茶多酚-殼聚糖復(fù)合液對(duì)虹鱒魚肉貯藏品質(zhì)和 菌群結(jié)構(gòu)的影響

吳昕寧，李鳴澤，梁釋介，張靖暄，熊 欣，譚雨青，羅永康*

（中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083）

虹鱒（Oncorhynchus mykiss）屬太平洋鮭屬[1]，是典型的冷水魚[2]。虹鱒魚滋味鮮美、營(yíng)養(yǎng)豐富、生長(zhǎng)快、易人工繁殖，是聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織向世界推廣的產(chǎn)量高且品質(zhì)優(yōu)良的四大淡水養(yǎng)殖品種之一[3]。虹鱒魚肉具有水分含量高、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)豐富、內(nèi)源酶活性高、pH值近中性等特點(diǎn)，成為微生物適宜的生長(zhǎng)繁殖環(huán)境，因此在貯藏、運(yùn)輸、銷售過程中極易在微生物和內(nèi)源酶的共同作用下發(fā)生腐敗變質(zhì)。李東萍等[4]研究發(fā)現(xiàn)，3 ℃冰藏下的虹鱒魚片的貨架期僅有6 d；此外，高不飽和脂肪酸使其極易發(fā)生脂肪氧化，造成魚肉風(fēng)味、質(zhì)地劣化，產(chǎn)生不愉快的嗅感和味感[5]。有效的保鮮手段對(duì)虹鱒魚貨架期的保障和品質(zhì)的維持十分重要。

生物保鮮劑在肉類保鮮中應(yīng)用廣泛[6]。茶多酚是茶葉的主要活性成分[7]，是含有多羥基酚類化合物的復(fù)合物，具有顯著的抗氧化活性[8]，是一類水產(chǎn)品抗菌保鮮領(lǐng)域的良好抗菌劑，李雙雙等[9]將其應(yīng)用于金槍魚保鮮。殼聚糖是幾丁質(zhì)脫乙酰化后得到的多糖，具有良好的抑菌活性[10]， 周強(qiáng)等[11]將其用于草魚保鮮。目前研究表明，還沒有任何一種抑菌劑有比較全面的抑菌譜，為發(fā)揮協(xié)同保鮮效果，將不同功能生物保鮮劑聯(lián)合使用，互補(bǔ)單一生物保鮮劑在感官及抑菌效果方面的不足，有較強(qiáng)的抑菌效果，能擴(kuò)大抑菌譜，更好抑制產(chǎn)品腐敗變質(zhì)，延長(zhǎng)其貨架期[12]，因此復(fù)合生物保鮮劑具有非常好的應(yīng)用前景[13]。 茶多酚和殼聚糖的復(fù)合保鮮在鮸魚、三文魚、南美白對(duì)蝦中均已得到應(yīng)用[14-16]。

目前在虹鱒魚貯藏加工與品質(zhì)控制方面已取得初步進(jìn)展，但在虹鱒魚魚肉貯藏過程中微生物菌群動(dòng)態(tài)變化規(guī)律、菌群組成與魚肉品質(zhì)的內(nèi)在關(guān)系和生物保鮮劑控制特定腐敗菌等方面的研究還相對(duì)欠缺，需要更加深入的研究。本研究以生鮮虹鱒魚為原料，研究其在（4±1） ℃條件下貯藏時(shí)菌群結(jié)構(gòu)的變化，并且通過復(fù)配保鮮劑涂膜（茶多酚-殼聚糖），研究復(fù)配保鮮劑涂膜對(duì)生鮮虹鱒魚肉在（4±1） ℃貯藏過程中品質(zhì)變化的影響，以期為延長(zhǎng)生鮮虹鱒魚肉貯藏時(shí)間提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮活虹鱒魚購于北京市四道口水產(chǎn)品批發(fā)市場(chǎng)，平均體長(zhǎng)（42.59±1.58） cm，平均體質(zhì)量（0.86±0.09） kg。

