卵孢小奧德蘑菌株的拮抗及ISSR遺傳分析

連燕萍 趙光輝 吳振強(qiáng) 袁濱 柯麗娜 張志鴻

（1. 漳州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所 福建漳州 363005；2. 福州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所 福建福州 350014）

卵孢小奧德蘑 [Oudemansiella raphanipes(Berk.) Pegler & T.W.K.Young]，也叫卵孢長(zhǎng)根菇，商品名為黑皮雞樅，隸屬于真菌界（Fungi）、擔(dān)子菌門（Basidiomycetes）、傘菌綱 （Agaricomy cetes）、蘑菇目（Agaricales）、膨瑚菌科（Physalacri ceae）、小奧德蘑屬（Oudemansiella）[1]。一直以來，學(xué)者們對(duì)長(zhǎng)根菇的分類分歧較大，曾將其命名為長(zhǎng)根小奧德蘑（O.radicata）[2]。直到2015年，郝艷佳等[3]通過形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)相結(jié)合的方法，對(duì)長(zhǎng)根菇進(jìn)行了系統(tǒng)的研究，最終將其定為卵孢小奧德蘑（Oudemansiella raphanipes）。卵孢小奧德蘑在我國(guó)大部分地區(qū)以及國(guó)外都有分布，是一種偏高溫結(jié)實(shí)性的木腐菌，其子實(shí)體呈黑褐色，菌肉細(xì)嫩爽口，味道極鮮[4]，當(dāng)前零售價(jià)較高，一般在 30~60元/kg。卵孢小奧德蘑子實(shí)體中蛋白含量很高，鮮味氨基酸的含量特別高[5]，子實(shí)體和菌絲發(fā)酵液中含有多種藥用成分，其中長(zhǎng)根菇素有降壓功效，長(zhǎng)根菇多糖有抗氧化和消炎護(hù)肝等作用，具有極高的藥用價(jià)值，是一種極具應(yīng)用價(jià)值的珍稀食用菌[6]。目前卵孢小奧德蘑在我國(guó)多個(gè)省市地區(qū)均有種植。由于卵孢小奧德蘑在我國(guó)的栽培歷史短，從20世紀(jì)80年代初期至今僅有30年左右的時(shí)間，研究重點(diǎn)主要在菌絲培養(yǎng)、栽培技術(shù)和生物學(xué)特性等方面[7-8]，在卵孢小奧德蘑菌株的親緣關(guān)系分析鑒定方面的報(bào)道極少，采用拮抗試驗(yàn)和ISSR-PCR標(biāo)記分析相結(jié)合的方法對(duì)卵孢小奧德蘑菌株進(jìn)行分析鑒定更為少見。隨著卵孢小奧德蘑種植范圍的擴(kuò)大、種植面積的增大，在生產(chǎn)及試驗(yàn)過程中菌種混雜、種源不清楚、同名異株、同株異名的問題漸漸出現(xiàn)，而且品種退化較嚴(yán)重，優(yōu)質(zhì)菌種利用率低，嚴(yán)重制約了產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。因此，本研究收集了15個(gè)來自國(guó)內(nèi)不同地區(qū)的卵孢小奧德蘑菌株，通過拮抗試驗(yàn)和ISSR-PCR標(biāo)記分析對(duì)收集到的菌株進(jìn)行分類鑒定及遺傳多樣性分析，以期明確卵孢小奧德蘑菌株的親緣關(guān)系，為卵孢小奧德蘑種質(zhì)資源保護(hù)、良種選育、雜交育種提供基礎(chǔ)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試材供試材料為15個(gè)卵孢小奧德蘑菌株，具體信息如下（表1）。

表1 供試的卵孢小奧德蘑菌株

1.1.2 試劑及引物Taq DNA聚合酶、dNTP、引物均購(gòu)自上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司，其他試劑均為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.1.3 培養(yǎng)基PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂18 g，水1 000 mL，121 ℃滅菌20 min。

1.2 方法

1.2.1 拮抗試驗(yàn)將供試菌株進(jìn)行擴(kuò)繁培養(yǎng)，取菌齡相同的菌株進(jìn)行試驗(yàn)，按品字形將3個(gè)不同菌株接種到同一平板中[9]，置于25℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待菌絲長(zhǎng)滿后，觀察不同菌株間的拮抗反應(yīng)情況。試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

1.2.2 供試菌株DNA提取基因組DNA采用試劑盒法進(jìn)行提取。

1.2.3ISSR-PCR分析ISSR引物篩選：選取能夠擴(kuò)增出穩(wěn)定特異條帶的20條引物，對(duì)供試菌株進(jìn)行擴(kuò)增（表2）。

