利用ISSR與SRAP分子標(biāo)記分析金線蓮種質(zhì)資源遺傳多樣性

黃錦春，萬思琦，陳 揚(yáng)，李麗紅，張自力，朱建軍，吳 梅，邢丙聰，邵清松，陸晨飛

（1.浙江農(nóng)林大學(xué) 浙江省特色中藥資源保護(hù)與創(chuàng)新利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 311300；2.溫州科技職業(yè)學(xué)院溫州市園藝植物育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 溫州 325006；3.金華市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，浙江 金華 321000）

金線蓮Anoectochilus roxburghii為蘭科Orchidaceae開唇蘭屬Anoectochilus多年生草本植物，別名金線草、金線蘭等，主要分布在中國福建、浙江、云南和臺(tái)灣等地區(qū)。金線蓮因含有黃酮類、多糖類、生物堿類等成分[1]，其藥用價(jià)值日益被重視。由于金線蓮對生長環(huán)境要求嚴(yán)格，且野生資源被過度采摘，導(dǎo)致金線蓮已瀕臨滅絕[2]，因此有必要開展金線蓮資源的保護(hù)。種質(zhì)資源收集和遺傳多樣性評估是金線蓮資源保護(hù)的基礎(chǔ)研究工作。分子標(biāo)記可以在DNA水平上揭示植物的遺傳變異，是一種穩(wěn)定可靠的遺傳分析方法[3]。簡單重復(fù)序列間擴(kuò)增多態(tài)性(inter-simple sequence repeat，ISSR)和序列相關(guān)擴(kuò)增多態(tài)性(sequence-related amplified polymorphism，SRAP)主要針對非特異性序列進(jìn)行擴(kuò)增，對于基因組序列信息匱乏的物種較為有效[4]。目前，分別利用ISSR、SRAP等單一分子標(biāo)記對金線蓮遺傳多樣性的評價(jià)[5?11]已取得了一定的進(jìn)展，但單一的分子標(biāo)記技術(shù)經(jīng)常受到擴(kuò)增區(qū)域限制、引物擴(kuò)增能力差異、模糊顯性標(biāo)記主觀計(jì)入等因素影響，不能完全評價(jià)生物遺傳多樣性[12?13]，而綜合運(yùn)用多種分子標(biāo)記，能最大程度優(yōu)化聚類分析結(jié)果[14?15]。目前，結(jié)合ISSR與SRAP分子標(biāo)記技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用于薄荷Mentha haplocalyx[12]、煙草Nicotiana tabacum[16?17]、韭菜Allium tuberosum[18]、梔子Gardenia jasminoides[19]等研究。本研究采用ISSR與SRAP相結(jié)合的方法對浙江與福建等地引種、雜交與野生的金線蓮樣品進(jìn)行研究，揭示金線蓮個(gè)體間與種源間的遺傳分化，為金線蓮資源的保護(hù)和利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

48份金線蓮新鮮葉片樣品詳見表1。

表1 金線蓮供試樣品信息Table 1 Tested samples of A.roxburghii

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA的提取與檢測 參照DNA提取試劑盒說明書提取金線蓮的DNA，得到的DNA用50 μL雙蒸水(ddH2O)溶解。以ddH2O為對照，使用超微量分光光度計(jì)檢測DNA溶解液的濃度以及純度。

1.2.2 金線蓮ISSR引物篩選及檢測 采用哥倫比亞大學(xué)公布的第9套100個(gè)ISSR通用引物序列，由北京擎科生物科技有限公司合成。使用3個(gè)已提取的DNA對100個(gè)ISSR引物進(jìn)行篩選，反應(yīng)體系總體積為 20 μL，其中 2×TaqPlus MasterMix 10 μL、ddH2O 8 μL、ISSR 引物 1 μL、DNA 溶解液 1 μL，PCR 擴(kuò)增程序?yàn)?98 ℃ 預(yù)變性 30 s；94 ℃ 變性 10 s，退火 (不同引物退火溫度不同) 15 s，72 ℃ 延伸 15 s，循環(huán)35次；最后72 ℃延伸1 min，4 ℃保存。對產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，挑選出多態(tài)性好、擴(kuò)增條帶清晰的引物對48個(gè)DNA樣品進(jìn)行擴(kuò)增。

1.2.3 金線蓮SRAP引物篩選及檢測 參照FERRIOL等[20]的設(shè)計(jì)原理建立SRAP標(biāo)記分析體系，由北京擎科生物科技有限公司合成，包含14條上游引物(Me1～Me14)和17條下游引物(Em1～Em17)，上下游引物可隨機(jī)組成238對SRAP引物組合。使用2個(gè)已提取的DNA對238對SRAP引物組合進(jìn)行篩選，PCR體系及擴(kuò)增程序同上。將挑選出的多態(tài)性好、擴(kuò)增條帶清晰的引物對48個(gè)DNA樣品進(jìn)行擴(kuò)增。

