蘋果上鏈格孢菌所致病害防治藥劑篩選

李有德，陳萬杰，任維超，王彩霞，李保華*

（1.青島農(nóng)業(yè)大學植物醫(yī)學學院，山東青島 266109；2.冠縣農(nóng)技推廣服務(wù)中心，山東聊城 252500）

鏈格孢屬（Alternaria）是自然界廣泛存在的一類真菌，以腐生、寄生和內(nèi)寄生方式在各種基質(zhì)上生長繁殖，在多種作物上都能誘發(fā)病害，如煙草赤星病、甘藍黑斑病等[1-2]。在蘋果上，鏈格孢菌能侵染葉片，誘發(fā)蘋果斑點落葉?。ˋpple Alternaria leaf spot），侵染果實能誘發(fā)霉心、黑斑、黑點、紅點等癥狀[3-4]。在發(fā)病嚴重的果園或年份，由于鏈格孢菌誘發(fā)的黑點和紅點病果達80%以上，嚴重影響了果品的質(zhì)量、耐儲性和果農(nóng)的收入[5-6]。侵染蘋果果實的鏈格孢菌為弱致病菌，病菌需先在花器和果實的死組織或表面利用死體營養(yǎng)生長擴展，形成發(fā)達的菌絲或菌落后，再在適宜條件下從傷口侵入果實內(nèi)部，誘發(fā)各種癥狀[7]。

壓低鏈格孢菌在花器和果實上的定殖量，鏟除已定殖的鏈格孢病菌，能有效降低鏈格孢菌誘發(fā)的各種癥狀[8]?；瘜W防治是壓低花器和果實上定殖鏈格孢菌、降低果實發(fā)病率的有效技術(shù)措施[9]。防治鏈格孢菌所致病害的化學藥劑，主要在蘋果開花后、果實套袋前和果實生長后期噴施，以壓低花器、果實表面定殖鏈格孢菌的菌源量。然而，目前用于防治鏈格孢菌所致病害的化學藥劑都達不到理想的效果，而且使用不當會影響坐果率[10]。生物源殺菌劑，如多抗霉素，雖對花器和果實的傷害小，但防治效果差。因此，本文測試了苯醚甲環(huán)唑、氟唑菌酰羥胺等12種殺菌劑，并測定其對鏈格孢菌的毒力、對果實表面定殖鏈格孢菌的防治效果以及對花器的影響，以期為防治鏈格孢菌所致病害提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試藥劑

10%苯醚甲環(huán)唑WG、20%氟唑菌酰羥胺SC，先正達南通作物保護有限公司；25%吡唑醚菌酯EC，巴斯夫植物保護（江蘇）有限公司；80%代森錳鋅WP，陶氏益農(nóng)農(nóng)業(yè)科技（中國）有限公司；22.7%二氰蒽醌SC，江西禾益化工股份有限公司；50%異菌脲SC，蘇州富美實植物保護有限公司；40%嘧霉胺SC，拜耳作物科學有限公司北京分公司；10%多抗霉素WP，日本科研制藥株式會社；80%克菌丹WG，安道麥馬克西姆有限公司；2%春雷霉素AS，日本北興化學工業(yè)株式會社；70%甲基硫菌靈WP，深圳諾普信農(nóng)化股份有限公司；33.5%喹啉銅EC，興農(nóng)藥業(yè)（中國）有限公司。

