附子多糖對(duì)深低溫凍存血管保存效果的影響研究

鐘郁佳 史業(yè)弘 王成

近年來，隨著血管移植技術(shù)和低溫醫(yī)學(xué)的不斷發(fā)展，經(jīng)深低溫凍存的血管組織在臨床得以應(yīng)用[1]。目前，臨床上常以滲透性冷凍保護(hù)劑二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)保存血管組織。滲透性冷凍保護(hù)劑可以進(jìn)入細(xì)胞有效地減輕凍存損傷，但DMSO自身具有一定的細(xì)胞毒性，隨著其濃度不斷增加，它對(duì)組織及細(xì)胞產(chǎn)生的損傷也逐漸加重[2]。因此，最適冷凍保護(hù)劑的選擇需要考慮到保護(hù)劑的特性和濃度，以此來達(dá)到更好的保存效果。目前，冷凍保護(hù)劑的發(fā)展趨勢(shì)是找尋安全無毒的冷凍保護(hù)成分代替DMSO等滲透性保護(hù)劑。糖類作為非滲透性冷凍保護(hù)劑的一種，因其無毒性且具有多種生物特性在深低溫凍存中的作用已被大量研究證實(shí)[3-5]。程晨晨等[6]通過觀察不同冷凍保護(hù)劑對(duì)液氮深低溫凍存同種帶瓣大動(dòng)脈的研究結(jié)果顯示，海藻糖對(duì)深低溫保存同種帶瓣大動(dòng)脈活性的效果優(yōu)于使用DMSO，可有效抑制組織細(xì)胞凋亡發(fā)揮對(duì)血管的保護(hù)作用。目前，將中藥多糖，如紅景天多糖、枸杞多糖等作為冷凍保護(hù)劑應(yīng)用于深低溫保存的相關(guān)研究也逐漸開展[7-8]。

附子多糖(fuzi-polysaccharides，F(xiàn)PS)是從中藥附子中提取的葡聚糖，無明顯毒性，且具有抗氧化應(yīng)激、清除自由基，保護(hù)血管平滑肌細(xì)胞等作用[9]。但附子多糖能否作為冷凍保護(hù)劑發(fā)揮對(duì)深低溫凍存血管的保護(hù)作用目前尚未見相關(guān)報(bào)道。本研究將FPS應(yīng)用于經(jīng)深低溫凍存的SD大鼠腹主動(dòng)脈，探討其能否在深低溫環(huán)境中通過抑制線粒體凋亡通路發(fā)揮對(duì)血管的保護(hù)作用，并探尋FPS的最適濃度。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)健康雄性SD大鼠36只，8周齡，體質(zhì)量為(200±20)g，購(gòu)于長(zhǎng)沙市天勤生物技術(shù)有限公司(實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(湘)2019-0014)。所有大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，保持12小時(shí)的光/暗周期，自由活動(dòng)進(jìn)食和飲水。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)遵義醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，編號(hào)：倫審(2021)2021ZH0091。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器

附子多糖(批號(hào)：U-F-FZTQW20200825)，購(gòu)自陜西昂盛生物醫(yī)藥科技有限公司。精準(zhǔn)稱量附子多糖粉劑1 mg、10 mg、100 mg、200 mg，各自溶于10 mL滅菌注射用水中，充分?jǐn)嚢枋蛊淙芙猓脼V膜過濾至10 mL離心管中，配制成濃度0.1 mg/mL、1 mg/mL、10 mg/mL、20 mg/mL的附子多糖冷凍保護(hù)劑，4℃冰箱冷藏保存。

