鉬酸鹽功能化聚丙烯酰胺凝膠及其抗菌性能

＊韓耀 熊開容 龔鑫

（廣東工業(yè)大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院 廣東 510006）

病原微生物引起的疾病是一個日益嚴(yán)重的全球健康問題。例如，一些細(xì)菌、真菌、病毒等每年在世界各地造成數(shù)百萬人死亡[1]。細(xì)菌感染是不可忽視的主要原因，雖然可以用抗生素治療細(xì)菌和真菌感染，但抗生素的過度使用和使用不當(dāng)導(dǎo)致多重耐藥細(xì)菌的出現(xiàn)[2]。在當(dāng)今使用的許多抗菌材料中，通過將殺菌劑摻入聚合物或水凝膠中，隨后釋放[3]。常用的殺菌劑有銀納米顆粒[4]、銀鹽[5]、金屬氧化物[6]、鹵素[7]或季銨化合物[8-9]等，但是這些都存在某些限制。例如，銀基材料因其表現(xiàn)出優(yōu)秀的體外殺菌性能而廣受歡迎，但在實際條件下表現(xiàn)出低功效[4]；雖然季銨鹽涂層通過破壞細(xì)菌的細(xì)胞質(zhì)和外膜脂質(zhì)雙層起作用，然而，其抗菌性能可能會根據(jù)表面環(huán)境條件（例如，pH值、水的硬度和血液的存在）而降低[8]。因此，開發(fā)具有高效殺菌性的凝膠是一個突出的挑戰(zhàn)。

聚丙烯酰胺（PAM）是水溶性線性高分子聚合物凝膠，具有親水性好、溶脹度高、比表面積大、吸附效果好、柔韌性高以及良好的生物相容性等特性[10]。然而單組分的PAM凝膠功能單一，雖然應(yīng)用廣泛但有局限性，因而需要通過具有抗菌的無機材料對凝膠改性，增加其抗菌性能，同時也能提高其物理性能，例如抵抗外力延長使用壽命，實現(xiàn)凝膠的多功能化。多金屬氧酸鹽是一類金屬氧簇，具有多種結(jié)構(gòu)和優(yōu)異的特性，已知和抗生素及有機生物活性化合物具有協(xié)同作用，與蛋白質(zhì)氨基酸相互作用，導(dǎo)致影響細(xì)菌細(xì)胞活力的生物反應(yīng)[11-14]。多氧鉬酸鹽被證明具有高抗菌活性[15]。

基于以上思路，本文制備出一種由PAM、鉬酸銨、硝酸鈣、環(huán)己烷組成的鉬酸鈣納米簇凝膠（CMG），通過簡單的混合攪拌即可獲得。納米線由Ca2+橋接Mo7O246-納米團(tuán)簇通過靜電相互作用形成，采用PAM和鉬酸鈣納米團(tuán)簇（CMN）構(gòu)建凝膠網(wǎng)絡(luò)體系。以表面含氨基化學(xué)官能團(tuán)的PAM作為主體，利用其表面的氨基在自組裝過程中與納米線原位反應(yīng)形成共價鍵，環(huán)己烷通過配位和靜電相互作用附著在納米線，增加了凝膠的界面穩(wěn)定性。所制備的鉬酸鈣納米簇凝膠具有優(yōu)異的孔隙率、保水性能等物理性質(zhì)。所制備的凝膠具有優(yōu)異的抗菌性能、高效及適應(yīng)性廣等優(yōu)點。

1.實驗

(1)實驗原材料

硝酸鈣（CN）：分析純，廣州化學(xué)試劑廠；鉬酸銨四水合物（AM）：分析純，上海麥克林生化有限公司；環(huán)己烷（CYH）：分析純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；無水乙醇（EA）：分析純，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；聚丙烯酰胺（PAM）：分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；實驗用水均為去離子水。

(2)CMG凝膠的制備

稱取定量鉬酸銨在40℃下溶解于去離子水中。冷卻至室溫后，將一定質(zhì)量的硝酸鈣加入反應(yīng)溶液中并攪拌1h。隨后，分別取一定體積的環(huán)己烷和一定質(zhì)量的PAM相繼加入混合溶液中。將混合溶液在60℃下攪拌24h。將產(chǎn)品用去離子水和無水乙醇離心洗滌多次，得到CMG。當(dāng)鉬酸銨的質(zhì)量為0.2g、0.5g、1.0g時，得到的樣品分別標(biāo)記為CMG2、CMG5、CMG10。

