轉(zhuǎn)錄組測序序列進行比對，獲得2條目的基因序列。

1.2.2 生物信息學分析 通過在線網(wǎng)站 Pfam (http://pfam.xfam.org/)蛋白質(zhì)家族數(shù)據(jù)庫進行結(jié)構(gòu)域分析。將克隆得到的2條SnUFO2序列在美國國家生物信息中心(NCBI)上通過Blastx進行同源基因檢索。利用MEGA7[17]進行氨基酸序列比對和系統(tǒng)進化樹構(gòu)建。進化樹構(gòu)建采用鄰接法，Bootstrap檢驗1 000次。將篩選到的不同物種中UFO基因和龍葵中2條SnUFO2序列輸入在線網(wǎng)站MEME Suite(https://meme-suite.org/meme/)，選擇合適的Motif數(shù)量后導出結(jié)果，并用TBtools[18]軟件美化。

1.2.3 組織特異表達分析 于野生型龍葵植株盛花期取樣，分別采集植株不同部位，包括根、莖、葉和花苞并提取RNA，以反轉(zhuǎn)錄后的cDNA為模板，進行實時熒光定量PCR反應。內(nèi)參基因為龍葵的APRT基因，SnAPRT和SnUFO2*定量引物如表 1所示。根據(jù)RT-qPCR試劑盒TransStart?Tip Green qPCR SuperMix(全式金生物技術(shù)有限公司，北京)說明書設置反應體系：cDNA 1 μL，上下游引物(10 μmol·L?1)各 0.2 μL，2×TransStart?Tip Green qPCR SuperMix 5 μL，雙蒸水補足至 10 μL。反應條件：95℃ 預變性 30 s；95 ℃ 變性 5 s，60 ℃ 退火 15 s，72 ℃ 延伸 10 s，共反應 45 個循環(huán)。數(shù)據(jù)計算方法采用2???Ct法計算相對表達量。

1.2.4 表達載體構(gòu)建 利用BamHⅠ和SacⅠ(賽默飛世爾科技公司，上海)將目的片段和 pBI121 載體進行雙酶切，純化回收后在16 ℃下過夜連接，并轉(zhuǎn)入大腸埃希菌感受態(tài)。菌落經(jīng)PCR驗證后，提取陽性重組質(zhì)粒，通過單雙酶切驗證超表達載體。

1.2.5 轉(zhuǎn)基因植株分子檢測及形態(tài)學分析 SDS法提取轉(zhuǎn)化苗基因組DNA，以野生型龍葵為對照，通過PCR檢測陽性轉(zhuǎn)基因植株。通過尼康相機(COOLPIX P7100)拍照記錄轉(zhuǎn)基因植株和花序表型變化，Leica體視顯微鏡(M165FC)拍照記錄轉(zhuǎn)基因植株花表型變化。

1.2.6 組織學染色分析 采用海氏鐵礬-蘇木精染色法[19]，在野生型與轉(zhuǎn)基因植株盛花期取 2.5 mm 左右的花苞置于FAA固定液中固定，依次經(jīng)50%、60%、70%、80%、90%、95%、100%體積分數(shù)的乙醇脫水，再依次經(jīng)體積梯度比1∶2、1∶1、2∶1的二甲苯無水乙醇混合液和純二甲苯透明后，浸蠟3 d，使石蠟緩慢進入材料中，將材料包埋至蠟塊中。使用Leica轉(zhuǎn)輪式切片機(RM2235)切片，用蘇木精染色后封片。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因克隆與生物信息學分析

以野生型龍葵盛花期花苞的cDNA為模板，克隆得到2條SnUFO2序列，都含有F-box結(jié)構(gòu)域。一條序列與轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果一致，為龍葵中SnUFO2基因，編碼456個氨基酸；另一條序列為短截版的SnUFO2基因，該基因在1 294～1 295 bp處有1個堿基G的插入，導致翻譯提前終止，編碼433個氨基酸，記為SnUFO2*。將SnUFO2*基因、全長SnUFO2基因和不同物種中UFO的同源基因構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。SnUFO2*、SnUFO2基因和番茄、辣椒Capsicum annuum和矮牽牛Petunia × hybrida中的UFO基因在同一進化分支，同源關(guān)系較近，而與水稻Oryza sativa，擬南芥中的UFO基因同源關(guān)系較遠(圖1A)。