4%多聚甲醛固定液(批號(hào)：E672002-0500)、蘇木素伊紅染色試劑盒(批號(hào)：E607318)，購(gòu)自上海生工生物技術(shù)公司；RIPA裂解液(批號(hào)：P0013E)、組織線粒體分離試劑盒(批號(hào)：C3606)、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(批號(hào)：P0012)、SDS-PAGE凝膠配置試劑盒(批號(hào)：P0012A)均購(gòu)自中國(guó)碧云天生物科技公司；兔抗Bcl-2(批號(hào)：ab182858)、Bax(批號(hào)：ab32503)、Cyt-c(批號(hào)：ab133504)、Caspase-9(批號(hào)：ab32539)，購(gòu)自Abcam公司；兔抗GAPDH(批號(hào)：KGAA002)、山羊抗兔二抗(批號(hào)：KGAA35)購(gòu)自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司；Bcl-2、Bax、GAPDH引物由上海生工合成；RNA提取試劑盒(批號(hào)：9767)、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(批號(hào)：RR047A)、SYBR Premix Ex TaqⅡ(批號(hào)：RR820A)均購(gòu)自日本Takara公司。

全自動(dòng)組織切片機(jī)(德國(guó)萊卡公司，型號(hào)：RM2235)；光學(xué)顯微鏡(日本Olympus公司，型號(hào)：BX43)；超微量分光光度計(jì)(美國(guó)Thermo公司，型號(hào)：NanoDrop2000)；熒光定量PCR儀(美國(guó)安捷倫科技公司，型號(hào)：Mx3000P)；轉(zhuǎn)印電泳儀(北京六一生物科技有限公司，型號(hào)：DYCZ-40K)；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(美國(guó)sigma公司，型號(hào)：3K15)。

1.3 動(dòng)物分組與處理

將36只大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組(未做任何處理)、凍存模型組(滅菌注射用水)、FPS 0.1 mg/mL組、FPS 1 mg/mL組、FPS 10 mg/mL組和FPS 20 mg/mL組。空氣栓塞法處死大鼠后，無菌環(huán)境下游離腹主動(dòng)脈，生理鹽水洗去殘血，修剪周圍多余脂肪、結(jié)締組織。將凍存模型組和FPS濃度組分別置于對(duì)應(yīng)溶液的凍存管中，經(jīng)4℃平衡20分鐘后放入程序降溫盒梯度降溫至-80℃過夜，次日放入液氮中保存，1周后取出凍存管于37℃水浴中快速?gòu)?fù)溫進(jìn)行指標(biāo)檢測(cè)。對(duì)照組取材后直接進(jìn)行檢測(cè)。

1.4 指標(biāo)檢測(cè)

1.4.1 蘇木精—伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色 4%多聚甲醛固定24小時(shí)后脫水、包埋、切片(0.3 μm)。60℃烤片1小時(shí)，二甲苯及梯度酒精脫蠟，蘇木素染色，鹽酸酒精分化，伊紅染色，逆梯度酒精及二甲苯脫水，樹脂封片。光學(xué)顯微鏡下400倍觀察腹主動(dòng)脈各層結(jié)構(gòu)完整性。

1.4.2 蛋白免疫印跡法(western blot，WB)檢測(cè) B淋巴細(xì)胞瘤-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2-associated X protein，Bax)、細(xì)胞色素c(cytochrome c，Cyt-c)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-9(cysteinE-dependent aspartatE-specifc proteases-9，Caspase-9)蛋白表達(dá)腹主動(dòng)脈剪切成細(xì)小的碎片放入1.5 mL滅菌干燥EP管中，一次性研磨棒充分研磨，其間不斷加入液氮，直至研磨成粉末狀。加入裂解液提取總蛋白和胞漿蛋白，胞漿蛋白提取時(shí)需加入組織線粒體分離試劑，Cyt-c使用胞漿蛋白，Bcl-2、Bax、Caspase-9使用總蛋白。用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度；配制SDS-PAGE分離膠和濃縮膠，放入電泳槽內(nèi)；取適量蛋白質(zhì)樣品與5×上樣緩沖液4∶1混勻，于沸水中處理使蛋白變性；上樣，電泳；將目的蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%脫脂牛奶搖床封閉2小時(shí)，TBST溶液洗膜3次，每次5分鐘，分別加入稀釋的Bcl-2、Bax、Cyt-c、Caspase-9、GAPDH一抗中，4℃孵育過夜。次日室溫孵育復(fù)溫，TBST溶液洗膜3次，每次10分鐘；加入羊抗兔二抗工作液(1∶1500稀釋)內(nèi)，室溫孵育1小時(shí)，TBST溶液洗膜洗膜3次，每次10分鐘；最后采用ECL發(fā)光試劑盒顯影。Image J分析條帶的吸光度值，計(jì)算蛋白相對(duì)內(nèi)參GAPDH的表達(dá)量。