(3)表征

通過掃描電子顯微鏡（德國蔡司公司Zeiss Gemini 300 SEM）觀察了凝膠的形態(tài)和大小。在SEM測試之前，將凝膠樣品冷凍干燥。

(4)凝膠含量

將凝膠稱重，記作W0，在通風(fēng)櫥中干燥24h，然后在50℃下干燥48h直至達(dá)到恒定質(zhì)量時，記作W1。

根據(jù)公式（1）計算凝膠含量G：

式中：W1是凝膠干重，g；W0為濕凝膠質(zhì)量，g。

(5)水蒸氣透過率

將凝膠稱重，記作W0，在通風(fēng)櫥中干燥24h，然后在50℃下干燥48h直至當(dāng)達(dá)到恒定質(zhì)量時，記作W1。將凝膠（Ws）保存在濕度為40%，溫度為37℃的保溫箱中。在固定的時間間隔后，測量質(zhì)量（Wt）。

根據(jù)公式（2）計算凝膠保水率S：

式中：W1是凝膠干重，g；Ws為濕凝膠質(zhì)量，g；Wt為保存不同時間的凝膠質(zhì)量，g。

(6)孔隙率

采用液體置換技術(shù)分析了水凝膠的孔隙率。從每種類型的凝膠中使用3個樣品。將凝膠浸入乙醇中48h，直到它們被吸收飽和，然后重新稱量凝膠。

根據(jù)公式（3）計算凝膠孔隙率P：

式中：W0是凝膠干重，g；Ww為濕凝膠質(zhì)量，g；WL為乙醇中凝膠的質(zhì)量，g。

(7)抗菌評估

采用圓盤擴(kuò)散法[13]對樣品進(jìn)行體外抗菌實驗。首先，將金黃色葡萄球菌（ATCC 25923）和大腸桿菌（ATCC 25922）接種到營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中。分別取100μL大腸桿菌和金黃色葡萄球菌（約106CFU/mL）均勻分布在瓊脂平板上，將凝膠（直徑6mm）置于瓊脂平板上并在37℃下培養(yǎng)24h。測量并記錄抑制區(qū)半徑以評估抗菌活性。

(8)抗菌性能

根據(jù)平板計數(shù)法單位（CFU）對大腸桿菌（ATCC 25922）和金黃色葡萄球菌（ATCC 25923）進(jìn)行了實驗。凝膠在紫外燈下提前滅菌2h。首先，原菌活化后，將金黃色葡萄球菌和大腸桿菌分別接種至營養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基。隨后將細(xì)菌稀釋至105CFU/mL。將上述細(xì)菌懸浮液放入凝膠中后，在37℃下不斷振蕩2h。然后，從凝膠溶液中吸取100μL，將其稀釋至合適濃度的細(xì)菌懸浮液均勻涂布到營養(yǎng)肉湯瓊脂平板上，并在37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。之后，記錄細(xì)菌菌落并計數(shù)，實驗重復(fù)3次。

根據(jù)公式（4）計算殺菌率I：

式中：N空白和N實驗分別表示對照樣品和實驗樣品的細(xì)菌數(shù)量。

2.結(jié)果與討論

(1)CMG凝膠的微觀結(jié)構(gòu)

圖1為凝膠表面的微觀形貌圖。雖然所制備的凝膠均表現(xiàn)出3D網(wǎng)格結(jié)構(gòu)，但孔結(jié)構(gòu)的微觀特征因凝膠中的鉬酸銨的量而異。CMG凝膠表現(xiàn)出不規(guī)則的開放交錯網(wǎng)和層狀結(jié)構(gòu)。隨著鉬酸銨量的增加，孔壁加厚，孔壁變?yōu)橄鄬σ?guī)則和封閉，導(dǎo)致孔徑減小。這可能是由于凝膠制備過程中氫鍵的增加，導(dǎo)致冰晶的生長受限，并導(dǎo)致冷凍過程中CMN和PAM分子之間的水吸附競爭。這種加厚的孔壁由許多蜂窩狀的微孔組成，可以改善凝膠的孔隙率并增強毛細(xì)管作用。CMG復(fù)合凝膠的孔徑較小，可防止內(nèi)部水分蒸發(fā)。

圖1 CMG的SEM圖

(2)CMG凝膠的物理性質(zhì)

①凝膠含量

為了定量評價交聯(lián)度，對制備的水凝膠的凝膠含量進(jìn)行了評價。從圖2可以看出，CMG2、CMG5和CMG10凝膠的凝膠含量分別為23.8%、14.5%和9.1%。當(dāng)鉬酸銨數(shù)量增加至水凝膠結(jié)構(gòu)重量的50%時，凝膠含量降低。

圖2 CMG凝膠含量（a）和含水率（b）

②孔隙率

凝膠的多孔結(jié)構(gòu)有助于從傷口表面吸收大量滲出物。它還有助于營養(yǎng)分配，并為細(xì)胞的粘附和生長創(chuàng)造良好的環(huán)境。圖3為CMG凝膠的孔隙率圖。在這里，鉬酸銨的添加并沒有大程度影響凝膠的孔隙率，在85%～91%范圍內(nèi)的孔隙率幾乎相同。水凝膠的高度多孔結(jié)構(gòu)將支持從傷口表面吸附傷口滲出物，以幫助傷口愈合。

