基于Lachancea thermotolerans-Saccharomyces cerevisiae雙酵母混合發(fā)酵酸啤酒的工藝研究

付曉芬，郭立蕓，侍亞敏，謝鑫，宋玉梅，李十中

1(北京燕京啤酒股份有限公司技術(shù)中心，啤酒釀造技術(shù)北京市重點實驗室，北京，101300)2(清華大學核能與新能源技術(shù)研究院，北京，100084)

伴隨著生活方式的轉(zhuǎn)變與消費需求的多元化，新一代啤酒消費者對于個性化釀造和新風格啤酒的需求日益增長，促使啤酒企業(yè)不斷向產(chǎn)品多元化和高端化方向布局。非釀酒酵母是商業(yè)啤酒釀造中的非常規(guī)酵母，雖然其發(fā)酵性能不如釀酒酵母，但其對啤酒總體香氣特征的復雜性和多樣性有著積極的影響。近年來，對非傳統(tǒng)酵母的開發(fā)和應用成為中外葡萄酒和精釀啤酒的熱點，針對非釀酒酵母在發(fā)酵技術(shù)和方法上也不斷產(chǎn)生新的觀點[1-2]。將具有不同特性的非釀酒酵母與常規(guī)釀造釀酒酵母進行組合發(fā)酵，改良原有產(chǎn)品的風格缺陷，增強產(chǎn)品的風味，這種基于不同酵母的混菌發(fā)酵模式在葡萄酒的規(guī)模釀造中已得到較好的應用[3-5]，但鮮有將這種混菌發(fā)酵技術(shù)應用于大規(guī)模啤酒生產(chǎn)中的嘗試。雖然這種基于不同酵母混菌發(fā)酵開發(fā)特色啤酒的方法極具前景，但因其需對工藝條件進行重大調(diào)整，以及發(fā)酵過程的穩(wěn)定性等問題的存在，很多大規(guī)模釀造工廠不愿在工業(yè)條件下使用混合發(fā)酵方式生產(chǎn)啤酒。

近年來，人們對風味高度復雜的酸啤酒的興趣大大增加[6]。與常規(guī)的艾爾啤酒和拉格啤酒相比，酸啤酒含有大量的有機酸(如乳酸和乙酸)，使得其pH值偏低。傳統(tǒng)酸啤酒的生產(chǎn)起源于比利時傳統(tǒng)酸啤酒Lambic釀造工藝[7-8]，該工藝利用復雜的微生物菌群自發(fā)發(fā)酵進行生產(chǎn)，通過長期的發(fā)酵過程(1～3年)可形成富含多種代謝物的傳統(tǒng)酸啤酒。然而，傳統(tǒng)酸啤酒的釀造工藝存在發(fā)酵周期長、釀造過程不可控、產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定性差等諸多問題降低了其大規(guī)模生產(chǎn)的可能性。為了規(guī)避野生菌群引發(fā)的產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定和發(fā)酵失敗風險大等問題，在煮沸麥芽汁前接入乳酸菌發(fā)酵劑進行糖化鍋酸化法(kettle souring)[6,9]，48 h后依次進行煮沸、釀酒酵母發(fā)酵與木桶老化。采用此方法生產(chǎn)酸啤酒雖然發(fā)酵耗時相對較短，但提前酸化工藝仍然增加了工藝操作步驟，且對后期的罐體消殺要求較高。同時，煮沸后乳酸菌產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì)減少，也是其缺點之一。雖然可使用木桶陳釀來增加啤酒香氣的復雜性，但這又延長了酸啤酒的生產(chǎn)周期。另有研究[10-11]將乳酸菌與釀酒酵母混合發(fā)酵或發(fā)酵后期添加乳酸菌進行酸啤酒生產(chǎn)，但由于大部分乳酸菌屬于細菌，受到啤酒花的抑制作用，很難在釀酒酵母存在的情況下形成生長優(yōu)勢，所以其產(chǎn)生的乳酸和其他風味物質(zhì)也很有限。國內(nèi)外對酸啤酒的研究和開發(fā)已是熱點，但鮮有研究利用不同酵母進行可調(diào)控的混合發(fā)酵酸啤酒。