1.2 供試菌株

2020年9—10月，自山東省青島市采集富士蘋果的正常生長果實，用自來水沖洗后，切取果實表皮，轉(zhuǎn)入馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）中分離獲得3株鏈格孢菌，經(jīng)分生孢子形態(tài)和ITS序列鑒定[1,11-13]，3株菌分別鑒定為交鏈格孢菌（A. alternata）、細極鏈格孢菌（A. tenuissima）和巴恩斯鏈格孢菌（A.burnsii）。自甘肅天水采集元帥蘋果斑點落葉病的葉片，從病斑上分離獲得1株鏈格孢菌，鑒定為茄鏈格孢菌（A.solani）。將4株鏈格孢菌在PDA中培養(yǎng)3～5 d后，用直徑5 mm的打孔器打取菌餅，測試殺菌劑對鏈格孢菌的毒力。將交鏈格孢菌在PDA平板上置于25℃恒溫箱中培養(yǎng)10 d，每個平板加入10 mL無菌水并震蕩，將孢子沖洗下來成孢子懸浮液，調(diào)整孢子濃度至104個/mL，加入0.1%的吐溫20，用于接種。孢子懸浮液在30 min內(nèi)用完。

1.3 殺菌劑對鏈格孢菌的毒力試驗

采用菌絲生長速率法[14-15]測試除70%甲基硫菌靈WP和33.5%喹啉銅EC外的10種殺菌劑對4株鏈格孢菌的毒力。將殺菌劑用滅菌蒸餾水配成母液，當PDA冷卻至50℃左右時，加入藥劑母液，混勻后配制成含有5個質(zhì)量濃度梯度的藥劑PDA平板，以不加藥劑的PDA平板為空白對照，見表1。每株鏈格孢菌于每個藥劑濃度處理接種2個平板，全部試驗重復3次。菌餅接種到平板的中央，密封后置于25℃的恒溫箱中培養(yǎng)，3 d后用十字交叉法測量菌落直徑。10%苯醚甲環(huán)唑WG等10種殺菌劑對菌絲生長抑制率為

表1 12 種供試殺菌劑的毒力測試劑量和噴施果實和花器使用劑量

1.4 殺菌劑對蘋果果實表面定殖鏈格孢菌和腐生真菌的鏟除效果試驗

1.4.1 試驗設(shè)計

采用殺菌劑處理后切取果實表皮分離真菌的方法，測試11種殺菌劑（春雷霉素對鏈格孢菌的毒力差，且主要用于防控細菌病害，故沒有測試2%春雷霉素AS）對蘋果果實表面定殖鏈格孢菌和腐生真菌的鏟除效果。藥劑按廠家推薦劑量使用（表1），以清水為對照，共設(shè)12個處理，試驗重復3次。

1.4.2 培養(yǎng)基的準備

2021年冬季分3批次從市場購置分別產(chǎn)自煙臺市、青島市和大連市的富士、王林和金帥品種的套袋蘋果果實，將果實分成分12組，每組3個。用手持噴霧器將配好的藥劑均勻噴到果實表面，直到藥液自然流下為止，室內(nèi)自然晾干后轉(zhuǎn)入25℃恒溫箱中放置。3 d后，用直徑5 mm的消毒打孔器從每個果實萼部、腰部、梗部各打取4個組織塊，分別接種于2個PDA平板中，每種平板共接種3個部位的6個組織塊，果皮緊貼培養(yǎng)基。將接種蘋果組織塊的培養(yǎng)皿用保鮮膜密封后，轉(zhuǎn)入25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，3～5 d后檢查記錄每塊表皮組織塊上分離到真菌的菌落數(shù)和鏈格孢菌的菌落數(shù)。

1.4.3 鏟除效果的測定

當同一個組織塊所形成的菌落從形態(tài)、顏色和空間位置上無法區(qū)分為不同的菌落時，計為1個菌落；當從形態(tài)和顏色可區(qū)分為不同真菌時，每種真菌計為1個菌落；當從空間位置可區(qū)分為2個完全不同的菌落時，計為2個菌落。依據(jù)菌落形態(tài)和顏色及分生孢子形態(tài)判定每個菌落是否屬鏈格孢菌[16]；當無法判定是否為鏈格孢菌時，轉(zhuǎn)入新的PDA培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)。藥劑對果實表面定殖真菌的鏟除率為