1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及分析 對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳膠圖進(jìn)行人工讀帶，對擴(kuò)增條帶按有(1)或無(0)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，形成“0, 1”數(shù)據(jù)矩陣，分別得到ISSR、SRAP及兩者綜合的數(shù)據(jù)。利用Excel統(tǒng)計(jì)每個(gè)(對)引物的總擴(kuò)增條帶數(shù)、多態(tài)性條帶數(shù)和多態(tài)位點(diǎn)百分率(PPB)。使用POPGENE 32.0軟件計(jì)算等位基因數(shù)(Na)、有效等位基因數(shù)(Ne)、Nei’s基因多樣性指數(shù)(H)、Shannon’s多態(tài)性信息指數(shù)(I)、居群總基因多樣性(Ht)、居群內(nèi)基因多樣性(Hs)、基因分化系數(shù)(Gst=1?Hs/Ht)和基因流(Nm)等遺傳多樣性相關(guān)參數(shù)，并計(jì)算不同種源間的遺傳距離和遺傳一致度，使用OmicStudio工具對遺傳距離進(jìn)行主坐標(biāo)分析(PCoA)，使用NTSYS-PC 2.1軟件對所采集的金線蓮樣品進(jìn)行聚類分析并繪制非加權(quán)組平均法(UPGMA)樹狀圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物篩選及擴(kuò)增多態(tài)性

2.1.1 ISSR 引物的篩選及其擴(kuò)增多態(tài)性 經(jīng)過 2 次篩選，共獲得 11 條條帶較為清楚的引物 (表 2)。11條引物共擴(kuò)增出86條條帶，其中多態(tài)性條帶有84條，PPB平均值為97.67%，平均擴(kuò)增條帶數(shù)是7.82個(gè)，平均多態(tài)性條帶數(shù)為7.64個(gè)。擴(kuò)增條帶數(shù)最多的引物是UBC880 (13條)，其次是UBC861(12條)，擴(kuò)增條帶最少的是UBC810 (4條)。PPB為83.33%～100%，其中，UBC807、UBC810、UBC826、UBC834、UBC841、UBC842、UBC865、UBC68和UBC861的PPB為100%，均表現(xiàn)出極高的多態(tài)性，占總引物的81.82%；UBC856的PPB最低，為83.33%。

表2 ISSR 引物信息及擴(kuò)增結(jié)果Table 2 ISSR primer information and amplification results

2.1.2 SRAP引物的篩選及其擴(kuò)增多態(tài)性 經(jīng)過2次篩選，共獲得11對條帶較為清楚的引物組合(表3)。11對引物共擴(kuò)增出88條條帶，其中多態(tài)性條帶有86條，PPB平均值為97.73%，平均擴(kuò)增條帶數(shù)是8個(gè)，平均多態(tài)性條帶數(shù)為7.82個(gè)。擴(kuò)增條帶數(shù)最多的引物組合是Me11-Em4 (12條)；其次是組合Me4-Em13、Me2-Em14和Me13-Em10，擴(kuò)增出9條條帶；擴(kuò)增條帶最少的是Me13-Em16組合，只擴(kuò)增出6條條帶。PPB為88.89%～100%，其中，Me11-Em4、Me8-Em7、Me13-Em7、Me13-Em16、Me4-Em14、Me5-Em11、Me13-Em10、Me14-Em14和Me3-Em2組合的PPB為100%，均表現(xiàn)出極高的多態(tài)性，占總引物的81.82%；Me4-Em13和Me2-Em14組合的PPB最低，為88.89%。

表3 SRAP 引物信息及擴(kuò)增結(jié)果Table 3 SRAP primer information and amplification results

2.2 遺傳距離和遺傳一致度分析

ISSR研究中遺傳一致度為0.476 7～0.907 0，遺傳距離為0.097 6～0.740 8。其中，遺傳一致度最高的1號與2號、3號與17號、14號與17號，均為0.907 0，它們的遺傳距離最小，均為0.097 6，說明其親緣關(guān)系較近；遺傳一致度最低的是7號與22號，為0.476 7，其遺傳距離最大，為0.740 8，說明其親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。在SRAP研究中遺傳一致度為0.465 9～0.954 5，遺傳距離為 0.046 5～0.763 8。其中，遺傳距離最小的是36號與37號，遺傳距離最大的是10號與39號。綜合ISSR和SRAP的數(shù)據(jù)后，遺傳一致度 為 0.511 5～0.879 3，遺傳距離為0.128 6～0.670 4。其中，遺傳距離最小的是34號與37號，遺傳距離最大的是10號與39號。