1.4.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time quantitative PCR，qRT-PCR)腹主動(dòng)脈中Bcl-2、Bax mRNA表達(dá) 取大鼠腹主動(dòng)脈50 mg，按動(dòng)物組織總RNA提取試劑盒說明書方法進(jìn)行總RNA提取。采用紫外—可見分光光度計(jì)測(cè)定RNA的濃度和純度，取光密度比值OD260/OD280值最好在1.9～2.0之間的樣品，根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行操作，在基因擴(kuò)增儀中(37℃孵育15分鐘；85℃孵育5秒)逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA。以cDNA為模板采用兩步法進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系(共20 μL)包括2× TB Green Premix Ex Taq II 10 μL，cDNA模板2 μL，上、下游引物各0.8 μL，RNasE-free ddHO 6.4 μL。反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性30秒；95℃退火5秒，60℃延伸30秒，共40個(gè)循環(huán)。GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算各組大鼠腹主動(dòng)脈中Bcl-2、Bax mRNA表達(dá)水平。引物由生工生物工程股份有限公司合成，引物序列見表1。

表1 引物序列

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 附子多糖對(duì)深低溫凍存大鼠血管組織病理形態(tài)的影響

光鏡下，與對(duì)照組相比，凍存模型組內(nèi)膜斷裂，中膜結(jié)構(gòu)層次紊亂，平滑肌細(xì)胞排列疏松，空泡樣改變嚴(yán)重，細(xì)胞核數(shù)目明顯減少，胞質(zhì)染色淺，外膜結(jié)構(gòu)消失。說明深低溫凍存過程破壞了血管組織結(jié)構(gòu)的完整性；與凍存模型組相比，F(xiàn)PS 0.1 mg/mL組表現(xiàn)類似，可見內(nèi)皮細(xì)胞大面積脫失，內(nèi)彈力膜斷裂不連續(xù)，平滑肌細(xì)胞排列疏松，空泡樣改變嚴(yán)重，細(xì)胞核數(shù)目明顯減少，胞質(zhì)染色淺；從FPS濃度1 mg/mL起，血管組織內(nèi)膜連續(xù)性開始增強(qiáng)，中膜層纖維組織排列相對(duì)緊密，外膜可見；FPS 10 mg/mL組、FPS 20 mg/mL組膜結(jié)構(gòu)保存與對(duì)照組相似，內(nèi)皮細(xì)胞連續(xù)排列，內(nèi)彈性膜完整，平滑肌細(xì)胞緊密排列，細(xì)胞核呈桿狀，胞質(zhì)粉紅色，組織結(jié)構(gòu)保存相對(duì)完整。見表2、圖1。

注：A為對(duì)照組；B為凍存模型組；C為FPS 0.1 mg/mL組；D為FPS 1 mg/mL組；E為FPS 10 mg/mL組；F為FPS 20 mg/mL組。

表2 各組深低溫凍存大鼠血管組織病理形態(tài)學(xué)比較鼠只=6)