為了獲得一款適用于大規(guī)模生產(chǎn)且果味馥郁的酸啤酒產(chǎn)品，本研究選擇在基質(zhì)利用和風味產(chǎn)生方面具有一定潛力的不同酵母菌種組合構(gòu)建穩(wěn)定的雙酵母混菌發(fā)酵體系，基于工業(yè)條件下成熟穩(wěn)定的啤酒釀造工藝，利用工業(yè)標準麥芽汁(不添加外源風味物質(zhì))生產(chǎn)新型果味酸啤酒。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

釀酒酵母Saccharomycescerevisiae68obg、耐熱拉錢斯氏酵母LachanceathermotoleransFBA-2、布魯塞爾酒香酵母BrettanomycesbruxellensisWDB24菌株由實驗室菌種保藏中心提供；馬克斯克魯維酵母Kluyveromycesmarxianus1695、Kluyveromycesmarxianus1042和耐熱拉錢斯氏酵母Lachanceathermotolerans1548菌株由中國普通微生物菌種保藏管理中心提供。

1.1.2 培養(yǎng)基與溶液

擴培培養(yǎng)基：麥芽汁由某公司糖化車間生產(chǎn)，115 ℃滅菌20 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：添加終體積分數(shù)為2%果葡糖漿至麥芽汁，以增加非釀酒酵母可利用糖含量，115 ℃滅菌20 min。

1.1.3 實驗試劑

次甲基藍(分析純)，天津百世化工有限公司；硫酸鈣(分析純)，天津市風船化學試劑科技有限公司；水合茚三酮、乙醛等標準品(色譜純)，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；葡萄糖、果糖、蔗糖、麥芽糖、麥芽三糖(色譜純)，大連美侖生物技術(shù)有限公司，疊氮溴化乙錠(分析純)，美國Sigma公司。

1.1.4 儀器與設備

Agilent 1260高效液相色譜儀、G1888-6890氣相色譜儀，美國安捷倫科技有限公司；UV1280紫外可見分光光度計，日本島津公司；ABI7500定量PCR儀，美國Applied Biosystems公司；DX-320離子色譜儀，美國戴安公司；Anton Paar(Ⅳ型)啤酒分析儀，安東帕公司；生化培養(yǎng)箱，上海智城分析儀器制造有限公司；IY1200酵母計數(shù)儀，上海睿鈺生物科技有限公司；FE28 pH計，上海梅特勒-托利多儀器有限公司；MIR-253型生化培養(yǎng)箱，日本三洋公司；超凈工作臺，蘇州凈化設備有限公司；高壓滅菌器，日本HIRAYAM公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 啤酒發(fā)酵實驗

活化后菌液接種至含250 mL麥芽汁的500 mL三角瓶中，25 ℃靜置培養(yǎng)24 h，制備種子液，按1×107～1.2×107CFU/mL的接種量接種至麥芽汁發(fā)酵培養(yǎng)基中，20 ℃靜置培養(yǎng)7 d，然后將600 mL發(fā)酵液注入無菌卡箍瓶中，壓蓋后在0 ℃下貯酒7 d。(每個樣品3個平行)。

1.2.2 雙酵母混合發(fā)酵體系不同種酵母數(shù)量變化分析

將qPCR與疊氮溴化乙錠(ethidium monoazide bromide, EMA)活菌處理技術(shù)相結(jié)合，實現(xiàn)對混合發(fā)酵體系中各菌株定量分析，從而可以快速表征雙酵母混合發(fā)酵體系各酵母的動態(tài)變化趨勢。