將48份樣品按照產(chǎn)地來源分為5個(gè)群體(浙江、福建、臺(tái)灣、江西和云南)，利用POPGENE 32軟件對其遺傳距離和遺傳一致度進(jìn)行計(jì)算，結(jié)果如表4所示。使用OmicStudio工具將ISSR+SRAP的標(biāo)記結(jié)果進(jìn)行PCoA分析，結(jié)果如圖1所示：由于來自臺(tái)灣(3個(gè))、江西(1個(gè))和云南(1個(gè))的樣品數(shù)目較少，故不作分析。結(jié)合表4與圖1可知：浙江省與福建省金線蓮種質(zhì)混雜。

圖1 綜合 ISSR 和 SRAP 標(biāo)記數(shù)據(jù)的 PCoA 分析Figure 1 PCoA analysis of ISSR and SRAP markers data

表4 金線蓮群體間的遺傳一致度與遺傳距離Table 4 Genetic agreement and genetic distance among A.roxburghii populations

2.3 遺傳多樣性分析

分析浙江與福建種源的樣品，結(jié)果如表5所示：ISSR分析顯示，43個(gè)種源在物種水平上，Na為1.965 1，Ne為 1.440 3，H為 0.272 7，I為 0.424 7，PPB為96.51%；在群體水平上，Na為1.709 3～1.930 2，Ne為1.340 9～1.432 5，H為0.207 5～0.266 8，I為0.320 7～0.414 7，PPB為70.93%～93.02%，相對于物種水平而言，群體間的遺傳多樣性水平較低。SRAP結(jié)果與ISSR結(jié)果相似。結(jié)合ISSR與SRAP的數(shù)據(jù)分析：43 個(gè)種源在物種水平上，Na為 1.971 3，Ne為 1.379 7，H為 0.242 9，I為 0.387 3，PPB為 97.13%；在群體水平上，Na為 1.781 6～1.942 5，平均值為1.862 1；Ne為 1.357 8～1.360 7，平均值為1.359 3；H為 0.223 9～0.228 8，平均值為 0.226 4；I為 0.348 8～0.366 4，平均值為 0.357 6；PPB為 78.16%～94.25%，平均值為86.21%，也是群體間的遺傳多樣性水平更低。其中，從ISSR、SRAP及綜合研究結(jié)果來看，Na、Ne、H、I及PPB中基本上是福建省大于浙江省，說明福建省的金線蓮種群遺傳多樣性更高。

表5 金線蓮遺傳多樣性參數(shù)Table 5 Genetic diversity parameters of A.roxburghii

2.4 UPGMA 聚類分析

2.4.1 基于 ISSR標(biāo)記的聚類 由圖 2可見：48份金線蓮樣品的遺傳相似性系數(shù)為0.62～0.91，變幅為0.29。在遺傳相似系數(shù)為0.67處，48份金線蓮樣品被劃分為3類：在Ⅰ類中地理位置相同的主要有浙江溫州的1、2、5、38號以及福建福州的17、25、26、27、44、45號，兩地間親緣關(guān)系相對較近；而Ⅱ類與Ⅲ類中樣品的來源組成均較為分散，無明顯特征。

圖2 ISSR 標(biāo)記的 UPGMA 樹狀圖Figure 2 ISSR cluster map

2.4.2 基于 SRAP 標(biāo)記的聚類 圖 3 顯示：48 份金線蓮樣品的遺傳相似性系數(shù)為 0.62～0.95，變幅為0.33。在遺傳相似系數(shù)為0.65處，48份金線蓮樣品被劃分為2類，Ⅰ類中1、5、38號均來自浙江溫州，且品種相似，故聚為一類；而在Ⅱ類中，各個(gè)品種難以明顯劃分出小類，這也是各地種質(zhì)較為混亂所帶來的結(jié)果。與ISSR標(biāo)記相比，SRAP標(biāo)記更難劃分類別。

