陳釀時(shí)間對(duì)黃酒中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)和氨基酸含量的影響研究

沈 棚，薛紅瑋

（1.上?？抵Z執(zhí)信食品有限公司，上海 201703；2.上海營(yíng)家生物科技有限公司，上海 201703）

黃酒是中國(guó)傳統(tǒng)釀造酒，其歷史可以追溯到5 000多年前，其與啤酒、葡萄酒并稱是世界三大古酒[1]。黃酒通常是以谷物為原料、經(jīng)過浸泡、蒸煮、加曲、發(fā)酵、壓榨、過濾、煎酒、陳釀等復(fù)雜工序釀制而成[2]。由于其獨(dú)特的原料和復(fù)雜的釀造工藝賦予了黃酒甜、苦、鮮、澀、酸的口感和醇香、果香、曲香、焦糖香等豐富的風(fēng)味[3]。黃酒的風(fēng)味是評(píng)價(jià)其品質(zhì)的重要指標(biāo)之一，黃酒中的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)對(duì)其整體風(fēng)味有著重要貢獻(xiàn)，而不同陳釀年份的黃酒風(fēng)味成分也有所不同。而黃酒的特點(diǎn)就在于隨著陳釀時(shí)間的延長(zhǎng)，其風(fēng)味會(huì)愈加豐富、協(xié)調(diào)，其香氣也會(huì)更加濃郁、醇和[4]。對(duì)于同一種黃酒樣品而言，不同陳釀時(shí)間使得黃酒中各香氣物質(zhì)含量也會(huì)有所不同。

黃酒由于其特殊的發(fā)酵工藝保留了絕大部分對(duì)人體有益的營(yíng)養(yǎng)成分，并且在其發(fā)酵過程中也會(huì)產(chǎn)生部分容易被人體吸收利用的功能性成分，如氨基酸、低聚糖、活性肽、酚類等[5-7]，因此黃酒被稱之為“液體蛋糕”[8]。其中，氨基酸是黃酒中較為重要的一類營(yíng)養(yǎng)素，主要來源于其獨(dú)特的原料與微生物的代謝作用，對(duì)評(píng)價(jià)黃酒的品質(zhì)至關(guān)重要[9]。氨基酸具有多種味感，可以協(xié)調(diào)黃酒中的醇類、酯類、酚類等物質(zhì)，賦予了黃酒豐富的味覺層次[10]。目前，有關(guān)氨基酸的測(cè)定方法主要有比色法、毛細(xì)管電泳法以及紙層析法等，但是這些方法存在操作繁瑣、定量不準(zhǔn)確等問題，而全自動(dòng)氨基酸分析儀不僅準(zhǔn)確、操作簡(jiǎn)單，還具有良好的重現(xiàn)性[11]。高云超等[12-13]采用全自動(dòng)氨基酸分析儀，分析測(cè)定氨基酸含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)黃酒中含有十分豐富的氨基酸。黃酒的香氣是由酒中各種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)所提供的，而其口味又很大程度上受氨基酸的影響[14]。苗雨田等[13]則建立采用全自動(dòng)氨基酸分析儀測(cè)定黃酒中游離氨基酸的含量的方法，測(cè)定不同年份的黃酒中游離氨基酸含量，并發(fā)現(xiàn)不同酒齡的黃酒中氨基酸的總含量不同，各氨基酸含量隨年份的不同也會(huì)發(fā)生變化。本研究將通過頂空固相微萃取與氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）法以及全自動(dòng)氨基酸分析儀對(duì)不同陳釀年份黃酒中的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)、氨基酸含量進(jìn)行測(cè)定，以期對(duì)不同陳釀年份中黃酒風(fēng)味與營(yíng)養(yǎng)研究提供一定的研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紹興黃酒樣品：2008、2010、2012、2014、2018、2019年份的黃酒，分別為14年陳、12年陳、10年陳、8年陳、4年陳、3年陳，均采用相同工藝制作，源自農(nóng)家自釀。

氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)液（B型）：日本和光純藥株式會(huì)社。

1.2 儀器與設(shè)備

固相微萃?。╯olid-phase microextraction，SPME）裝置配SPME手柄、50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭、8890-5975氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀、DB-5MS（30m×0.25mm，0.25μm）毛細(xì)管色譜柱：美國(guó)Agilent科技有限公司；L-8900全自動(dòng)氨基酸分析儀：日本日立公司。

1.3 方法

1.3.1 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)測(cè)定

前處理?xiàng)l件：取5 mL黃酒樣品于頂空瓶中，放入轉(zhuǎn)子并蓋上蓋子，置于50 ℃固相萃取臺(tái)上，并使用萃取頭進(jìn)行吸附40 min，250 ℃解吸10 min，用于GC-MS測(cè)定。

色譜條件：柱溫程序?yàn)槠鹗紲囟?0 ℃，以10 ℃/min升溫至50 ℃，保持3 min，以3 ℃/min程序升溫至80 ℃，保持3 min，以6 ℃/min程序升溫至240 ℃，保持3 min；載氣為高純氦氣（He）（純度≥99.999%），流速1 mL/min，不分流進(jìn)樣；進(jìn)樣口溫度：250 ℃。

