青梅野生酵母菌的篩選鑒定與耐受性研究

杜沁嶺，屠婷瑤，徐文，王松濤，董怡，賈冬英*

1(四川大學(xué) 輕工科學(xué)與工程學(xué)院，四川 成都，610065)2(瀘州品創(chuàng)科技有限公司，四川 瀘州，646000)

青梅果含有多種有機(jī)酸、礦物質(zhì)、維生素、多酚、黃酮等物質(zhì)，具有濃郁的香氣和突出的特征風(fēng)味，是釀造養(yǎng)生果酒的良好原料[1]。青梅果酒不僅具有良好的口感與獨(dú)特的風(fēng)味，同時(shí)能有效保留青梅中的營(yíng)養(yǎng)與活性成分[2-3]，成為亞洲地區(qū)深受歡迎的發(fā)酵酒。

酵母菌是果酒生產(chǎn)最為關(guān)鍵的因素，對(duì)其品質(zhì)至關(guān)重要。目前，國(guó)內(nèi)青梅果酒釀造主要采用葡萄酒釀造酵母，將其用于青梅發(fā)酵時(shí)不能較好地適應(yīng)青梅汁的高酸環(huán)境，導(dǎo)致青梅果酒發(fā)酵時(shí)間長(zhǎng)、酒體單薄、風(fēng)味不足、缺乏典型性[4]。因此，篩選優(yōu)良青梅果酒釀造專(zhuān)用酵母是提高其品質(zhì)的關(guān)鍵。目前，國(guó)內(nèi)外有關(guān)青梅果酒釀造專(zhuān)用酵母的研究較少，且大多以青梅自然發(fā)酵液或者青梅果實(shí)作為菌種分離源。趙玲燕[5]從青梅發(fā)酵液中分離出100株酵母，通過(guò)三級(jí)篩選獲得1株產(chǎn)酒精和發(fā)酵能力較好的青梅釀酒酵母；王輝等[6]從大肉青梅自然發(fā)酵液中分離出1株能耐受pH 3.0和葡萄糖質(zhì)量濃度為400 g/L且可產(chǎn)生良好香氣的酵母菌。然而，目前尚未見(jiàn)這些酵母菌用于青梅果酒生產(chǎn)的報(bào)道。糖漬能夠抑制青梅的雜菌生長(zhǎng)和部分代謝酶的活性，同時(shí)還能保留青梅特有的香氣，降低有機(jī)酸含量，是制備青梅露和保留青梅風(fēng)味的有效方法，也是獲取青梅野生酵母的重要途徑。本研究從糖漬青梅液和青梅果皮中分離出10株野生酵母菌，通過(guò)形態(tài)學(xué)觀察和發(fā)酵特性研究篩選出6株酵母菌，采用26S rDNA序列分析對(duì)其進(jìn)行鑒定，并探討了其耐受乙醇、葡萄糖和低pH的能力，以期獲得具有良好發(fā)酵性能的青梅果酒專(zhuān)用酵母，為優(yōu)質(zhì)青梅果酒的生產(chǎn)提供重要保障。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

糖漬青梅液是成都大邑種植的新鮮青梅洗凈、瀝水后稱(chēng)重，分別加入其質(zhì)量30%、40%、50%的白砂糖，密封后分別于室溫下放置至白砂糖完全溶解；YPD固體培養(yǎng)基、YPD液體培養(yǎng)基，青島海博生物技術(shù)有限公司；無(wú)水葡萄糖、無(wú)水乙醇等，國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

GHP-9080隔水式培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；UV-6000PC紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海元析儀器有限公司；ZHWY-1102C恒溫培養(yǎng)振蕩器，上海智城分析儀器制造有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 酵母菌分離純化

將1 mL糖漬青梅液以10倍梯度稀釋法稀釋至10-3～10-7，取0.1 mL稀釋液于YPD固體培養(yǎng)基上，涂布均勻后28 ℃下培養(yǎng)2 d。觀察菌落形態(tài)后挑取表面光滑濕潤(rùn)、中間隆起的具有典型酵母菌形態(tài)特征的單個(gè)菌落進(jìn)行平板劃線，純化培養(yǎng)2次后顯微鏡下觀察其菌體形態(tài)、形狀、繁殖方式，然后進(jìn)行保藏。