圖3 SRAP 標(biāo)記的 UPGMA 樹狀圖Figure 3 SRAP cluster map

2.4.3 基于 ISSR+SRAP 標(biāo)記聚類 圖 4 顯示：48 份金線蓮樣品的遺傳相似性系數(shù)為 0.64～0.88，變幅為0.24。在遺傳相似系數(shù)為0.68處，48份金線蓮樣品被劃分為4類，Ⅰ類中地理位置相同的主要有浙江溫州的1、2、5、38號以及臺(tái)灣高雄的8、9號，兩地間可能品種相互引種；Ⅱ類中主要為來自福建福州的樣品，包括17、25、26、27、44、45號；Ⅲ類中地理位置相同的主要有福建廈門的4、18、24、31、33、34、36、37號以及福建三明的12、13、22、28、29、48號，兩地間品種互引的可能性較大。2種分子標(biāo)記結(jié)合的方法更易體現(xiàn)樣品間親緣關(guān)系、劃分類別，更清楚地體現(xiàn)地理位置對親緣關(guān)系的影響。

圖4 ISSR+SRAP 標(biāo)記的 UPGMA 樹狀圖Figure 4 ISSR+SRAP cluster map

3 討論與結(jié)論

本研究利用ISSR與SRAP對48份不同來源金線蓮樣品進(jìn)行遺傳特性分析，共篩選獲得11條ISSR引物，擴(kuò)增86條條帶，其中多態(tài)性條帶84條，PPB為97.67%；篩選出的11對SRAP引物共擴(kuò)增出了88條條帶，多態(tài)性條帶86條，PPB為97.73%。說明供試金線蓮樣本具有豐富的遺傳多樣性，且相較于王劍鍇等[10]篩選出的用于檢測金線蓮資源遺傳特性的RAPD分子標(biāo)記，ISSR與SRAP的標(biāo)記多態(tài)性明顯增多，進(jìn)一步驗(yàn)證了ISSR與SRAP在金線蓮種源多態(tài)性檢測方面的高效率。

基于ISSR與SRAP分子標(biāo)記對金線蓮樣品的遺傳距離與遺傳一致度分析發(fā)現(xiàn)：遺傳距離最小的是34號(福建廈門福建無網(wǎng)紋種)與37號(福建廈門紅霞)，其親緣關(guān)系較近；遺傳距離最大的是10號(福建三明的無紋G)與39號(福建三明的尖葉)，其親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。從遺傳多樣性分析結(jié)果來看，來自福建的金線蓮遺傳多樣性更高，同時(shí)結(jié)合金線蓮群體間的遺傳一致度與遺傳距離結(jié)果以及PCoA分析，可以看出各地間金線蓮種質(zhì)資源十分混雜，其中包含了大量的野生種、半野生種和人工馴化的栽培種及雜交種，這種復(fù)雜性導(dǎo)致不同種源間的差異性明顯，金線蓮種質(zhì)的遺傳多樣性增加。浙江省市場內(nèi)流通的栽培種多為省外引入種[21?22]，各種質(zhì)遺傳交流頻繁，這有利于培育出較優(yōu)的金線蓮品種。

本研究單獨(dú)使用ISSR或SRAP的UPGMA聚類結(jié)果中，均出現(xiàn)各地間種源相互混雜的狀況，并未嚴(yán)格按照地理距離的差異進(jìn)行歸類，而2種分子標(biāo)記結(jié)合的聚類結(jié)果中，金線蓮種質(zhì)資源的聚類與不同地理位置分布的情況有比較高的一致度，表現(xiàn)出了一定地域性分布規(guī)律，說明2種分子標(biāo)記方法結(jié)合相較于單一的分子標(biāo)記方法能更準(zhǔn)確地體現(xiàn)不同地區(qū)金線蓮的差異性。由于2種分子標(biāo)記所檢測的基因座位以及所用的引物等因素存在差異，故兩者得到的遺傳距離不同，其聚類圖也存在差異[23]，且每種分子標(biāo)記方法均有其優(yōu)勢與不足，結(jié)合多種標(biāo)記技術(shù)則能更全面、準(zhǔn)確地揭示種質(zhì)遺傳特性。因此，本研究結(jié)合ISSR與SRAP能更準(zhǔn)確地揭示金線蓮資源的遺傳多樣性和親緣關(guān)系，為金線蓮良種培育以及野生金線蓮資源保護(hù)等方面提供了幫助。此外物種的遺傳特性容易受到生態(tài)環(huán)境、繁殖方式以及各種人為活動(dòng)的影響，野生金線蓮經(jīng)過長期的自然選擇，其遺傳背景較為復(fù)雜；人工栽培種種源多來自于野生金線蓮，品種混雜。同時(shí)金線蓮在野外萌發(fā)所需的自然條件苛刻，加之生境的易碎性對其生存產(chǎn)生很大壓力[24]，因此金線蓮的遺傳多樣性受到生態(tài)環(huán)境極大的影響，所以有必要保護(hù)當(dāng)?shù)氐纳鷳B(tài)環(huán)境以維護(hù)金線蓮物種多樣性。