表2 供試菌株鑒定所用ISSR引物

ISSR-PCR擴(kuò)增體系：在25 μL反應(yīng)體系中，引物1 μL、dNTPs 2 μL、Taq酶0.3 μL、Buffer緩沖液2.5 μL、模板DNA1 μL、ddH2O 18.2 μL。

ISSR-PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，44~52 ℃退火45 s，72 ℃延伸90 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸 10 min。

ISSR-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)：1.0%瓊脂糖凝膠（含0.5 μg/mL GoldviewTMDNA染料）電泳檢測(cè)。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析供試菌株的拮抗試驗(yàn)結(jié)果以NY/T 1845—2010為鑒定方法進(jìn)行判斷。

ISSR分析是通過對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物的分析，將出現(xiàn)的穩(wěn)定性條帶記為1，無條帶記為0，得到矩陣表，通過公式算出多態(tài)位點(diǎn)百分率P[10]。通過NTSYS-pc 2.0軟件進(jìn)行聚類分析，得出遺傳聚類分析圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 供試菌株的拮抗反應(yīng)分析

拮抗反應(yīng)分析是初步鑒定菌株差異的方法。若菌絲長(zhǎng)滿后，菌株之間的菌絲無明顯差異、菌落交界處能融合，可初步鑒定為無拮抗反應(yīng)；若菌絲長(zhǎng)滿后，菌絲接觸區(qū)出現(xiàn)隔離拮抗線、溝壑狀、菌絲隆起或者產(chǎn)生色素帶等，則初步鑒定為有拮抗反應(yīng)。如圖1所示，菌株2與菌株5、11之間的拮抗反應(yīng)明顯，表現(xiàn)為溝壑狀，菌株5與菌株11的拮抗反應(yīng)表現(xiàn)為不明顯的拮抗線，菌株5、6、8之間沒有拮抗反應(yīng)。供試的15個(gè)菌株之間的拮抗反應(yīng)結(jié)果具有一定的差異，拮抗反應(yīng)結(jié)果見表3。從表3可以看出，有44組產(chǎn)生拮抗反應(yīng)，61組沒有產(chǎn)生拮抗反應(yīng)，其中菌株1與菌株2、3、14有明顯的拮抗線，菌株2、3、14 與其他菌株之間的拮抗線也非常明顯，均呈現(xiàn)為溝壑狀拮抗線。其他菌株之間的拮抗反應(yīng)不明顯，大部分菌株在平板上沒有拮抗反應(yīng)。

圖1 供試菌株拮抗圖

表3 供試菌株間的拮抗反應(yīng)情況

2.2 供試菌株的遺傳相似系數(shù)分析

遺傳相似系數(shù)通常用來度量群體或個(gè)體間的相似程度。樣本的遺傳關(guān)系越近，遺傳相似系數(shù)越大，反之相似系數(shù)越小[11]。試驗(yàn)結(jié)果表明，15個(gè)供試菌株的遺傳相似系數(shù)在0.420~0.885，平均值為0.628；其中菌株2和菌株3遺傳相似系數(shù)最大，表明這2個(gè)菌株在這15個(gè)引進(jìn)菌株群體中的親緣關(guān)系最近；而菌株6與菌株14遺傳相似系數(shù)最小，表明這2個(gè)菌株的親緣最遠(yuǎn)。菌株2、3，菌株4、9，菌株7、8，菌株9、13，菌株11、12，菌株13、15之間的遺傳相似系數(shù)均≥0.75，遠(yuǎn)大于平均值，表明這幾個(gè)菌株間的親緣關(guān)系相對(duì)較近；從遺傳相似矩陣數(shù)值（表4）分布可以看出，遺傳相似系數(shù)≥0.8占比2.9%，遺傳相似系數(shù)≤0.5占比3.8%，遺傳相似系數(shù)為0.7~0.79、0.60~0.69、0.50~0.59占比分別為19.1%、41%、33.3%，表明這15個(gè)菌株間具有一定的遺傳多樣性和較高的遺傳豐富度。

表4 相似性矩陣表

2.3 供試菌株的ISSR多態(tài)性分析

試驗(yàn)選取能夠擴(kuò)增出穩(wěn)定特異條帶的20條引物對(duì)卵孢小奧德蘑菌株進(jìn)行ISSR擴(kuò)增，分別為807、811、815、834、840、841、842、844、853、854、864、876、884、885、886、887、888、889、895、899。這20條引物對(duì)卵孢小奧德蘑菌株均能擴(kuò)增出穩(wěn)定條帶，多態(tài)性條帶在11~24條，共擴(kuò)增出357條穩(wěn)定性條帶，其中多態(tài)性條帶達(dá)329條，多態(tài)性比率為92.16%。圖2為引物864、884、899擴(kuò)增供試菌株的指紋圖譜。