茶多酚（純度＞80%） 安徽紅星藥業(yè)股份有限 公司；殼聚糖（純度＞90%、脫乙酰度＞90%） 北京索萊寶科技有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

BCD-251 WBCY冰箱 青島海爾股份有限公司；YT-C1-1ND超凈工作臺(tái) 北京亞泰科隆實(shí)驗(yàn)科技開發(fā)中心；DHP-9082電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；KDY-9820半自動(dòng)凱式定氮儀 北京通潤(rùn)源機(jī)電儀器設(shè)備公司；DSHZ-300A水浴恒溫振蕩器 蘇州培英實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；GL-21M冷凍離心機(jī) 長(zhǎng)沙平凡儀器儀表有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

鮮活虹鱒魚充氧運(yùn)輸至中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院。將其迅速敲頭擊暈，去鱗剖腹后取出內(nèi)臟，切去頭部，用流水沖淋魚體，取背部肌肉分割為8 cm×6 cm×2 cm的魚片并清洗瀝干，將得到的魚片隨機(jī)分組。

1.3.2 保鮮劑處理

配制3 g/L溶于水的茶多酚溶液為GTP組，10 g/L溶于體積分?jǐn)?shù)1%乙酸的殼聚糖溶液為CS組，上述茶多酚溶液和殼聚糖溶液等體積混合為MIX組。將生鮮魚片按以上處理組于清潔燒杯常溫浸泡，保持液面完全沒過魚片，10 min后瀝干至無水滴落，裝入食品級(jí)聚乙烯袋并編號(hào)。未做浸泡處理的空白對(duì)照組為CK組。處理后的魚片貯藏于預(yù)消毒4 ℃冰箱，分別于0、2、4、6、8 d隨機(jī)從每組取3 片進(jìn)行指標(biāo)測(cè)定。對(duì)未到貯藏限值的組別，延長(zhǎng)其貯藏期，分別在10、13、15 d測(cè)定指標(biāo)。

1.3.3 感官評(píng)價(jià)

感官評(píng)價(jià)參考Berizi[17]、羅忠云[18]等的方法，結(jié)合虹鱒魚本身特征作出調(diào)整。感官小組由經(jīng)過專業(yè)感官實(shí)驗(yàn)訓(xùn)練的6 名實(shí)驗(yàn)室成員組成，含3 名男性和3 名女性，年齡為21～23 歲，感官小組成員分別對(duì)魚片的色澤、氣味、質(zhì)地和彈性進(jìn)行5 分制打分，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1 虹鱒魚肉感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Criteria for sensory evaluation of rainbow trout flesh

1.3.4 菌落總數(shù)測(cè)定

參照GB 4789.2—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測(cè)定》。稱取5 g虹鱒魚背部肌肉于無菌均質(zhì)袋中，再加入45 mL無菌生理鹽水，用拍打式均質(zhì)機(jī)拍打30 s，制得1∶10的樣品稀釋液。之后用4.5 mL無菌生理鹽水連續(xù)10 倍梯度稀釋0.5 mL樣品懸液。選擇2 個(gè)合適稀釋度的懸液，吸取100 μL于無菌平板計(jì)數(shù)瓊脂上涂布。每個(gè)稀釋度作2 次平行，并以無菌生理鹽水作為空白對(duì)照。操作結(jié)束后將培養(yǎng)皿轉(zhuǎn)移至（30±1） ℃的微生物恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)48～72 h，菌落清晰可見而不重疊時(shí)培養(yǎng)結(jié)束。取出進(jìn)行計(jì)數(shù)，菌落單位為（lg（CFU/g））。