1.5 殺菌劑對花器的影響

通過先接種后施藥的方法[17-18]，選擇8種果園內(nèi)常用對鏈格孢菌毒力較高的殺菌劑在離體花叢上測試對花器的影響。于西府海棠盛花期剪取盛開花朵的枝條，插入自來水中，用手持噴霧器將鏈格孢菌的分生孢子懸浮液噴霧接種在所有花器上，直到滴水為止。待孢子懸液在室內(nèi)自然條件下晾干后，噴施殺菌劑，每種藥劑處理2個枝條。殺菌劑使用廠家推薦劑量（表1），以清水為對照。待花朵上的藥液完全晾干后，從2個枝條上隨機摘取20個完全盛開的花朵，置于直徑15 cm的培養(yǎng)皿中。每種藥劑一個培養(yǎng)皿，密封后轉(zhuǎn)入25℃恒溫箱培養(yǎng)。7 d后觀測記錄花柱的壞死長度、花瓣變色狀況和壞死面積，試驗重復3次。花柱壞死長度按2級記錄：1級為花柱基部有未壞死綠色組織；2級為花柱整體壞死，基部無綠色組織。花瓣變色,壞死面積按3級記錄：1級為整朵花所有花瓣變色，壞死面積占總花瓣面積的10%以下；2級為花瓣變色，壞死面積占花瓣面積的10%～80%；3級為花瓣變色，壞死面積占花瓣面積的80%以上。藥劑對花柱壞死抑制效果和花瓣衰敗指數(shù)計算公式如下：

1.6 數(shù)據(jù)處理

以菌絲生長抑制率和相應(yīng)的菌絲生長率（100%-菌絲生長抑制率）為因變量，以藥劑劑量的對數(shù)值為自變量，擬合廣義線性模型（GLM）。GLM中的family參數(shù)選擇二項分布（Binomial）。依據(jù)擬合模型，計算EC50和置信區(qū)間。通過鄧肯（Duncan）多重比較法計算差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 殺菌劑對4株鏈格孢菌的毒力

在25℃下培養(yǎng)3 d后，接種到混有殺菌劑PDA平板上的4株鏈格孢菌的菌絲生長都受到不同程度的抑制。A.burnsii、A.alternata、A.solani和A.tenuissima在不含殺菌劑的PDA平板上生長菌落的平均直徑分別為（4.24±0.26）、（4.69±0.19）、（3.58±0.48）和（4.32±0.27）cm，在含有殺菌劑培養(yǎng)基上菌絲生長的最小直徑分別為0.00、0.00、0.05和0.00 cm。在所測試的12種殺菌劑中，70%甲基硫菌靈WP和33.5%喹啉銅EC的數(shù)據(jù)規(guī)律未能擬合毒力曲線。另外10種殺菌劑中，10%苯醚甲環(huán)唑WG對鏈格孢菌的毒力最強（表2）；其次是20%氟唑菌酰羥胺SC；50%異菌脲SC和40%嘧霉胺SC對4種鏈格孢屬真菌也有較強的毒力，EC50的均值分別為1.626 mg/L和3.064 mg/L；80%代森錳鋅WP和22.7%二氰蒽醌SC的毒力相當，均為28.48 mg/L；2%春雷霉素AS對鏈格孢菌的毒力較差，EC50的均值分別為87.54 mg/L。A. burnsii、A.alternata、A.solani和A.tenuissima 4種菌對10種殺菌劑EC50的均值分別為16.18、29.28、21.60和33.79 mg/L，表明4種鏈格孢菌菌株對殺菌劑的敏感度存在一定差異，其中，對25%吡唑醚菌酯EC敏感度差異最大，EC50的最高值與最低值相差達20.04倍，對其他9種殺菌劑的敏感度差異不大，EC50的最高值與最低值相差均不超過5.5倍（表2）。