圖2 引物864、884、899對(duì)卵孢小奧德蘑菌株擴(kuò)增的ISSR指紋圖譜

2.4 供試菌株DNA擴(kuò)增圖譜聚類分析

卵孢小奧德蘑菌株DNA擴(kuò)增圖譜聚類見圖3。從圖3可以看出，15個(gè)卵孢小奧德蘑菌株在相似性系數(shù)約為0.72水平時(shí)，可聚成7個(gè)類群：第1個(gè)類群為菌株1（山雞樅）；第2個(gè)類群為菌株4（天華雞樅）、9（南昌雞樅）、13（南靖雞樅2）、15（武漢雞樅2）；第3個(gè)類群為菌株5（建木雞樅）、7（Q002）、8（南靖雞樅1）；第4個(gè)類群為菌株10（S雞樅）、11（中樅）、12（HP）；第5個(gè)類群為菌株6（所雞樅）；第6個(gè)類群為菌株2（分雞樅）、3（四川雞樅）；第7個(gè)類群為菌株14（武漢雞樅1）。

圖3 卵孢小奧德蘑菌株ISSR多態(tài)性的聚類圖

供試菌株之間的遺傳相似系數(shù)在0.56~1.00，說明這15個(gè)菌株的遺傳相似性較高，基因來源較窄，其中菌株2、3的相似系數(shù)最高，為0.89，說明這2個(gè)菌株的親緣關(guān)系比較近。菌株9、13的相似系數(shù)達(dá)0.81，說明這2個(gè)菌株的親緣關(guān)系較近，但有一定的差異性，同時(shí)這2個(gè)菌株與菌株4的相似系數(shù)約為0.785，與同一類群的菌株15的相似系數(shù)約為0.725。第3類群的菌株7、8相似系數(shù)為0.77，與同類群的菌株5的相似系數(shù)約為0.735。第4類群的菌株10、11的相似系數(shù)約為0.79，與同一類群的菌株12相似系數(shù)約為0.74。菌株2、3和菌株14的相似系數(shù)約為0.61。第6類群的菌株2、3與第7類群的菌株14組成分支，與其他類群組成的分支的相似系數(shù)最小僅為0.56。

3 討論

人們最早通過菌落生長(zhǎng)特征、子實(shí)體形態(tài)特征的不同來鑒別不同食用菌菌株，但由于所需周期長(zhǎng)、易受環(huán)境和主觀因素的影響，難以鑒別形態(tài)差異不明顯的菌株[12-13]。拮抗試驗(yàn)是在生理水平上的體細(xì)胞不親和性試驗(yàn)[14-15]，具有簡(jiǎn)單、快速、直觀等特點(diǎn)，食用菌普遍存在體細(xì)胞不親和性現(xiàn)象，因此拮抗試驗(yàn)常用來初步鑒定不同菌株間的遺傳差異[16-17]。研究表明，拮抗試驗(yàn)中對(duì)峙培養(yǎng)的菌株在菌落交界處的菌絲可分為隔離型、隆起型、色線型、溝壑型4種[18]。在本試驗(yàn)中，通過拮抗試驗(yàn)，供試的15個(gè)菌株中，菌株2、3、14與其他菌株之間有明顯的拮抗反應(yīng)，均呈現(xiàn)為溝壑型，初步說明菌株2、3、14與其他菌株的親緣關(guān)系比較遠(yuǎn)。其他菌株之間的拮抗反應(yīng)不明顯，甚至沒有拮抗線，初步說明這些菌株的親緣關(guān)系比較近。

