P53/P21通路在電針抑制骨質疏松大鼠模型成骨細胞衰老中的機制

鐘培瑞 何曉艷 廖瑛 孫光華 劉靜 周君 李書枝 劉媛 屈萌艱

南華大學衡陽醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院1康復醫(yī)學中心，2康復醫(yī)學科，3康復醫(yī)學實驗室（湖南衡陽 421001）；4衡陽市第一人民醫(yī)院呼吸內科（湖南衡陽 421001）

骨質疏松（osteoporosis，OP）好發(fā)于高齡人群，為臨床工作中常見疾?。?］。它可導致全身慢性疼痛、生存質量下降、顯著增加骨折風險，病理特征表現(xiàn)為骨量丟失、脆性增加及骨顯微結構紊亂等［2-5］。OP 發(fā)病率呈逐年上升趨勢，已經嚴重威脅到中老年人群的身體健康及生存質量，且其病因復雜、缺乏理想有效的阻斷或逆轉疾病進展的干預措施，進一步探討其發(fā)病及治療機制顯得尤為重要［6］。成骨細胞骨形成作用與破骨細胞的骨吸收作用在骨組織的穩(wěn)態(tài)結構維持過程中發(fā)揮著不可替代的作用，其中成骨細胞衰老為OP 的關鍵因素之一［7-9］。P53/P21 信號通路與成骨細胞衰老有著一定的聯(lián)系［10-11］。近年來傳統(tǒng)治療措施針灸已逐漸得到臨床認可，其可有效緩解疼痛、增加骨密度［12］，并具有副作用少、經濟、高效等優(yōu)點。但它是否能夠調控P53/P21 信號通路介導的成骨細胞衰老，并以此來發(fā)揮抗OP 作用，目前鮮有報道。本研究重點在于探討電針對高齡OP 大鼠的影響，并以OP 為出發(fā)點，進一步明確電針、P53/P21 信號通路、成骨細胞衰老之間的關系。

1 材料與方法

1.1 實驗動物24 只雄性SD 大鼠由青年大鼠（n= 8，6月齡）和老年大鼠（n= 16，27月齡）兩部分組成。實驗大鼠均購自成都達碩實驗動物有限公司，許可證號：SCXK（川）2020-030。

1.2 實驗設備高速冷凍離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司，H1650R）、熒光定量RCP 儀（美國Thermo，SPL0960）、化學發(fā)光成像系統(tǒng)（中國勤翔，ChemiScope6100）、生物樣品均質儀（中國杭州奧盛，BioPrep-24）、轉膜儀（中國北京六一，DYCZ-40D）、磁力攪拌器（中國雷磁，JB-13）、電泳槽（中國北京六一，DYCZ-24DN）、旋渦混合器（中國江蘇其林貝爾，GL-88B）、Micro-CT（廣州中科愷盛醫(yī)療科技有限公司）。

1.3 實驗主要試劑mRNA 逆轉錄試劑盒（中國北京康為世紀，CW2569）、ELISA 試劑盒（武漢華美生物工程有限公司，CSB-E12776r、CSB-E08081r）、P53 抗體（美國proteintech、10442-1-AP）、P21 抗體（美國proteintech、10355-1-AP）、HRP goat anti-mouse IgG 抗體（美國proteintech、SA00001-1）。

1.4 實驗分組及標本采集6月齡大鼠設為青年組［n= 8，（564.0 ± 52）g）］，27月齡大鼠分別設為老年組［n= 8，（672.0 ± 40）g］、電針治療組［n= 8，（672.0 ± 40）g］。電針干預穴位選擇：“腎俞”，雙側“血?！薄ⅰ白闳铩?，“太溪”、“陽陵泉”。每周干預5 次，每次干預30 min，總共8 周，干預參數(shù)：強度為1 mA，疏密波，頻率3/15Hz（參照課題組前期研究［13-14］）。處死大鼠后，眼眶采血5 mL，離心30 min 后取血清500 μL，行ELISA 檢測。取右側股骨遠端（長度0.5 ～1 cm）行PCR、WB 檢測。取左側股骨近端（長度0.5 ～1 cm）+腰5 椎體用于骨密度檢測（bone mineral density，BMD）。取右側脛骨近端（長度0.5 ～1 cm）+腰4 椎體行Micro-CT 掃描及微結構定量分析。