表2 10 種殺菌劑對4 種鏈格孢菌菌絲生長的毒力

2.2 殺菌劑對果實表面定殖鏈格孢菌和腐生真菌的鏟除效果

11種殺菌劑對果實表面定殖鏈格孢菌和腐生真菌有不同的鏟除效果。在清水處理（對照）的3批蘋果9個果實的108個組織塊中，共分離獲得118個真菌菌落，其中鏈格孢菌83個，每個培養(yǎng)皿（6個組織塊）中平均產(chǎn)生6.56個真菌菌落，其中鏈格孢菌4.61個，占70.3%。在11種殺菌劑中，20%氟唑菌酰羥胺SC和40%嘧霉胺SC處理果實表面分離的鏈格孢菌的菌落數(shù)分別為每皿0.56個和0.78個，與清水處理果實產(chǎn)生的菌落數(shù)4.61個存在顯著差異，表明兩種藥劑對果實表面鏈格孢菌具有鏟除效果，其鏟除率分別為87.95%和83.13%。其他9種殺菌劑處理果實表面產(chǎn)生鏈格孢菌的菌落數(shù)與對照沒有顯著差異，表明9種藥劑對果實表面已定殖的鏈格孢菌沒有顯著的鏟除效果。在所測試的11種殺菌劑中，20%氟唑菌酰羥胺SC和80%克菌丹WG處理果實表面分離獲得的真菌菌落總數(shù)分別為每皿3.78個和3.94個，與清水處理果實表面產(chǎn)生真菌菌落數(shù)存在顯著差異，表明兩種藥劑對果實表面定殖真菌具有鏟除效果，其鏟除率分別為42.37%和39.83%。其他9種藥劑處理果實表面產(chǎn)生的真菌菌落數(shù)均大于4.83個，與清水處理果實對照產(chǎn)生的菌落數(shù)沒有顯著差異，鏟除率均低于26.5%，表明9種藥劑對果實表面定殖真菌沒有顯著的鏟除作用（表3）。

表3 11 種殺菌劑對果實表面定殖鏈格孢和腐生真菌的鏟除效果

2.3 殺菌劑對花器的影響

試驗所測的8種殺菌劑對花器有不同的影響。西府海棠花的花朵接種鏈格孢菌孢子懸浮液后，清水處理花朵的花柱全部壞死，花柱基部見不到綠色的健康組織，花柱的壞死指數(shù)為0.99。在測試的8種殺菌劑中，除70%甲基硫菌靈WP外，其他7種殺菌劑對花柱的壞死都有一定的抑制效果，與清水對照存在顯著差異。其中，25%吡唑醚菌酯EC、20%氟唑菌酰羥胺SC和80%代森錳鋅WP 3種藥劑對花柱的壞死有較好的抑制效果，分別達到38.66%、34.45%和31.93%。西府海棠花的花瓣在培養(yǎng)皿中保濕7 d后，逐漸變色并壞死（圖1）。清水處理的花朵保濕7 d后，花瓣的變色和壞死面積一般不超過整個花朵花瓣面積的10%，衰敗指數(shù)為0.38；40%嘧霉胺SC和25%吡唑醚菌酯SC處理花朵的變色和壞死面積在70%以上，衰敗指數(shù)為0.86和0.79，與對照存在顯著差異。22.7%二氰蒽醌SC和80%克菌丹WG處理花瓣衰敗指數(shù)為0.62和0.53，與對照存在顯著差異，表明4種殺菌劑對花器有傷害作用（表4）。10%多抗霉素WP、80%代森錳鋅WP、70%甲基硫菌靈WP和20%氟唑菌酰羥胺SC 4種藥劑處理花瓣衰敗指數(shù)與對照無顯著差異，表明該4種藥劑對蘋果花器的傷害作用不大。