ISSR技術(shù)（Inter Simple Sequence Repeats）因具有穩(wěn)定性強(qiáng)、多態(tài)性好、嚴(yán)謹(jǐn)度高、重復(fù)性好、高效快速等特點(diǎn)，目前被廣泛應(yīng)用于食用菌種質(zhì)資源鑒定及遺傳多樣性分析等方面[19]。張介馳等[13]利用ISSR分子標(biāo)記，快速準(zhǔn)確地將黑木耳生產(chǎn)菌株有效地區(qū)分開。宋小亞等[20]通過ISSR標(biāo)記對(duì)黑木耳單核體菌株進(jìn)行遺傳分析，發(fā)現(xiàn)各個(gè)擔(dān)孢子充分雜交或與某一親本相類似，從而反映出不同單核體菌株之間的遺傳變異。賈定洪等[21]利用拮抗與ISSR方法對(duì)香菇菌株進(jìn)行鑒定，結(jié)果表明，ISSR技術(shù)能夠清晰區(qū)分2個(gè)菌株并量化出2個(gè)菌株間的遺傳差異。馮偉林等[22]利用ISSR技術(shù)篩選的11個(gè)引物對(duì)12個(gè)杏鮑菇菌株基因組進(jìn)行PCR擴(kuò)增并構(gòu)建指紋圖譜，發(fā)現(xiàn)ISSR技術(shù)能夠?qū)⑿吁U菇菌株聚為3個(gè)群，清晰地揭示出了12個(gè)杏鮑菇菌株間的遺傳關(guān)系。本試驗(yàn)利用篩選到的20條引物對(duì)15個(gè)卵孢小奧德蘑菌株進(jìn)行PCR擴(kuò)增，ISSR分析結(jié)果顯示，DNA指紋圖譜多態(tài)性較高。結(jié)合相似性系數(shù)矩陣表，在相似性系數(shù)約為0.72水平時(shí)，將供試菌株分成7個(gè)類群，表明這15個(gè)卵孢小奧德蘑菌株具有一定的遺傳多樣性與差異。

前人研究顯示，雙孢蘑菇[11]、香菇[21]、杏鮑菇[22]、白靈菇[23]、靈芝[24]、真姬菇[25]、姬松茸[26]等拮抗反應(yīng)結(jié)果與ISSR分析或其他分子鑒定方法的分類結(jié)果相吻合，但也有少部分拮抗試驗(yàn)結(jié)果與聚類分析存在差異。楊和川等[27]研究發(fā)現(xiàn)，拮抗試驗(yàn)不能完全準(zhǔn)確鑒定金針菇菌株的遺傳差異。趙淑英等[28]發(fā)現(xiàn)，金針菇菌株的拮抗試驗(yàn)結(jié)果與聚類分析結(jié)果有一定的差異。袁濱等[29]利用拮抗反應(yīng)結(jié)合ISSR-PCR鑒定11個(gè)灰樹花菌株，拮抗反應(yīng)與ISSR分析結(jié)果存在差異。本研究通過拮抗反應(yīng)試驗(yàn)與ISSR分析鑒定15個(gè)卵孢小奧德蘑菌株，菌株2、3和菌株14與其他菌株之間的拮抗反應(yīng)強(qiáng)烈，菌株2、3和菌株14在聚類圖中分別單獨(dú)聚成一類，這表明，拮抗反應(yīng)與ISSR分析鑒定具有一定的一致性。同樣條件下，菌株1、6也分別單獨(dú)聚成一類，且與其他菌株之間的相似系數(shù)均比較低，但拮抗試驗(yàn)表明，菌株1、6與大部分菌株均沒有明顯拮抗現(xiàn)象。拮抗結(jié)果中有44組產(chǎn)生拮抗反應(yīng)，61組沒有產(chǎn)生拮抗反應(yīng)，沒有拮抗反應(yīng)的組別較多，但是在聚類分析中菌株之間的相似系數(shù)均比較低，這說明拮抗結(jié)果與ISSR分析結(jié)果存在一定的差異，可能原因是拮抗試驗(yàn)與菌種繼代培養(yǎng)次數(shù)或者培養(yǎng)基有一定關(guān)系，這也說明拮抗試驗(yàn)只能為初步鑒定菌株提供參考，最終應(yīng)結(jié)合分子標(biāo)記技術(shù)等多種鑒定方法進(jìn)行綜合分析評(píng)價(jià)。本試驗(yàn)結(jié)果表明，供試的15個(gè)菌株的來源地與聚類分析結(jié)果相關(guān)性不明顯，出現(xiàn)不同地區(qū)來源的菌株聚為一類，說明這15個(gè)菌株的遺傳基礎(chǔ)相對(duì)集中，也可能在栽培與品種選育的過程中，出現(xiàn)了不同地區(qū)之間相互引種或菌株分離、親本雜交的現(xiàn)象。

本研究采用拮抗試驗(yàn)與ISSR分子標(biāo)記相結(jié)合的方法來分析15個(gè)卵孢小奧德蘑菌株的遺傳多樣性，結(jié)果表明，15個(gè)菌株具有一定的遺傳差異與多樣性，其中菌株2、3關(guān)系較近且聚成一類，菌株1、6、14均單獨(dú)聚成一類，說明與其他菌株有較大差異，可作為品種選育的親本菌株。前人研究結(jié)果表明，利用多種分子標(biāo)記分析比單獨(dú)使用一種分子標(biāo)記鑒定的結(jié)果更準(zhǔn)確[30]。因此，后續(xù)可以考慮結(jié)合多種分子標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行驗(yàn)證，為卵孢小奧德蘑菌株新品種選育和雜交育種提供依據(jù)。