1.3.5 揮發(fā)性鹽基氮（total volatile basic nitrogen，TVB-N）含量測(cè)定

參照GB 5009.228—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中揮發(fā)性鹽基氮的測(cè)定》中的半微量定氮法。稱取5 g攪碎的魚片于100 mL離心管中，加入45 mL蒸餾水，均質(zhì)1 min后在搖床上振蕩30 min，4 ℃條件下4 500 r/min離心3 min。吸取5 mL 10 g/L氧化鎂與5 mL上清液于消化管中，混合均勻后進(jìn)行蒸餾。錐形瓶中加入100 μL混合指示劑（1 g/L次甲基藍(lán)溶液與2 g/L甲基紅-乙醇溶液按體積比1∶1混合）和用于吸收餾出物的10 mL 20 g/L硼酸溶液，蒸餾5 min后，用鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液（0.01 mol/L）滴定至吸收液呈藍(lán)紫色。以5 mL蒸餾水代替樣品懸液為空白對(duì)照。

1.3.6 菌群結(jié)構(gòu)測(cè)定

取10 g魚片與20 mL無菌生理鹽水混合，漩渦低速振蕩30 s后100 r/min搖床振搖15 min，使魚片表面的微生物分散于生理鹽水。200 r/min離心5 min獲得上清液以去除魚肉，1 000 r/min離心10 min獲得沉淀物。用1.5 mL無菌水洗滌沉淀后，12 000 r/min離心1 min獲得菌體沉淀。參照Liu Xiaochang等[19]的方法提取細(xì)菌DNA，將其運(yùn)送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司[20]，委托該公司采用 第2代測(cè)序技術(shù)進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增和產(chǎn)物純化，并通過細(xì)菌16S rRNA基因V3～V4區(qū)的測(cè)序分析進(jìn)行鑒定[21]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有指標(biāo)均測(cè)3 個(gè)平行，實(shí)驗(yàn)結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示。采用Excel 2016軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用IBM公司SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行差異顯著性分析，顯著水平為5%。采用Origin軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 虹鱒魚片4 ℃貯藏過程中的感官評(píng)分變化

感官評(píng)價(jià)是食品領(lǐng)域廣泛采用和認(rèn)可的評(píng)價(jià)方法。由圖1可知，貯藏開始，虹鱒魚片色澤、氣味、質(zhì)地和彈性等感官品質(zhì)均處于完全新鮮的狀態(tài)，呈明亮的橙黃色，表面顏色鮮亮，肌肉致密緊實(shí)、富有彈性。魚片的各項(xiàng)感官評(píng)分隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)均下降。由于微生物增殖和脂肪氧化，逐漸色澤暗淡，產(chǎn)生異味，組織松散無彈性。貯藏初期，GTP組的氣味和色澤評(píng)分相對(duì)CS組較高，可能由于茶多酚本身具有芳香，且對(duì)食品中的色素具有保護(hù)作用。Gram[22]指出，食品腐敗主要是指食品經(jīng)感官評(píng)價(jià)后判定為感官不可接受時(shí)的狀態(tài)。通常，將魚肉剛好達(dá)到感官不可接受點(diǎn)的時(shí)間定義為魚肉的貨架期。本研究將2 分作為不可接受限值，結(jié)果表明，貯藏虹鱒魚片的感官貨架期為6～8 d，茶多酚和殼聚糖復(fù)合保鮮劑能將貨架期延長(zhǎng)至10 d。殼聚糖的抗菌性抑制腐敗變質(zhì)，茶多酚的抗氧化性抑制脂肪氧化酸敗，結(jié)合使用效果更佳。

圖1 虹鱒魚片4 ℃貯藏過程中色澤（A）、氣味（B）、 質(zhì)地（C）及彈性（D）評(píng)分變化Fig. 1 Changes in color (A), odor (B), texture (C) and elasticity (D) of rainbow trout fillets during refrigeration at 4 ℃