1.2.2 酵母菌篩選

(1)產(chǎn)氣性能測(cè)定：在含有杜氏小管的YPD液體培養(yǎng)基中加入分離出的酵母菌，分別于28 ℃下培養(yǎng)24、48 h觀察杜氏管中出現(xiàn)氣體的情況[7]。

(2)產(chǎn)乙醇、產(chǎn)香和發(fā)酵能力測(cè)定：按照2%(體積分?jǐn)?shù))的接種量(菌液濃度為107CFU/mL)，將分離菌株接種于100 mL YPD液體培養(yǎng)基(葡萄糖質(zhì)量濃度調(diào)整為260 g/L)，28 ℃下振蕩(100 r/min)發(fā)酵8 d，測(cè)定發(fā)酵液的酒精度[7]，評(píng)價(jià)發(fā)酵液的香氣，并參照GB/T 10345—2022《白酒分析方法》測(cè)定其總酯含量[8]，相同條件下以未調(diào)整葡萄糖的YPD液體培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵力測(cè)定，發(fā)酵過(guò)程中每隔12 h測(cè)定1次質(zhì)量，直至第8天。以發(fā)酵時(shí)間(x，min)為橫坐標(biāo)，CO2質(zhì)量損失(y，g)為縱坐標(biāo)，繪制發(fā)酵力曲線[7]。

1.2.3 酵母菌分子生物學(xué)鑒定

在北京擎科生物科技有限公司完成。采用通用引物NL1(5′-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3′)和NL4(5′-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3′)進(jìn)行26S rDNA擴(kuò)增并測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果在 NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中與已知序列進(jìn)行同源比對(duì)分析，并采用MEGA 7.0軟件繪制系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.2.4 酵母菌耐受性測(cè)定

參照李亞輝等[7]的方法對(duì)篩選酵母菌的耐受性進(jìn)行測(cè)定，并稍作修改。調(diào)整YPD液體培養(yǎng)基中乙醇的體積分?jǐn)?shù)(4%、6%、8%、10%、12%)，葡萄糖的質(zhì)量濃度(300、350、400、450、500 g/L)和pH(2.5、2.7、2.9、3.1、3.3、3.5)，按照1.2.2(2)方式接種，于28 ℃下振蕩(150 r/min)發(fā)酵48 h，在600 nm下測(cè)定發(fā)酵液的OD值，分別以不添加乙醇、葡萄糖、乳酸的YPD培養(yǎng)基為空白對(duì)照。

1.3 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 酵母菌的篩選

2.1.1 形態(tài)觀察

對(duì)分離純化后得到的酵母菌進(jìn)行形態(tài)觀察和顯微鏡鏡檢后除去重復(fù)菌株，共篩選出10株酵母菌，編號(hào)為J1～J10，其菌落形態(tài)和細(xì)胞形態(tài)分別見(jiàn)表1和圖1。10株菌的菌落形態(tài)相似，多為疏松狀、圓形、突起、濕潤(rùn)、光滑的典型酵母菌落形態(tài)，但其菌落顏色、邊緣規(guī)則程度和挑起性卻不盡相同。細(xì)胞形態(tài)均為出芽繁殖，形狀分橢圓形和圓形兩種。

表1 分離酵母菌的菌落形態(tài)和細(xì)胞形態(tài)

圖1 分離酵母菌的細(xì)胞形態(tài)

2.1.2 產(chǎn)氣性能

10株菌的產(chǎn)氣能力見(jiàn)表2?？梢钥闯?，除J1外，發(fā)酵48 h后其余9株菌的發(fā)酵液均出現(xiàn)產(chǎn)氣，表明這些菌株生長(zhǎng)和發(fā)酵速率快，因此選擇該9株菌進(jìn)入后續(xù)的篩選實(shí)驗(yàn)。