與亞甲基藍染色法顯微監(jiān)測法分析細胞死亡率[12]進行關(guān)聯(lián)分析，酵母死亡率測定采用亞甲基藍染色法。確定適用于2株酵母菌種的EMA預處理條件為EMA濃度在20 μmol/L、避光放置10 min后，將樣品放置在距500 W鹵素燈10 cm處曝光15 min，可有效抑制死菌DNA的擴增,從而排除死菌DNA擴增對qPCR菌株定量的影響。將已知濃度的酵母純培養(yǎng)菌液，進行10倍梯度稀釋，之后分別進行EMA-qPCR檢測，其中兩酵母特異性引物分別為S.cerevisiaeCESP-F：ATCGAATTTTTGAACGCACATTG，SCER-R：CGCAGAGAAACCTCTCTTTGGA[13]；L.thermotoleransLTH2-F CGCTCCTTGTGGGTGGGGAT，LTH2-R CTGGGCTATAACGCTTCTCC[14]。30 μL的qPCR反應體系為12 μL的Sybrgreen Mix(天根)，1 μL上游引物和下游引物，1 μL的模板DNA，15 μL的滅菌水。qPCR反應程序為95 ℃ 5 min，40個循環(huán)，每個循環(huán)95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，在每個循環(huán)的延伸階段進行熒光信號檢測，最終得到104、105、106、107、108、109CFU/mL活細胞的標準曲線, 確定qPCR相應循環(huán)閾值(cycle threshold, Ct)和平板計數(shù)之間的相關(guān)性，實現(xiàn)各菌株的定量分析，最后應用EMA-qPCR監(jiān)測技術(shù)動態(tài)表征雙酵母混合發(fā)酵體系中各單菌生長狀態(tài)。

1.2.3 雙酵母混合發(fā)酵體系穩(wěn)定性實驗

將混菌發(fā)酵體系逐級進行發(fā)酵體積放大，分別進行500 mL三角瓶、2 L發(fā)酵瓶、100 L發(fā)酵罐雙酵母混合發(fā)酵酸啤酒實驗，監(jiān)測發(fā)酵過程各關(guān)鍵參數(shù)和風味的穩(wěn)定性。

1.2.4 有機酸含量的測定

有機酸對啤酒的風味和口感有很大影響，是評價酸啤酒的重要指標。采用離子色譜方法測定酒液中的有機酸(乳酸、乙酸、甲酸、丙酸、丙酮酸、琥珀酸、酒石酸、草酸、富馬酸和檸檬酸)成分。將混合標準溶液與樣品待測液分別注入離子色譜儀，測得各有機酸的響應值(峰面積)，經(jīng)與標準溶液色譜圖比較響應值(峰面積)得到待測樣品有機酸濃度。

1.2.5 酒精度、發(fā)酵度的測定

根據(jù)GB 5009.225—2016《食品安全國家標準 酒中乙醇濃度的測定》對真正發(fā)酵度及酒精度進行測定[15]。

1.2.6 可發(fā)酵糖含量的測定

使用高效液相色譜儀對發(fā)酵液中的主要糖類進行測定[16]。

1.2.7 風味物質(zhì)含量的測定

使用氣相色譜儀對蒸餾后的發(fā)酵液中風味物質(zhì)進行測定[12]。氣相色譜條件：色譜柱Agilent CP-WAX(50 m×250 μm×0.25 μm)，載氣為高純氮氣(>99.999%)；柱流速為1 mL/min；進樣口溫度250 ℃；檢測器溫度148.8 ℃；程序升溫：起始溫度35 ℃，保持1 min，以3 ℃/min升至70 ℃，保持15 min，再以3.5 ℃/min升至190 ℃，保持22 min；進樣體積為1 μL；分流進樣，分流比30∶1。

1.2.8 啤酒感官品評

目前啤酒行業(yè)廣泛采用的描述類感官評價方法是定量描述分析法(quantitative descriptive analysis, QDA)，由10名啤酒感官評定專業(yè)人員組成評定小組，對啤酒的口感、口味和香氣進行感官評定，并按照風味強度評分。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)酸酵母的篩選實驗