2.2 附子多糖對(duì)深低溫凍存大鼠血管組織Bcl-2、Bax、Cyt-c、Caspase-9蛋白表達(dá)的影響

與對(duì)照組比較，凍存模型組Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，Bax、Cyt-c、Caspase-9蛋白表達(dá)水平均顯著增加(P<0.05)。與凍存模型組比較，不同濃度FPS組Bcl-2蛋白表達(dá)均明顯增加(P<0.05)；FPS 0.1 mg/mL組Bax、Cyt-c、Caspase-9蛋白表達(dá)無顯著差異(P>0.05)，其余各濃度組Bax、Cyt-c、Caspase-9蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05)；與FPS 0.1 mg/mL、FPS 1 mg/mL組相比較，高劑量組(FPS 10 mg/mL、FPS 20 mg/mL)可以顯著上調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)水平(P<0.05)，下調(diào)Bax、Cyt-c、Caspase-9蛋白表達(dá)水平(P<0.05)，且FPS 10 mg/mL時(shí)，對(duì)促凋亡因子蛋白表達(dá)的抑制和抗凋亡因子蛋白表達(dá)的促進(jìn)基本達(dá)到飽和。見圖2、表3。

表3 各組大鼠血管組織Bcl-2、Bax、Cyt-c、Caspase-9蛋白表達(dá)水平比較鼠只=6)

注：A為對(duì)照組；B為凍存模型組；C為FPS 0.1 mg/mL組;D為FPS 1 mg/mL組;E為FPS 10 mg/mL組;F為FPS 20 mg/mL組

2.3 附子多糖對(duì)深低溫凍存大鼠血管組織Bcl-2、Bax mRNA表達(dá)的影響

與對(duì)照組比較，凍存模型組Bcl-2 mRNA表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)，Bax mRNA表達(dá)水平均顯明增加(P<0.05)。與凍存模型組比較，不同濃度FPS組Bax mRNA表達(dá)均明顯降低(P<0.05)；除FPS 0.1 mg/mL組外，其余FPS濃度組Bcl-2 mRNA表達(dá)均增加(P<0.05)；各濃度FPS組相比，F(xiàn)PS 10 mg/mL組可以顯著上調(diào)Bcl-2 mRNA表達(dá)水平，下調(diào)Bax mRNA表達(dá)水平。見表4。

表4 各組大鼠血管組織Bcl-2、Bax mRNA表達(dá)水平比較鼠只=6)

3 討論

學(xué)術(shù)界普遍認(rèn)同深低溫凍存技術(shù)可以長(zhǎng)期保存生物器官組織活性[10]。低溫生物學(xué)研究證實(shí)，細(xì)胞的活躍程度在低溫的周圍環(huán)境中逐漸下降，各種酶活性也會(huì)相應(yīng)下降。在深低溫環(huán)境(-196℃液氮)中，理論上所有生物活動(dòng)都會(huì)停止。此時(shí)，細(xì)胞既不會(huì)凋亡，也不會(huì)壞死，故組織細(xì)胞的生命活性得以保存[11]。待需要使用時(shí)，給予一定條件復(fù)溫后組織細(xì)胞可以恢復(fù)其活性，發(fā)揮功能。然而，冷凍和解凍過程都會(huì)對(duì)細(xì)胞、組織造成一定損傷[12]。在冷凍過程中，由于各種外界刺激的影響可促使細(xì)胞內(nèi)發(fā)生一系列的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，從而發(fā)生凋亡[13]。研究發(fā)現(xiàn)，低溫?fù)p傷導(dǎo)致的凋亡更多是通過線粒體介導(dǎo)的[14]。線粒體對(duì)低溫很敏感，強(qiáng)烈的低溫刺激造成線粒體功能障礙，從而導(dǎo)致自噬、凋亡、壞死等下游事件的發(fā)生。Bcl-2家族是線粒體凋亡途徑的主要調(diào)節(jié)因子，其中以Bcl-2為代表的抗凋亡蛋白和Bax為代表的促凋亡蛋白間的相互抗衡和相互作用決定著細(xì)胞的生存或死亡[15]。兩者通過穩(wěn)定細(xì)胞膜完整性和抑制線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(mitochondrial permeablity transition pore，MPTP)的開放來阻止Cyt-c從線粒體釋放。而Cyt-c可以通過結(jié)合凋亡蛋白酶活化因子-1(apoptotic protease activating factor-1，Apaf-1)和Caspase-9前體形成凋亡小體，從而激活凋亡執(zhí)行者半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(cysteinE-dependent aspartatE-specifc proteases-3，CaspasE-3)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[16]。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為中藥附子有回陽救逆、補(bǔ)火助陽、溫陽散寒止痛的功效[17]。深低溫保存具有陰寒之環(huán)境，根據(jù)中醫(yī)“陰陽”辨證關(guān)系，性大熱的附子有可能對(duì)抗深低溫之寒冷。本研究發(fā)現(xiàn)，凍存模型組大鼠腹主動(dòng)脈損傷高于對(duì)照組，說明低溫環(huán)境可以導(dǎo)致血管組織細(xì)胞損傷。而FPS作為冷凍保護(hù)劑時(shí)有較好的保護(hù)效果，結(jié)果顯示，添加一定濃度的FPS有利于保存血管結(jié)構(gòu)的完整性，其中較高濃度的FPS(FPS 10 mg/mL組、FPS 20 mg/mg組)內(nèi)皮細(xì)胞、內(nèi)彈力膜及平滑肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)保存明顯優(yōu)于其余各組，能較好的保持大鼠腹主動(dòng)脈正常結(jié)構(gòu)。