表2 酵母菌產(chǎn)氣能力

2.1.3 產(chǎn)酒能力

9株菌發(fā)酵8 d后所得發(fā)酵液的酒精度差異較大(表3)。其中，J7、J8和J9產(chǎn)乙醇能力極強(qiáng)，顯著高于其他6株菌(P<0.05)，其發(fā)酵液的酒精度均高于10%vol；J3、J4、J5和J10有一定的產(chǎn)乙醇能力，其發(fā)酵液的酒精度均超過(guò)4.5%vol；但J2和J6產(chǎn)乙醇能力較差，其發(fā)酵液的酒精度均低于4%vol。

表3 九株酵母菌的產(chǎn)酒與產(chǎn)香能力及其發(fā)酵液的香氣

2.1.4 產(chǎn)香能力

酵母菌在發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的風(fēng)味物質(zhì)大多以酯類(lèi)形式存在。9株菌均具有一定的產(chǎn)香能力，其發(fā)酵液的總酯含量和香氣見(jiàn)表3。其中，J3、J5、J6和J10的產(chǎn)酯能力明顯高于其他5株菌(P<0.05)，以J5的產(chǎn)酯能力最高(2.56 g/L)，其發(fā)酵液的總酯含量均超過(guò)2 g/L，且香氣濃郁。其余5株菌的產(chǎn)酯能力較低，J7和J9發(fā)酵液的總酯含量?jī)H為0.93 g/L和0.87 g/L，且香氣平淡。由于青梅果酒發(fā)酵菌的選育需要綜合考慮其產(chǎn)酒和產(chǎn)香能力，因此淘汰產(chǎn)酒和產(chǎn)香能力均差的J2和J4。將篩選后得到的7株菌分為兩大類(lèi)，即產(chǎn)乙醇能力強(qiáng)菌株(J7、J8、J9)和產(chǎn)酯能力強(qiáng)菌株(J3、J5、J6、J10)，分別測(cè)定其發(fā)酵力。

2.1.5 發(fā)酵力

酵母菌可利用糖進(jìn)行發(fā)酵，并產(chǎn)生大量的CO2和乙醇，故CO2質(zhì)量損失的多少可用于判斷菌株發(fā)酵能力的強(qiáng)弱[9]。產(chǎn)乙醇能力強(qiáng)菌株的發(fā)酵力如圖2所示。在發(fā)酵前36 h，J7、J8、J9發(fā)酵液的CO2產(chǎn)生量均隨發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)而增加，第36 h時(shí)達(dá)到最大，CO2質(zhì)量損失分別為3.52、3.21、3.49 g，說(shuō)明此時(shí)菌株處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，開(kāi)始大量繁殖；36 h后隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，CO2產(chǎn)生量逐漸下降；第132 h時(shí)，3株菌發(fā)酵力基本相當(dāng)，CO2幾乎無(wú)質(zhì)量損失，表明132 h后所有菌株已完成發(fā)酵。

圖2 產(chǎn)乙醇能力強(qiáng)菌株的發(fā)酵力

產(chǎn)酯能力強(qiáng)菌株的發(fā)酵力如圖3所示。在發(fā)酵前24 h，J3、J5、J6、J10發(fā)酵液的CO2產(chǎn)生量均隨發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，第24 h時(shí)達(dá)到最大，CO2質(zhì)量損失分別為1.21、0.97、1.18、1.16 g，表明此時(shí)菌株進(jìn)入發(fā)酵旺盛期；24 h后隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，CO2產(chǎn)生量逐漸下降，第180 h時(shí)，4株菌發(fā)酵力基本相當(dāng)，CO2幾乎無(wú)質(zhì)量損失，說(shuō)明180 h后所有菌株已完成發(fā)酵。該4株菌的起酵時(shí)間較上述3株產(chǎn)乙醇菌提前了12 h，且CO2產(chǎn)生量普遍較低，這可能是產(chǎn)酯菌與產(chǎn)乙醇菌隸屬于不同酵母菌種，具有不同的適宜生長(zhǎng)條件、代謝特點(diǎn)和發(fā)酵能力[10]。產(chǎn)乙醇菌的生長(zhǎng)能力更強(qiáng)，對(duì)發(fā)酵底物利用更充分，能夠釋放出更多的CO2?？衫么颂匦詫⒃?種不同類(lèi)型酵母菌分別接種進(jìn)行青梅果酒發(fā)酵。綜合以上結(jié)果，淘汰發(fā)酵力較弱的J5(CO2質(zhì)量損失<1 g)，選擇其余6株菌進(jìn)行后續(xù)的分子生物學(xué)鑒定和耐受性實(shí)驗(yàn)。