2.2 虹鱒魚片4 ℃貯藏過程中的菌落總數(shù)變化

水產(chǎn)品的腐敗變質(zhì)多數(shù)是由微生物引起的。由圖2 可知，GTP組、CS組、MIX組虹鱒魚片初始菌落總數(shù)分別為3.32、3.27、3.14（lg（CFU/g）），CK組為 3.40（lg（CFU/g）），與MIX組相比有顯著差異 （P＜0.05），表明復(fù)配保鮮劑具備一定程度的減菌作用。隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，各組魚片菌落總數(shù)均不斷增長(zhǎng)。貯藏8 d時(shí)，CK組已達(dá)8.07（lg（CFU/g））， 明顯超出SC/T 3116—2006《凍淡水魚片》中淡水魚的上限7.0（lg（CFU/g））；此時(shí)，GTP組和CS組分別為7.32、6.02（lg（CFU/g）），MIX組僅有 4.38（lg（CFU/g））；CK組的菌落總數(shù)顯著高于其他組（P＜0.05）。貯藏13 d時(shí)，MIX組的菌落總數(shù)達(dá) 7.08（lg（CFU/g）），仍顯著低于單獨(dú)處理的GTP組和CS組（P＜0.05）。這說明茶多酚和殼聚糖復(fù)配保鮮劑處理可以較好控制虹鱒魚片微生物生長(zhǎng)，復(fù)合涂膜對(duì)虹鱒魚片中菌落的抑制能力強(qiáng)于僅用殼聚糖或茶多酚處理的樣品?，F(xiàn)有研究表明，茶多酚對(duì)革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌均有明顯抑制作用[23]；殼聚糖通過改變細(xì)菌細(xì)胞膜的通透性阻礙細(xì)胞內(nèi)外的氣體交換，進(jìn)而抑制細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖[24]。

圖2 虹鱒魚片4 ℃貯藏過程中菌落總數(shù)變化Fig. 2 Changes in total aerobic colony count of rainbow trout fillets during refrigeration at 4 ℃

2.3 虹鱒魚片4 ℃貯藏過程中的TVB-N含量變化

TVB-N是指動(dòng)物性食品在內(nèi)源性酶及微生物的作用下使蛋白質(zhì)分解而產(chǎn)生的氨及胺類等堿性含氮化合物，與微生物活動(dòng)息息相關(guān)[25]，TVB-N含量越高，說明魚片腐敗程度越顯著。由圖3可知，GTP組、CS組、MIX組和CK組虹鱒魚片初始TVB-N含量分別為7.7、6.1、6.3、7.2 mg/100 g，表明魚片的初始質(zhì)量良好，與成傳香等[26]報(bào)道的基本一致。隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，各組的TVB-N含量均隨貯藏時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸升高，后期由于菌落總數(shù)的增長(zhǎng)，腐敗加劇而上升明顯。貯藏8 d時(shí)，各組之間出現(xiàn)顯著性差異（P＜0.05）。GB 2733—2015《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 鮮、凍動(dòng)物性水產(chǎn)品》規(guī)定，淡水魚魚肉TVB-N含量的可接受上限值為20 mg/100 g。貯藏10 d時(shí)，CK組增加至23.3 mg/100 g，已超過可接受上限值；而此時(shí)GTP組、CS組的TVB-N含量分別增加至16.3、14.9 mg/100 g，均顯著低于CK組（P＜0.05），表明保鮮劑能延緩TVB-N含量的增加；MIX組的TVB-N含量?jī)H為12.1 mg/100 g，顯著低于GTP組和CS組 （P＜0.05），說明復(fù)配保鮮劑效果優(yōu)于單獨(dú)使用。貯藏13 d時(shí)，GTP組、CS組和MIX組的TVB-N含量分別為25.0、19.1、16.1 mg/100 g，MIX組最低。貯藏至15 d，MIX組的TVB-N含量為20.1 mg/100 g，達(dá)到上限值。研究[27]顯示，茶多酚處理可以減弱肌肉組織中蛋白質(zhì)的降解，延緩TVB-N的積累。殼聚糖具有抗菌性能[28]，可能通過抑制微生物進(jìn)一步延緩含氮物質(zhì)的分解。