為進(jìn)一步探討FPS抑制低溫?fù)p害導(dǎo)致凋亡的可能機(jī)制，本研究對(duì)Bcl-2/Bax-Cyt-c-Caspase-9信號(hào)途徑進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果表明，當(dāng)血管組織經(jīng)深低溫凍存后，Bcl-2和Bax比例平衡被打破，導(dǎo)致線粒體通透性增加，Cyt-c從線粒體內(nèi)膜釋放，進(jìn)一步激活Caspase-9，誘發(fā)凋亡。本研究結(jié)果中，蛋白表達(dá)與mRNA表達(dá)結(jié)果不一致。一方面，可能因?yàn)榈蜏貙?duì)RNA和蛋白等生物大分子具有不同程度的影響[18]；另一方面，基因經(jīng)轉(zhuǎn)錄、翻譯成蛋白質(zhì)后，還需進(jìn)行磷酸化、糖基化等修飾，因而會(huì)存在蛋白質(zhì)與基因表達(dá)并不完全一致[19-20]。而蛋白質(zhì)作為生理功能的執(zhí)行者，更能夠直觀反映出基因的表達(dá)水平。研究發(fā)現(xiàn)，只有達(dá)到一定濃度的FPS才能起到抑制凍存所致血管組織細(xì)胞凋亡的作用，不同濃度的FPS對(duì)凋亡的影響并不一致。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們得出濃度為1 mg/mL的FPS是對(duì)深低溫凍存血管組織產(chǎn)生保護(hù)作用的起始濃度；FPS濃度為10 mg/mL時(shí)對(duì)促凋亡因子的抑制和抗凋亡因子的促進(jìn)基本達(dá)到飽和，F(xiàn)PS濃度為10 mg/mL和20 mg/mL時(shí)能最大限度地抑制線粒體凋亡通路中相關(guān)基因的表達(dá)，兩者效果相近，但FPS 10 mg/mL組即在藥物用量相對(duì)較少的情況下就能產(chǎn)生對(duì)深低溫凍存血管的保護(hù)作用，故濃度為10 mg/mL時(shí)可能是FPS作為冷凍保護(hù)劑的最適濃度。

綜上所述，本研究通過光鏡、WB和qRT-PCR證實(shí)FPS可以減輕深低溫凍存血管組織的凍存損傷，其作用機(jī)制可能與其通過對(duì)線粒體凋亡通路相關(guān)基因的調(diào)控，抑制細(xì)胞凋亡，從而起到對(duì)血管組織的保護(hù)作用有關(guān)。然而鑒于細(xì)胞凋亡途徑的多樣性以及是否還涉及其他相關(guān)基因，后續(xù)的研究還需在此方面做出進(jìn)一步探索。