利用MEME軟件對SnUFO2*和SnUFO2蛋白進行Motif預測發(fā)現(xiàn)，這些蛋白相似性極高，預測到高度相似的Motif可能行使UFO蛋白最保守的功能(圖1B)。SnUFO2*與其他UFO蛋白相比，Motif 8的缺失可能導致該基因的功能與其他物種中UFO基因的功能存在差異。通過氨基酸序列比對發(fā)現(xiàn)：SnUFO2*C末端比SnUFO2基因少了23個氨基酸，這段序列在茄科物種中高度保守，可能影響龍葵正常的花發(fā)育進程(圖2)。

圖1 SnUFO2*系統(tǒng)發(fā)育樹分析及 Motif分析Figure 1 SnUFO2* phylogenetic tree analysis and Motif analysis

圖2 龍葵 SnUFO2*氨基酸序列比對Figure 2 Amino acid sequence alignment of S.nigrum SnUFO2*

2.2 龍葵SnUFO2*基因的組織特性表達

UFO基因是重要的花器官特征基因，在花發(fā)育初期發(fā)揮作用。為了探究SnUFO2*基因在龍葵營養(yǎng)器官及生殖器官中的表達水平，提取盛花期的根、莖、葉和花苞進行RT-qPCR分析。以龍葵APRT為內(nèi)參基因，RT-qPCR結(jié)果表明：SnUFO2*在根、莖、葉中的表達量低，在花苞中相對表達量較高，推測SnUFO2*基因可能主要參與花器官發(fā)育(圖3)。

圖3 野生型龍葵中 SnUFO2*不同組織部位表達量分析Figure 3 Expression analysis of SnUFO2* in different tissues of wildtype S.nigrum

2.3 龍葵轉(zhuǎn)基因植株表型分析

為探究龍葵C末端缺失的SnUFO2*基因?qū)埧òl(fā)育的影響，構(gòu)建了SnUFO2*的表達載體，將其轉(zhuǎn)入龍葵植株中，經(jīng)含有卡那霉素抗性的培養(yǎng)基篩選后，獲得40個T0代獨立抗性株系，經(jīng)PCR鑒定共獲得31個轉(zhuǎn)基因陽性株系。選擇表型明顯的不同株系轉(zhuǎn)基因植株進行分析，轉(zhuǎn)基因植株的根、莖和葉等未觀察到明顯變化(圖4A)，而花器官發(fā)育異常：野生型龍葵花盛開后，花瓣呈白色，花瓣基部相連，雄蕊緊靠雌蕊生長于花中心(圖4C)；弱表型轉(zhuǎn)基因SnUFO2-30株系的花部分花瓣中部形成綠色條紋狀組織，偶爾形成萼片狀花瓣，花瓣基部裂口變大，雄蕊花藥未緊靠雌蕊，雜亂分布于四周(圖4B和C)；強表型SnUFO2-10株系的花瓣完全萼片化，這類花最終不能形成正常的果實和種子(圖4A～C)。

圖4 35S::SnUFO2* 轉(zhuǎn)基因植株表型圖Figure 4 Phenotypic map of 35S::SnUFO2* transgenic plants

2.4 龍葵花苞組織學染色觀察

為了進一步確定轉(zhuǎn)基因植株花內(nèi)部結(jié)構(gòu)及其細胞變化，通過對野生型和SnUFO2-10轉(zhuǎn)基因植株的花苞進行石蠟切片表明：野生型株系的花苞由外到內(nèi)依次存在萼片、花瓣、雄蕊和雌蕊；SnUFO2-10株系花苞生成萼片狀花瓣，雄蕊缺失，心皮發(fā)育異常，沒有花柱和柱頭產(chǎn)生，偶爾在發(fā)育中的心皮兩側(cè)觀察到胚珠的產(chǎn)生(圖5)。

圖5 野生型及 35S::SnUFO2*轉(zhuǎn)基因株系花苞石蠟切片F(xiàn)igure 5 Paraffin sections of flower buds of wild-type and 35S::SnUFO2 * transgenic lines

3 討論與結(jié)論

本研究克隆了1條短截版的SnUFO2基因，探究C端序列的完整性對龍葵花發(fā)育的影響。生物信息學分析發(fā)現(xiàn)：SnUFO2*基因?qū)儆贔-box基因家族，且C末端缺失的序列可能具有保守的功能。F-box蛋白家族通常以SCF復合體的形式參與植物各項生命活動。過往研究認為F-box蛋白的N端與SKP1類基因結(jié)合，形成SCF復合體，而C端與靶蛋白結(jié)合，通過泛素鏈引導至26S蛋白酶體從而降解結(jié)合蛋白[3]?；贑端序列在F-box基因中的重要作用推測，SnUFO2* C末端23個保守的氨基酸缺失可能會影響泛素化過程。