圖1 殺菌劑處理7 d 后西府海棠花器的變化

表4 8 種殺菌劑對花柱壞死抑制效果及對花瓣的傷害作用

3 討論

在所測試的12種殺菌劑中，20%氟唑菌酰羥胺SC對鏈格孢菌的毒力強，對定殖于果實表面的鏈格孢菌和其他真菌鏟除效果好，對花柱授粉后的壞死有較好的抑制效果，對花瓣毒害作用小，可以作為花后和果實采收前防控鏈格孢菌和其他弱致病菌所致病害的首選藥劑。40%嘧霉胺SC對定殖于果實上的鏈格孢菌有較強的鏟除效果，但對定殖于果實表面其他真菌的鏟除效果較差，且對花器的傷害作用較大，可考慮在果實采收前專門防控由鏈格孢菌所誘發(fā)的各種果實病害。80%克菌丹WG對定殖于果實表面的鏈格孢菌和非鏈格孢菌有較好的鏟除效果，但對花器有一定的傷害，可考慮用于果實采收前防控由各種弱致病菌，尤其是非鏈格孢菌誘發(fā)的各種病害。80%代森錳鋅WP和22.7%二氰蒽醌SC兩種藥劑對定殖于果實表面的鏈格孢菌和其他真菌有一定的鏟除效果，對花柱授粉后的壞死也有一定的抑制效果，可用于花期和果實采收前防控鏈格孢菌和其他弱致病菌誘發(fā)病的病害。10%苯醚甲環(huán)唑WG在室內(nèi)毒力測定試驗中表現(xiàn)出對鏈格孢菌菌絲生長有較強的毒力，與已報道的研究結(jié)果相似[19]，但在對鏈格孢菌和腐生真菌的鏟除試驗中，沒有表現(xiàn)出其應(yīng)有的防治效果，不宜作為防控鏈格孢菌所致病害的殺菌劑。25%吡唑醚菌酯EC雖對花柱授粉后的壞死有較強的抑制效果，但對花器的傷害作用也較大，對果實表面定殖弱致病菌的鏟除效果差，不適合防控花期和果實采收前由各種弱致病菌誘發(fā)的病害。在蘋果病害防控中，10%多抗霉素WP一直用作防控鏈格孢菌致病害的有效藥劑，但本文試驗結(jié)果表明，10%多抗霉素WP對鏈格孢菌的毒力差，對果實表面定殖鏈格孢菌和非鏈格孢真菌的鏟除效果差，對花柱授粉后的壞死抑制效果也差，難以有效控制花期和果實采收前由鏈格孢菌和弱致病菌所誘發(fā)的各種病害，這與已有報道不同[20]。

鏈格孢菌和其他弱致病菌常定殖于花器和果實的死組織內(nèi)部，如衰敗的花柱和皮孔死組織內(nèi)，并利用死組織提供的營養(yǎng)長期存活。常見的殺菌劑難以滲入寄主的死組織內(nèi)，以鏟除定殖于死組織內(nèi)的鏈格孢菌和其他弱致病菌。因此，噴施到果實表面的殺菌劑對各種真菌的鏟除效果最高達42%左右，難以有效控制弱致病菌的致病。試驗數(shù)據(jù)表明，20%氟唑菌酰羥胺SC和40%嘧霉胺SC對鏈格孢菌的鏟除效果可達80%以上，但實際可能達不到這一效果，原因是在病菌的分離過程種，生長速度較快的雜菌可能會掩蓋一部分生長速度較慢的鏈格孢菌。因此，當鏈格孢菌在花器和果實上定殖后，殺菌劑常難以將其徹底鏟除，藥劑防控也達不到理想的效果；為了有效防控花期和果實采收前由鏈格孢菌及其他弱致病菌所致的病害，應(yīng)在病菌定殖前或定殖初期用藥，減少病菌在花器和果面上的定殖量，從而有效控制病菌的定殖與致病[21]。

4 結(jié)論

在所測試的12種藥劑中，20%氟唑菌酰羥胺SC可作為花后和果實采收前防控鏈格孢菌和其他弱致病菌所致病害的首選藥劑；其次，可考慮80%代森錳鋅WP等藥劑；40%嘧霉胺SC和80%克菌丹WG只能用于果實采收前防控鏈格孢菌和其他弱致病菌所致果實病害；不推薦10%多抗霉素WP作為防控鏈格孢菌所致各種病害的殺菌劑。