圖3 虹鱒魚片4 ℃貯藏過程中TVB-N含量變化Fig. 3 Changes in TVB-N content of rainbow trout fillets during refrigeration at 4 ℃

2.4 虹鱒魚片4 ℃貯藏過程中的菌群結(jié)構(gòu)分析

2.4.1 高通量測(cè)序序列信息及α多樣性分析

在本研究中，基于感官評(píng)價(jià)和菌落總數(shù)結(jié)果將0 d作為貯藏的初期，GTP組的6、10 d分別作為茶多酚處理組貯藏的中期和末期，CS組的6、10 d分別作為殼聚糖處理組貯藏的中期和末期，MIX組的8、13 d分別作為茶多酚和殼聚糖復(fù)合處理組的中期和末期，CK組的4、8 d分別作為對(duì)照組貯藏的中期和末期，通過高通量測(cè)序技術(shù)進(jìn)行魚片菌群結(jié)構(gòu)分析。

α多樣性是指一個(gè)特定區(qū)域或生態(tài)系統(tǒng)內(nèi)不同物種種類的豐富程度以及物種數(shù)量分布的均勻程度[29]，在本研究中即為虹鱒魚片樣品中微生物的多樣性和豐富程度。覆蓋率是用于評(píng)估測(cè)序深度的指數(shù)，能夠反映測(cè)序結(jié)果代表樣本中微生物的程度，其值越接近于100%，表明樣品中物種被檢測(cè)的概率越高。

由表2可知，各組樣品的覆蓋率均在99.9%以上，說明高通量測(cè)序結(jié)果可以反映樣品中幾乎全部微生物的群落豐度和多樣性。Ace、Chao 1和Shannon指數(shù)分別用來分析微生物群落的豐富度和多樣性[30]。Ace指數(shù)和Chao 1指數(shù)越大，代表群落物種種類越豐富，Shannon指數(shù)越大，說明群落多樣性越低。各組魚片貯藏末期的Ace、Chao 1和Shannon指數(shù)均低于0 d，說明隨貯藏時(shí)間延長(zhǎng)，各組魚片的菌群豐富度呈下降趨勢(shì)，這與Zhuang Shuai等[31]的發(fā)現(xiàn)一致，可能由于出現(xiàn)了優(yōu)勢(shì)菌屬，抑制其他微生物的生長(zhǎng)，從而降低多樣性。另一方面，MIX組貯藏8 d的Ace指數(shù)為233.60，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于CK組貯藏8 d的28.72，及GTP組、CS組貯藏6 d的33.63、175.78，說明茶多酚和殼聚糖的復(fù)配處理可以使虹鱒魚片貯藏后期的菌群結(jié)構(gòu)保持較高多樣性。

表2 虹鱒魚片4 ℃貯藏過程中菌群高通量測(cè)序信息及α多樣性分析Table 2 High-throughput sequencing information and α-diversity analysis of bacterial flora in rainbow trout meat during refrigeration

2.4.2 菌群分析

微生物是引起魚肉腐敗的主要原因，對(duì)虹鱒魚腐敗過程作用至關(guān)重要[32]。鑒定魚肉貯藏過程中的菌群結(jié)構(gòu)變化能夠揭示魚肉的腐敗模式和腐敗進(jìn)程，對(duì)生鮮魚肉貯藏保鮮控制技術(shù)的開發(fā)具有重要參考價(jià)值。高通量測(cè)序結(jié)果顯示，在各組魚片貯藏過程中，屬水平上共鑒定到16 個(gè)相對(duì)豐度≥1%的微生物菌種。由圖4可知，貯藏0 d時(shí)，魚片優(yōu)勢(shì)菌屬為考克氏菌屬（Kocuria），占比26.8%，及假單胞菌屬（Pseudomonas），占比21.9%，此外有巨型球菌屬（Macrococcus）占比8.0%，不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）占比7.2%，鏈球菌屬（Streptococcus）占比5.2%。隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，各組魚片菌群多樣性水平均降低，且假單胞菌屬在各組魚片中的相對(duì)豐度持續(xù)增加，并成為優(yōu)勢(shì)腐敗菌。Syropoulou等[33]對(duì)鱸魚的研究中也發(fā)現(xiàn)，假單胞菌屬是魚片中的主要細(xì)菌，它通常來源于魚類生活的環(huán)境。