1.5 檢測方法

1.5.1 ELISAⅠ型膠原C末端肽（c-terminal crosslinking telopeptide of type I collagen，CTX-Ⅰ）、Ⅰ型膠原羧基端前肽（procollagen type I carboxy terminal peptide，PICP）等骨代謝指標使用ELISA 試劑盒檢測。

1.5.2 Micro-CTMicro-CT 檢測左側股骨近端、腰5 椎體BMD。從以下幾個方面對右側脛骨近端骨組織+腰4 椎體行微結構定量分析：（1）骨體積分數(shù)（bone volume fraction，BV/TV）；（2）骨小梁量（trabecular number，Tb.N）；（3）骨小梁厚度（trabecular thickness，Tb.Th）；（4）骨小梁分離度（trabecular separation，Tb.Sp）。

1.5.3 RT-qPCR取右側股骨遠端，Trizol 提取總RNA，組織總mRNA 為模板，逆轉錄cDNA，在NCBI上搜索目的基因的序列，運用primer5 軟件進行引物設計，引物序列見表1，其中β-actin 為內參，加入靶基因，上下游引物進行擴增。熒光染料SYBR法，定量PCR 擴增程序：95 ℃10 min，95 ℃15 s、60 ℃30 s、總計40 個循環(huán)，60 ～95 ℃行溶解曲線分析，計算基因相對表達量。

表1 引物信息Tab.1 Primer sequence

1.5.4 Western blot取右側股骨遠端骨組織，預冷PBS 洗組織，加入300 μL RIPA 裂解液于生物樣品均質儀中充分研磨，離心15 min（相關參數(shù)：4 ℃，12 000 r/min）。取上清液，并移至1.5 mL 離心管中。經制膠，電泳，轉膜，封閉，一、二抗孵育，顯色/曝光，底片掃描后使用quantity one 專業(yè)灰度分析軟件進行分析。

1.6 統(tǒng)計學方法本實驗使用SPSS 22.0 軟件進行統(tǒng)計分析，所獲數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 骨代謝指標ELISA 結果顯示：相對于青年組大鼠，老年組大鼠血清CTX-I 水平顯著高，PICP水平顯著低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；電針可降低老年大鼠CTX-I 水平，并增加PICP 水平（P＜0.01）。見表2。

表2 各組血清CTX-I、PICP 水平表達比較Tab.2 Comparison of serum CTX-I and PICP levels in each group±s

表2 各組血清CTX-I、PICP 水平表達比較Tab.2 Comparison of serum CTX-I and PICP levels in each group±s

注：與青年組比較，#P ＜0.01，##P ＜0.05；與老年組比較，*P ＜0.01，**P ＜0.05

指標CTX-I（pg/mL）PICP（ng/mL）青年組79.13±9.56 4.51±0.80老年組117.81±20.84#1.58±0.37#電針治療組89.66±9.40*3.96±0.40*F值15.630 61.525 P值＜0.001＜0.001

2.2 軟骨下骨及定量分析Micro-CT 顯示：相對于青年組大鼠，老年組大鼠椎體及脛骨骨小梁稀疏，在空間結構上呈現(xiàn)出紊亂分布表現(xiàn)。而通過電針治療后，大鼠骨組織中骨小梁相對稠密，空間分布也相對規(guī)則。定量分析：與青年大鼠比較，老年大鼠股骨、腰椎BMD 均顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。而電針治療可增加老年大鼠股骨、腰椎BMD（P＜0.01、P＜0.05）。與青年大鼠比較，老年大鼠脛骨及腰椎BV/TV、Tb.N 均降低（P＜0.01），Tb.Sp 增高（P＜0.01）。而電針治療可增加老年大鼠脛骨及腰椎BV/TV、Tb.N（P＜0.01），降低Tb.Sp（P＜0.01）。老年組腰椎Tb.Th 低于青年組（P＜0.01），電針治療組腰椎Tb.Th 較老年組增高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。見圖1 和表3、4。