圖3 CMG的孔隙率

具有良好保濕性能的傷口敷料可以保持濕潤的傷口愈合環(huán)境。如圖4所示，鉬酸銨對CMG的保水率有明顯的影響。隨著鉬酸銨含量的進(jìn)一步提高，CMG的保水率增加。37℃下1h后，CMG2、CMG5、CMG10的保水率分別為73.2%、80.9%、92.5%。CMG5具有優(yōu)異的保水率和更小的孔徑，可以防止內(nèi)部水分蒸發(fā)。綜上所述，CMG5具有良好的孔隙率和保水性，有助于吸收傷口滲出物并保持濕潤的愈合環(huán)境。

圖4 CMG的保水率

(3)CMG凝膠的抗菌活性

通過圓盤擴(kuò)散法評估了CMG對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抗菌活性，并統(tǒng)計了抑制區(qū)直徑。圖5為PAM、CMG2、CMG5、CMG10對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌圈照片。如圖6所示，PAM的抑制區(qū)直徑（IZD）等于0mm，沒有抗菌活性。CMG2對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的IZD分別為9.52mm和6.01mm，顯示出一定的抗菌活性，這歸因于鉬酸鹽釋放的鈣離子破壞了細(xì)菌膜，破壞了DNA復(fù)制。與CMG2相比，CMG5的IZD均顯著增加（p＜0.01），顯示出更有效的抗菌性能，對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的IZD分別為9.46mm和8.13mm。換句話說，在相同劑量的硝酸鈣下，CMG5對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑制程度是CMG10的1.3倍。說明過量的鉬酸銨會促進(jìn)凝膠團(tuán)簇的形成，從而減弱了抗菌活性。

圖5 PAM、CMG2、CMG5、CMG10凝膠對大腸桿菌（a）與金黃色葡萄球菌（b）的抑菌圈照片

圖6 CMG2、CMG5、CMG10凝膠對大腸桿菌（a）與金黃色葡萄球菌（b）的抑菌圈效果圖

(4)CMG凝膠的抗菌性能

圖7為凝膠在不同時間大腸桿菌與金黃色葡萄球菌的活細(xì)菌數(shù)量。可見，CMG2和CMG5對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌表現(xiàn)出優(yōu)良的抗菌性能，并具有抗菌持久性。如圖8所示，空白PAM表面所黏附的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的數(shù)量分別為1.30×107CFU/mL、2.03×107CFU/mL，與空白PAM相比，CMG2表面黏附的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的數(shù)量分別下降到前者的1.54%和35.22%。CMG5表面黏附的大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的數(shù)量分別下降到前者的0.77%和27.09%。大腸桿菌和金黃色葡萄球菌在CMG10表面黏附的活細(xì)菌數(shù)量分別下降到空白PAM表面的44.62%和47.29%。結(jié)果表明，CMG凝膠具有一定的抗菌性能，且隨著鉬酸銨量的增加，CMG5對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抗菌效果增強；但隨著鉬酸銨劑量的進(jìn)一步升高，CMG10對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑制呈下降趨勢，抗菌效果越差（對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌均有影響）?？咕δ艿娘@著增強歸因于鉬酸鹽和鈣離子的協(xié)同功能。金屬離子的釋放是主要的滅菌途徑，但過量的鉬離子的存在導(dǎo)致離子釋放減弱。總之，CMG5對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌表現(xiàn)出優(yōu)異的抗菌活性。

圖7 不同時間大腸桿菌（a）與金黃色葡萄球菌（b）的活細(xì)菌數(shù)量

圖8 聚丙烯酰胺凝膠、CMG2、CMG5、CMG10凝膠在2h時對大腸桿菌（a）與金黃色葡萄球菌（b）的抑菌效果圖

3.結(jié)論

鉬酸鹽和硝酸鈣通過靜電相互作用形成納米線，并通過配位和靜電相互作用與聚丙烯酰胺交聯(lián)，制備了一種抗菌凝膠。通過SEM進(jìn)行了表征，相比于CMG2、CMG10凝膠，CMG5凝膠具有良好的孔隙率和保水性等物理性能。圓盤擴(kuò)散法實驗表明所制備的CMG5凝膠對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑制區(qū)直徑（IZD）分別為9.46mm和8.13mm。平板菌落計數(shù)法抗菌實驗表明所制備的抗菌凝膠對大腸桿菌的殺菌率達(dá)99.23%。綜上所述，該鉬酸鈣納米簇凝膠在抗菌、傷口敷料等領(lǐng)域具有巨大的應(yīng)用潛力。