參考相關(guān)研究[17-19]，對具有一定產(chǎn)酸能力和麥芽汁發(fā)酵特性的非釀酒酵母進行分析，結(jié)果表明，與啤酒酵母68obg相比，大部分非釀酒酵母都只能利用麥芽汁中的葡萄糖、果糖和蔗糖，對麥芽糖、麥芽三糖等麥芽低聚糖基本不代謝，只有L.thermotoleransFBA-2利用少量的麥芽糖，且代謝速率明顯低于釀酒酵母。

對5株非釀酒酵母的有機酸種類和產(chǎn)量進行分析，如表1所示，菌株L.thermotoleransFBA-2的乳酸產(chǎn)量最大，為2.573 g/L。但由于其乳酸和有機酸總量均高于其他菌株，感官品評的結(jié)果顯示，酸感明顯，綜合感官品評和風味物質(zhì)檢測，選擇協(xié)調(diào)性和爽口性更佳的L.thermotoleransFBA-2釀造酸啤酒。

表1 五株非釀酒酵母利用麥芽汁發(fā)酵有機酸產(chǎn)量情況 單位：mg/L

2.2 酵母單一菌株發(fā)酵實驗

對S.cerevisiae68obg和L.thermotoleransFBA-2進行單一菌株的麥芽汁發(fā)酵實驗，S.cerevisiae68obg發(fā)酵效率高，且產(chǎn)酯豐富，酒體丁香風味明顯[20]。如圖1所示，L.thermotoleransFBA-2對麥芽糖的利用能力低，不利用麥芽三糖等麥芽低聚糖，殘?zhí)呛枯^高。如表1所示，單一菌株L.thermotoleransFBA-2的發(fā)酵產(chǎn)物中乳酸和總酸的產(chǎn)量最高，但受限于碳源的利用能力，其他風味物質(zhì)的產(chǎn)量較低，主要的雜醇異丁醇和異戊醇則明顯低于S.cerevisiae68obg，導致總醇較低，但酯含量比S.cerevisiae68obg高。

圖1 單一菌株利用麥芽汁中可發(fā)酵糖情況

發(fā)酵過程的失重情況如圖2所示，與S.cerevisiae68obg相比，非釀酒酵母L.thermotoleransFBA-2發(fā)酵速率較慢，S.cerevisiae68obg與L.thermotoleransFBA-2發(fā)酵液的酒精度分別為6.75%vol和2.11%vol。感官品評的結(jié)果也表明，菌株L.thermotoleransFBA-2的發(fā)酵酒液酸感突出，影響了酒體的協(xié)調(diào)性和適飲性，其他風味表現(xiàn)不突出，與S.cerevisiae68obg發(fā)酵所得的標準啤酒相比，風格差異較大。在葡萄酒的研究[21]中發(fā)現(xiàn)，將耐熱拉錢斯氏酵母與釀酒酵母混合發(fā)酵可增加總酸度、甘油、多糖、2-苯基乙醇等的產(chǎn)量，同時降低葡萄酒的揮發(fā)性酸度。可見，選擇S.cerevisiae68obg作為雙酵母混合發(fā)酵體系的基礎酵母，菌株L.thermotoleransFBA-2作為構(gòu)建雙酵母混合發(fā)酵酸啤酒的風格酵母，可混合釀造酸味協(xié)調(diào)的酸啤酒。

圖2 單一菌株麥芽汁發(fā)酵過程失重情況

2.3 啤酒混菌發(fā)酵體系中非釀酒酵母與釀酒酵母最適配比的確定

混合發(fā)酵過程存在不同酵母之間的相互作用。大量研究表明[22-23]，非釀酒酵母與釀酒酵母混合發(fā)酵與單菌株發(fā)酵之間代謝活動存在差異，混合發(fā)酵體系中不同酵母菌株的比例對啤酒最終口味起決定性作用。因此，我們將風格酵母L.thermotoleransFBA-2和基礎酵母S.cerevisiae68obg按照100∶1、50∶1、10∶1、1∶1、1∶10、1∶50和1∶100的比例共同接種于發(fā)酵麥芽汁中，并添加2%的果葡糖漿，以促進混菌發(fā)酵體系中非釀酒酵母充分的生長。