表3 股骨及腰椎BMDTab.3 BMD of lumbar spine and femur in groups±s

表3 股骨及腰椎BMDTab.3 BMD of lumbar spine and femur in groups±s

注：與青年組比較，#P ＜0.01；與老年組比較，*P ＜0.01，**P ＜0.05

股骨BMD（g/cm2）腰椎BMD（g/cm2）青年組0.32 ± 0.03 0.22 ± 0.02老年組0.26 ± 0.01#0.10 ± 0.02#電針治療組0.29 ± 0.02*0.13 ± 0.02**F 值16.849 71.931 P 值＜0.001＜0.001

表4 軟骨下骨微結構定量分析Tab.4 Bone histomorphometry results in groups±s

表4 軟骨下骨微結構定量分析Tab.4 Bone histomorphometry results in groups±s

注：與青年組比較，#P ＜0.01，##P ＜0.05；與老年組比較，*P ＜0.01

部位脛骨腰椎指標BV/TV（%）Tb.Th（μm）Tb.N（mm-1）Tb.Sp（μm）BV/TV（%）Tb.Th（μm）Tb.N（mm-1）Tb.Sp（μm）青年組21.29 ± 3.74 0.09 ± 0.01 2.24 ± 0.33 0.32 ± 0.05 29.91 ± 4.41 0.10 ± 0.01 2.92 ± 0.31 0.29 ± 0.03老年組7.51 ± 3.62#0.10 ± 0.01##0.73 ± 0.36#0.97 ± 0.43#9.51 ± 3.63#0.08 ± 0.01#1.16 ± 0.46#0.61 ± 0.15#電針治療組15.19 ± 4.07*0.11 ± 0.01 1.46 ± 0.47*0.59 ± 0.16*19.60 ± 5.01*0.09 ± 0.01*2.01 ± 0.47*0.43 ± 0.08*F 值26.173 4.954 29.815 11.870 43.277 14.818 35.251 20.730 P 值＜0.001 0.017＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001

圖1 腰椎及脛骨Micro-CTFig.1 Micro-CT images of the proximal tibia and lumbar vertebra

2.3 P53/P21 mRNA 及蛋白表達水平老年組大鼠P53、P21 mRNA 及蛋白相對表達量較青年組明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；而電針能顯著降低老齡大鼠P53、P21 mRNA 表達（P＜0.01），相應的P53、P21 蛋白相對表達量也均有下降（P＜0.01），見圖2、表5。

圖2 P53、P21 mRNA 及蛋白表達水平Fig.2 The relative mRNA and protein expression of P53/P21

表5 P53、P21 mRNA 及蛋白表達水平Tab.5 The relative mRNA and protein expression of P53/P21±s

表5 P53、P21 mRNA 及蛋白表達水平Tab.5 The relative mRNA and protein expression of P53/P21±s

注：與青年組比較，#P ＜0.01；與老年組比較，*P ＜0.01，**P ＜0.05

mRNA Western blot指標P53 P21 P53 P21青年組0.77 ± 0.28 1.25 ± 0.33 0.29 ± 0.07 0.24 ± 0.03老年組4.38 ± 0.52#4.92 ± 0.71#0.60 ± 0.04#0.42 ± 0.05#電針治療組2.15 ± 0.63*2.19 ± 0.65*0.41 ± 0.05*0.34 ± 0.04**F 值80.712 63.417 49.481 25.039 P 值＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001

3 討論

高齡為OP 的重要高危因素之一，OP 不但能導致患者全身疼痛、脊柱畸形等，還會顯著增加骨折風險［15-16］。在老年人群中，髖部骨質疏松性骨折嚴重的影響著患者的運動功能，且患者在1年內的病死率甚至可高達21% ～30%［17-18］。鑒于OP給中老年人群心身健康帶來的影響，更深入的探索OP 治療新機制十分重要。