圖3 產(chǎn)酯能力強(qiáng)菌株的發(fā)酵力

2.2 篩選菌株的鑒定

對(duì)6株菌DNA分別進(jìn)行提取和PCR擴(kuò)增后得到其電泳圖(圖4)。全部菌株的DNA片段長(zhǎng)度在500～750 bp左右，其基因序列長(zhǎng)度符合酵母菌理論預(yù)期[11]。用MEGA軟件處理同源菌株基因得到6株菌的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(圖5)。J7、J8和J9與釀酒酵母的同源性較高，J3、J6和J10與葡萄汁有孢漢遜酵母同源性較高。因此，確定前3株菌為釀酒酵母，后3株菌為葡萄汁有孢漢遜酵母。

圖4 酵母菌 PCR擴(kuò)增電泳圖

圖5 六株酵母菌的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

2.3 酵母菌的耐受性

2.3.1 乙醇耐受性

高濃度乙醇可抑制酵母菌細(xì)胞的生長(zhǎng)和活力，影響其發(fā)酵效果[12]。6株酵母菌的乙醇耐受性見(jiàn)表4。隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)增加，6株菌的耐受能力逐漸減弱，且3株釀酒酵母對(duì)乙醇的耐受能力明顯強(qiáng)于3株葡萄汁有孢漢遜酵母(P<0.05)，以J7和J8的耐受性最強(qiáng)，它們?cè)?0%乙醇中仍可生長(zhǎng)旺盛。耐乙醇能力強(qiáng)的菌株可使發(fā)酵更完全，從而提高發(fā)酵酒的酒精度[13]。雖然3株釀酒酵母在高于10%乙醇中耐受能力減弱，但在YPD培養(yǎng)基發(fā)酵中產(chǎn)生酒精度超過(guò)10%vol，說(shuō)明其適應(yīng)性馴化能力較強(qiáng)，這種類(lèi)型酵母可通過(guò)采用基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)方式提高其乙醇耐受性[14]。葡萄汁有孢漢遜酵母的生長(zhǎng)受到高體積分?jǐn)?shù)乙醇的顯著抑制，J3、J6和J10分別在8%、6%和8%乙醇條件下生長(zhǎng)受到抑制。隨著發(fā)酵的進(jìn)行，培養(yǎng)基中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)缺乏和乙醇含量增加對(duì)非釀酒酵母生長(zhǎng)的抑制作用更加明顯，這與馮文倩等[15]關(guān)于葡萄汁有孢漢遜酵母對(duì)乙醇的耐受結(jié)果相似。本研究中篩選出的6株菌對(duì)乙醇的耐受能力高于從青梅自然發(fā)酵液中篩選得到的酵母菌[6]。