如圖3所示，當混合發(fā)酵體系中風格酵母L.thermotoleransFBA-2和基礎酵母S.cerevisiae68obg接種比例為1∶100、1∶50、1∶10時，菌株S.cerevisiae68obg有明顯的生長優(yōu)勢，細胞增長速率高于風格酵母L.thermotoleransFBA-2，快速成為主導菌株。即使在添加果葡糖漿后的麥芽汁中，與基礎酵母S.cerevisiae68obg競爭利用葡萄糖、果糖、蔗糖，風格酵母L.thermotoleransFBA-2無法形成生長優(yōu)勢，從而無法對最終的啤酒產(chǎn)品組分產(chǎn)生大的影響。

圖3 不同配比混菌發(fā)酵24 h后各酵母細胞狀態(tài)

當混合發(fā)酵體系中風格酵母L.thermotoleransFBA-2和基礎酵母S.cerevisiae68obg接種比例為100∶1、50∶1時，風格菌株L.thermotoleransFBA-2占據(jù)了絕對的生長優(yōu)勢，即使在發(fā)酵后期，菌株S.cerevisiae68obg也沒有在酵母數(shù)量上的形成優(yōu)勢，而當混合發(fā)酵體系中風格酵母L.thermotoleransFBA-2和基礎酵母S.cerevisiae68obg接種比例為10∶1時，酵母L.thermotoleransFBA-2啟動發(fā)酵，發(fā)酵中期，逐步衰亡。然后，S.cerevisiae68obg開始占據(jù)主導地位，使發(fā)酵繼續(xù)，直至完成。

2.4 耐熱拉錢斯氏酵母與釀酒酵母混合發(fā)酵麥芽汁生產(chǎn)新型果味酸啤酒

綜合啤酒混合發(fā)酵體系中風味物質(zhì)分析和感官品評結(jié)果，選擇L.thermotoleransFBA-2和S.cerevisiae68obg混合接種比例為10∶1，麥芽汁中總酵母數(shù)控制在1.0×107～1.2×107CFU/mL，利用EMA-qPCR監(jiān)測技術(shù)動態(tài)表征雙酵母混合發(fā)酵體系中各單菌生長狀態(tài)。

2.4.1 EMA-qPCR定量分析建立各酵母標準曲線

使用EMA-qPCR分別建立了L.thermotoleransFBA-2和S.cerevisiae68obg的活細胞含量與Ct值之間的標準曲線，Ct值與活菌濃度呈線性關(guān)系，L.thermotoleransFBA-2的標準曲線方程為y=-3.118 2x+38.952，相關(guān)系數(shù)為R2=0.988 3，如圖4所示，S.cerevisiae68obg的標準曲線方程為y=-3.221 5x+37.235，相關(guān)系數(shù)為R2=0.993 8，線性關(guān)系均良好。EMA-qPCR檢測方法與傳統(tǒng)的平板計數(shù)法相比較，能將檢測時間從36 h縮減至3～4 h，可大大提高檢測效率。

2.4.2 混合發(fā)酵麥芽汁生產(chǎn)新型果味酸啤酒過程分析

利用EMA-qPCR技術(shù)動態(tài)表征雙酵母混合發(fā)酵體系中各單菌生長狀態(tài)，如圖4所示，由于接種比例大，L.thermotoleransFBA-2在進罐第1天后，酵母數(shù)量顯著增加，成為優(yōu)勢菌株，對發(fā)酵過程的監(jiān)測發(fā)現(xiàn)，1 d后發(fā)酵液的pH值從5.42降至3.51，發(fā)酵2 d后pH值為3.33，并一直保持到第7天。2 d后，隨著可利用糖的耗盡，L.thermotoleransFBA-2活性下降，而后S.cerevisiae68obg利用發(fā)酵液中殘留的麥芽糖和麥芽三糖等可發(fā)酵糖，其酵母數(shù)不斷增加，由于L.thermotoleransFBA-2在發(fā)酵前期處于優(yōu)勢地位，對S.cerevisiae68obg有明顯的抑制作用，相比于S.cerevisiae68obg的單菌發(fā)酵，其酵母數(shù)量增長受限，最高僅為1.38×107CFU/mL，因此，發(fā)酵結(jié)束后酒液中由S.cerevisiae68obg產(chǎn)生的醇類物質(zhì)相對含量下降，發(fā)酵液的酒精度在5.55%vol。