OP 治療貫穿于患者的整個生命過程，其治療存在多樣化。針灸為傳統(tǒng)治療措施，近年來逐漸受到重視，有效性已得到臨床廣泛認可［19］。Micro-CT檢測可直觀地反映出骨組織吸收與形成情況。本實驗中，我們發(fā)現(xiàn)與青年組大鼠比較，老年組大鼠腰椎及脛骨的骨小梁均呈現(xiàn)出分布紊亂稀疏、變薄等明顯骨吸收表現(xiàn)，而通過電針治療后，這種骨吸表現(xiàn)得到了有效的改善。相應的微結構定量分析也顯示：高齡可降低骨組織BMD、BV/TV、Tb.N，增加Tb.Sp。電針治療能增加骨組織BMD、BV/TV、Tb.N，降低Tb.Sp。老年組腰椎Tb.Th 低于青年組，電針治療組中腰椎Tb.Th 較老年組增高，直觀地反映了電針能夠有效減少高齡所致的骨量丟失，改善OP。同時，在本研究中發(fā)現(xiàn)老年組大鼠血清CTX-I 水平較青年組明顯增高，而血清PICP 水平較青年組明顯降低。眾所周知，CTX-1 為反映骨吸收的重要骨代謝指標，PICP 則是反映成骨細胞活性及骨轉換的特異性指標［20-21］，這間接提示高齡可能降低了大鼠成骨細胞的活性、增加骨吸收、抑制骨形成和導致骨量丟失。而通過對老年大鼠予以電針干預后，血清CTX-I 水平明顯降低，PICP水平顯著增加。上述實驗結果提示：電針治療可能通過提高老年大鼠成骨細胞活性來促進骨形成，抑制骨吸收。

細胞活性的降低伴隨著衰老，OP 的發(fā)病與P53/P21 信號通路介導的成骨細胞衰老之間有著密切聯(lián)系［10-11，22］。P53 可誘導細胞周期阻滯，并能激活下游基因P21［23-24］。P21 基因編碼的蛋白可與增殖細胞核抗原相結合，從而抑制DNA 的合成［25］。P21 為至關重要的周期蛋白依賴激酶抑制因子，其可通過結合CDK4-Cyclin 復合物使其激酶活性喪失，最終使細胞周期停滯［26-27］。衰老細胞中的P53、P21 等相關基因表達顯著增加［28］，下調P21 可減少成骨細胞凋亡、加速成骨細胞增殖周期G1期進程，抑制成骨細胞衰老［10，29-31］。本實驗中，老年組大鼠P53、P21 mRNA 及蛋白相對表達量較青年組明顯增加，這提示高齡可能加速了細胞衰老。而電針治療降低了P53、P21 mRNA 及蛋白相對表達量，這反映電針治療能夠抑制因高齡所導致的細胞衰老。結合上述電針能夠增加成骨細胞活性、促進骨形成、減少骨量丟失的研究結果，這提示電針可能通過調控P53/P21 信號通路來緩解成骨細胞衰老，并通過增加成骨細胞活性來增加骨形成、減少骨量丟失。

綜上所述，本實驗中發(fā)現(xiàn)高齡可能降低了骨組織中成骨細胞的活性，并因此使骨形成率減少。同時，發(fā)現(xiàn)高齡能夠使衰老相關基因P53、P21 等呈現(xiàn)出高表達，而細胞的逐步衰老會直接降低細胞的活性。通過電針干預高齡大鼠后，大鼠骨密度增加、骨量丟失減少，相關衰老基因表達下降，反映成骨細胞活性的PICP 也隨之增加。因此，在本實驗現(xiàn)有的研究基礎上，推測電針有可能通過抑制P53/P21 信號通路介導的成骨細胞衰老來增加成骨細胞活性，最終改善高齡所致的OP。

【Author contributions】ZHONG Peirui and HE Xiaoyan performed the experiments and wrote the article. SUN Guanghua，LIU Jing，LI Shuzhi and LIU Yuan performed the experiments. LIAO Ying and QU Mengjian revised the article. ZHOU Jun designed the study and reviewed the article. All authors read and approved the final manuscript as submitted.