表4 六株酵母菌的乙醇耐受性

2.3.2 葡萄糖耐受性

葡萄糖是酵母菌發(fā)酵的動(dòng)力能源，但其濃度過(guò)高則會(huì)抑制酵母菌的生長(zhǎng)，優(yōu)良酵母菌株應(yīng)具備較高的葡萄糖耐受能力[16]。6株酵母菌的葡萄糖耐受性見(jiàn)表5。6株菌均能耐受400 g/L葡萄糖，且3株釀酒酵母在<400 g/L葡萄糖中的生長(zhǎng)能力明顯強(qiáng)于3株葡萄汁有孢漢遜酵母(P<0.05)，以J7的耐受能力最強(qiáng)。這是因?yàn)獒劸平湍讣?xì)胞能充分利用葡萄糖進(jìn)行生長(zhǎng)繁殖，產(chǎn)生更多的乙醇[17]。釀酒酵母J7、J8和J9對(duì)葡萄糖的耐受能力隨其質(zhì)量濃度的增加先增大后減弱，在初始葡萄糖為300 g/L時(shí)耐受性最強(qiáng)；產(chǎn)酯酵母J3、J6和J10對(duì)葡萄糖的耐受能力隨其質(zhì)量濃度的增加持續(xù)減弱。造成該兩種類(lèi)型酵母對(duì)葡萄糖耐受能力變化趨勢(shì)不同的原因在于外部環(huán)境的滲透壓對(duì)兩種酵母細(xì)胞代謝酶活性抑制的臨界條件不同[18]。然而，當(dāng)初始葡萄糖為450 g/L時(shí)，3株釀酒酵母均表現(xiàn)出明顯的生長(zhǎng)抑制，其生長(zhǎng)能力顯著低于葡萄汁有孢漢遜酵母(P<0.05)。這可能是因?yàn)獒劸平湍冈诟咛菞l件下發(fā)酵更加徹底，將糖分轉(zhuǎn)化為更多的酒精，從而抑制其生長(zhǎng)。當(dāng)初始葡萄糖為500 g/L時(shí)，6株菌均不具備生長(zhǎng)能力。

表5 六株酵母菌的葡萄糖耐受性

2.3.3 低pH耐受性

酸脅迫是果酒發(fā)酵過(guò)程中最常見(jiàn)的不利條件之一。一般情況下，釀酒酵母最適生長(zhǎng)pH為3.8～6.0，極少數(shù)用于果酒發(fā)酵的酵母菌可能具有耐受pH 3.2的環(huán)境條件[19-20]。因此，篩選可耐受低pH環(huán)境的酵母菌是青梅果酒釀造的關(guān)鍵[2]。6株菌的低pH耐受性見(jiàn)表6。在pH為3.3～3.5時(shí)，6株菌均能正常生長(zhǎng)(OD600<2.0)，但其耐受能力有所差異。其中，J3、J7、J9和J10耐受能力明顯高于J6和J8(P<0.05)，以J7耐受能力最強(qiáng)；當(dāng)pH<3.3時(shí)，6株菌的耐受能力均隨著pH降低逐漸減弱；當(dāng)pH為2.9時(shí)，J3、J6、J7、J8和J9仍可正常生長(zhǎng)，以J9和J6的生長(zhǎng)最為旺盛，但J10表現(xiàn)出明顯的生長(zhǎng)抑制(P<0.05，0.5

表6 六株酵母菌的低pH耐受性

3 結(jié)論

本研究從糖漬青梅液和新鮮青梅果皮中分離出青梅野生酵母菌，并探討了其發(fā)酵特性。通過(guò)菌落形態(tài)和細(xì)胞形態(tài)觀察篩選出10株不同形態(tài)的酵母菌，編號(hào)為J1～J10；通過(guò)比較菌株的產(chǎn)氣、產(chǎn)酒和產(chǎn)香能力及發(fā)酵力獲得6株具備優(yōu)良性能的酵母菌，分別為J3、J6、J7、J8、J9、J10；26S rDNA測(cè)序鑒定為釀酒酵母(J7、J8、J9)和葡萄汁有孢漢遜酵母(J3、J6、J10)。6株酵母菌具備較好的耐受能力，能耐受4%(體積分?jǐn)?shù))、400 g/L葡萄糖和pH 3.1的環(huán)境條件，且釀酒酵母對(duì)乙醇的耐受能力強(qiáng)于葡萄汁有孢漢遜菌，但其對(duì)葡萄糖耐受能力低于后者。整體而言，本研究篩選獲得的6株酵母菌具備良好的發(fā)酵性能和較好的生長(zhǎng)特性與耐受能力，經(jīng)過(guò)馴化后有望成為優(yōu)質(zhì)青梅果酒釀造菌種。