圖4 EMA-qPCR動態(tài)表征雙酵母混合發(fā)酵體系中各酵母數(shù)變化情況

從實驗室條件逐級放大有效發(fā)酵體積到100 L發(fā)酵罐麥芽汁發(fā)酵實驗，如表2、表3所示，通過對發(fā)酵過程中相關(guān)關(guān)鍵參數(shù)的監(jiān)測，乳酸含量為1.5～1.8 g/L，酒液pH值為3.3～3.4，酒精度約在5%vol，可見由非釀酒酵母與釀酒酵母構(gòu)建的啤酒雙酵母混合發(fā)酵體系具有一定的穩(wěn)定性。

表2 雙酵母混合發(fā)酵酸啤酒發(fā)酵性能參數(shù)

在雙酵母混合發(fā)酵體系中非釀酒酵母和釀酒酵母之間的相互作用[24]會引發(fā)酶類和揮發(fā)性物質(zhì)的產(chǎn)量提升，非釀酒酵母L.thermotoleransFBA-2除了產(chǎn)生一定量的乳酸降低酒液pH值，也能給啤酒帶來更多的復雜香氣，如表3所示，相比于單一菌株發(fā)酵，雙酵母混合發(fā)酵酸啤酒體系其風味物質(zhì)產(chǎn)量都有所提高，產(chǎn)生了更多乙酸異丁酯和乙酸異戊酯等酯類物質(zhì)，增強了酸啤酒的水果香氣，感官品評結(jié)果也表明，利用雙酵母混合發(fā)酵體系釀造的酸啤酒融合了2種酵母的特性，酒體果香馥郁，對啤酒的質(zhì)量產(chǎn)生積極影響(圖5)。

表3 雙酵母混合發(fā)酸啤酒常規(guī)風味物質(zhì)及有機酸產(chǎn)量

圖5 單一菌株及雙酵母混菌發(fā)酵啤酒感官品評結(jié)果

3 結(jié)論

將非釀酒酵母L.thermotoleransFBA-2作為混菌發(fā)酵的風格菌株，基于其對常規(guī)啤酒發(fā)酵用麥芽汁的利用情況，優(yōu)化原料配方，并選擇一株常規(guī)發(fā)酵釀酒酵母S.cerevisiae68obg作為基礎發(fā)酵菌株，以便保證啤酒的基調(diào)，構(gòu)建了啤酒雙酵母混合發(fā)酵體系，并確定了最優(yōu)接種比例L.thermotoleransFBA-2∶S.cerevisiae68obg為10∶1，用混菌發(fā)酵生產(chǎn)的酸啤酒中含有1.5～1.8 g/L乳酸，pH值為3.3～3.4，酒精度約為5%vol，風味豐富度高、爽口協(xié)調(diào)、果香馥郁，不過分強調(diào)酸味。實驗室條件和100 L發(fā)酵罐放大實驗結(jié)果表明，利用雙酵母發(fā)酵體系發(fā)酵酸啤酒不僅能夠融合2種酵母的特性，還可以對啤酒的質(zhì)量產(chǎn)生積極影響，酒體果香馥郁，并且這一工藝消除了現(xiàn)有酸啤酒的工藝弊端，簡化了釀造操作環(huán)節(jié)，縮短了發(fā)酵時間，可實現(xiàn)更快速的發(fā)酵和高水平的過程控制，能夠促進酸啤酒的大規(guī)模生產(chǎn)應用。