圖4 虹鱒魚片4 ℃貯藏過程中屬水平微生物相對(duì)豐度的變化Fig. 4 Changes in relative abundance of bacterial genera in rainbow trout during refrigeration

水產(chǎn)品中有多種微生物存在，但只有其中部分會(huì)導(dǎo)致腐敗變質(zhì)[34]。虹鱒魚片貯藏中后期的優(yōu)勢(shì)菌為假單胞菌屬。CK組貯藏4 d時(shí)假單胞菌屬占比85.6%，貯藏8 d占比98.4%；GTP組貯藏6 d假單胞菌屬占比99.8%；CS組貯藏6 d假單胞菌屬占比84.6%，顯著低于GTP組，并低于CK組貯藏8 d的占比，說明殼聚糖對(duì)優(yōu)勢(shì)腐敗菌假單胞菌屬的抑制作用優(yōu)于茶多酚。MIX組貯藏8 d的優(yōu)勢(shì)菌假單胞菌屬占比75.9%，顯著低于CK組的98.4%，說明茶多酚和殼聚糖的復(fù)配保鮮劑有較好的抑制假單胞菌屬生長(zhǎng)繁殖的作用。在貯藏末期，GTP組、CS組貯藏10 d和MIX組貯藏13 d，假單胞菌屬占據(jù)顯著優(yōu)勢(shì)。結(jié)合Wang Hang等[35]針對(duì)草魚的實(shí)驗(yàn)，該研究表明，假單胞菌屬與魚肉腐敗直接相關(guān)，是典型的低溫腐敗菌，具有很強(qiáng)的蛋白質(zhì)和脂肪分解能力[36]，可以判斷假單胞菌屬為貯藏虹鱒魚片的特定腐敗菌。因此，茶多酚和殼聚糖的復(fù)配生物保鮮劑可以通過改變魚片菌群組成，尤其是抑制假單胞菌屬來減緩魚片品質(zhì)劣變，進(jìn)而延長(zhǎng)生鮮魚片的 貨架期。

3 結(jié) 論

茶多酚和殼聚糖復(fù)配保鮮劑的涂膜處理是一種有效延長(zhǎng)虹鱒魚貨架期的保鮮方法，具有作為良好天然防腐劑的潛力。涂膜處理抑制了魚片中菌落總數(shù)的增長(zhǎng)，延緩感官評(píng)分下降和TVB-N含量增長(zhǎng)。結(jié)合多個(gè)指標(biāo)，復(fù)配保鮮劑涂膜處理將4 ℃貯藏虹鱒魚片的貨架期延長(zhǎng)約5 d。茶多酚和殼聚糖單獨(dú)處理也有一定抑菌效果，但復(fù)配保鮮劑效果更佳?？赡苡捎诓瓒喾雍蜌ぞ厶欠謩e存在有效的生物活性成分和天然抗菌劑，復(fù)配保鮮劑具備更廣泛的抗菌譜，抑菌覆蓋面更寬，具有協(xié)同增效作用。新鮮虹鱒魚的菌群由16 個(gè)菌屬組成，其中考克氏菌屬和假單胞菌屬為新鮮虹鱒魚的優(yōu)勢(shì)菌屬，假單胞菌屬隨貯藏時(shí)間延長(zhǎng)不斷占據(jù)優(yōu)勢(shì)，成為虹鱒魚的優(yōu)勢(shì)腐敗菌，殼聚糖和茶多酚復(fù)配保鮮劑可能通過抑制假單胞菌屬生長(zhǎng)而減緩腐敗過程。本研究為虹鱒魚品質(zhì)控制技術(shù)提供了理論參考。