UFO及其同源基因已被證明在植物花發(fā)育過程中發(fā)揮作用[7?15]。通過RT-qPCR分析發(fā)現(xiàn)：SnUFO2*基因在龍葵的根、莖和葉中表達水平較低，而在花苞中表達量較高，推測該基因和其他UFO基因一樣在花發(fā)育過程中發(fā)揮作用。于是構(gòu)建SnUFO2*超表達載體并將其轉(zhuǎn)入龍葵中。在矮牽牛中過表達DOUBLE TOP(DOT)基因會導致植株矮化，形成一朵單花[20]。然而形態(tài)學觀察發(fā)現(xiàn)：35S::SnUFO2*轉(zhuǎn)基因植株未出現(xiàn)矮化表型，根、莖和葉也無明顯變化，但是花器官發(fā)生明顯變化，萼片內(nèi)側(cè)的花瓣、雄蕊和雌蕊都被萼片狀的器官代替。這與C末端缺失的UFO基因突變體表型相似，在擬南芥ufo-2突變體中，UFO基因翻譯提前終止，編碼262個氨基酸，產(chǎn)生了強烈的表型變化：生成萼片狀花瓣、花絲及心皮狀結(jié)構(gòu)[21]。在豌豆突變體，stp-4中，STP基因只編碼了252個氨基酸，導致豌豆花缺少花瓣和雄蕊，且有次生花產(chǎn)生[15]。黃瓜Cucumis sativus ufo突變體中，其花瓣的位置產(chǎn)生了葉狀器官，雄蕊發(fā)育不正常[22]。以上研究表明：UFO基因的C末端對該基因的功能具有重要作用，雖然不同C末端缺失突變體表型不完全相同，但這可能與該基因短截的位點不同有關(guān)，也可能與物種特性有關(guān)。

花發(fā)育是一個受多基因調(diào)控的復雜生理過程，需要相關(guān)花分生組織特征基因和花器官特征基因的共同作用。SnUFO2-10花苞的石蠟切片結(jié)果顯示：在4輪花器官形成過程中，除最外輪萼片部分形成正常外，花瓣萼片化，花分生組織不確定導致內(nèi)輪不斷產(chǎn)生增殖的萼片狀器官。缺少C末端的ufo突變體的共同特征為花瓣和雄蕊的缺失或是畸形發(fā)育，例如擬南芥ufo-2花瓣萼片化及雄蕊數(shù)量減少，豌豆stp突變體表現(xiàn)為花瓣向萼片轉(zhuǎn)化[15, 21]。其次是心皮發(fā)育異?；蚧ǚ稚M織的不確定性，例如金魚草fimbriata620 (fim620)突變體產(chǎn)生的側(cè)生花及花的萼片數(shù)目不確定和百脈根pfo突變體產(chǎn)生的不斷增殖的萼片狀器官[14, 23]。這些表型的出現(xiàn)與花器官特征基因中的B類和C類基因有關(guān)，因此推測UFO基因C端序列的缺失對該基因的功能造成影響，從而直接或間接影響B(tài)類和C類基因的正常表達。過往研究表明：SCFUFO可能促進LFY基因的轉(zhuǎn)錄活性，且UFO基因能與LFY共同促進B、C類基因的表達[11?12, 20?21]。我們認為：SnUFO2*可能通過SCF復合體的形式，影響LFY基因的表達進而促進相關(guān)花同源異型基因的表達，然而SnUFO2*基因C末端序列的缺失影響了SCF復合體的功能，從而影響4輪花器官的正常發(fā)育。轉(zhuǎn)基因植株形成的萼片狀花與lfy突變體表型相似，間接證明了這種猜想[11]。

綜上所述，不僅是UFO基因的F-box結(jié)構(gòu)域?qū)ζ涔δ芫哂兄匾饔茫珻端序列的完整性對基因功能也極其重要。之后的研究中，觀察全長SnUFO2轉(zhuǎn)基因植株表型的變化，尤其是花器官發(fā)育變化，對深入探究UFO基因的功能是必要的。