質(zhì)譜條件：離子源溫度250 ℃，傳輸線溫度250 ℃，電子電離（electron ionization，EI）源，電子能量70 eV；采用全掃描模式，質(zhì)量掃描范圍30～550 amu。

定性定量分析：采用美國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)研究院（national institute of standards and technology，NIST）質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫檢索結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行定性分析，采用峰面積歸一化法進(jìn)行定量分析。

1.3.2 游離氨基酸含量測(cè)定

將氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)液（B型）用0.02 mol/L鹽酸配制成0.5×10-3mol/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液。取0.5 mL黃酒樣品稀釋20倍，充分混勻后，過0.22 μL水膜后通過全自動(dòng)氨基酸分析儀待測(cè)。

1.3.3 數(shù)據(jù)處理

供試樣品進(jìn)行3次重復(fù)，分析結(jié)果使用Microsoft Office Excel 2010軟件處理數(shù)據(jù)，同時(shí)采用Origin 2021軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 陳釀年份對(duì)黃酒中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的影響

固相微萃取得到的揮發(fā)性成分經(jīng)GC-MS分析，得到的總離子流色譜圖見圖1，隨后通過計(jì)算保留指數(shù)、檢索NIST 11L譜庫以及人工解析質(zhì)譜圖進(jìn)行定性，匹配度＞80的物質(zhì)共有28種，結(jié)果見表1。

圖1 不同陳釀年份黃酒酒樣揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)GC-MS分析總離子流色譜圖Fig.1 Total ion flow chromatogram of volatile flavor substances in Huangjiu samples of different aging years analysis by GC-MS

表1 不同陳釀年份黃酒酒樣中揮發(fā)性成分及相對(duì)含量Table 1 Volatile components and relative contents in Huangjiu samples of different aging years

如表1所示，6種不同年份酒中共檢測(cè)到酯類物質(zhì)13種、醇類物質(zhì)4種、醛類物質(zhì)5種、酮類物質(zhì)2種、其他物質(zhì)4種。被檢測(cè)到的酯類物質(zhì)有苯甲酸乙酯、苯乙酸乙酯、醋酸苯乙酯、γ-壬內(nèi)酯、丙酸乙酯、辛酸乙酯、2-羥基苯甲酸乙酯、丁二酸二乙酯、己酸乙酯、乙酸乙酯、煙酸乙酯、2-呋喃甲酸乙酯、苯丙酸乙酯，酯類是黃酒的主要風(fēng)味物質(zhì)之一[15]，主要呈特殊的花香或水果香氣[16]。醇類物質(zhì)有苯乙醇、辛醇、2-甲基-1-丁醇、4-羥基苯乙醇，黃酒中的醇類物質(zhì)不僅是呈味物質(zhì)，更是呈香物質(zhì)，可以起到豐富黃酒口感和助香的作用。醛類物質(zhì)有糠醛、苯甲醛、癸醛、異戊醛、α-亞乙基-苯乙醛；酮類物質(zhì)有苯乙酮、香葉基丙酮；其他物質(zhì)有棕櫚酸、2,4-二叔丁基苯酚、2-氟丙烯、檸檬烯等。并且，由表1可以看出，隨著儲(chǔ)存年份增加后，會(huì)有新的物質(zhì)產(chǎn)生，這是由于黃酒中含有多種有機(jī)酸，儲(chǔ)存過程中，醇類物質(zhì)就會(huì)與有機(jī)酸發(fā)生酯化反應(yīng)，由于新生成的這種酯類物質(zhì)都具有各自的特殊香氣，所以經(jīng)一定時(shí)間儲(chǔ)存的酒大都變得格外香醇。

不同陳釀年份黃酒酒樣中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)熱圖分析結(jié)果見圖2。由圖2可知，隨著年份的增加，黃酒中的乙醇以及少量高級(jí)醇在陳釀過程中與酒中的有機(jī)酸發(fā)生酯化反應(yīng)，促使酯類物質(zhì)的含量也不斷增加，從而使得黃酒更加具有濃郁的香氣。其中，乙酯類為黃酒中最主要的酯類物質(zhì)，本研究中所檢測(cè)出的乙酯類物質(zhì)有苯甲酸乙酯、苯乙酸乙酯、醋酸苯乙酯、丙酸乙酯、辛酸乙酯、2-羥基苯甲酸乙酯等，對(duì)酒體香氣和品質(zhì)起著決定性作用[17]。

圖2 不同陳釀年份黃酒酒樣中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)熱圖分析Fig.2 Heat map analysis of volatile flavor substances in Huangjiu samples of different aging years

醇類物質(zhì)隨著年份的增加，整體呈下降趨勢(shì)，其主要原因同樣是由于醇類物質(zhì)與酸類發(fā)生酯化反應(yīng)[18]。本實(shí)驗(yàn)中主要檢測(cè)出的醇類物質(zhì)主要為苯乙醇，苯乙醇是黃酒中的主要醇類物質(zhì)，呈玫瑰花香，具有清甜蜜樣的香氣，與醛、酯類組分融合可以形成協(xié)調(diào)而又細(xì)膩的黃酒香氣，給人以柔和、優(yōu)雅、愉悅的感覺[19]。

黃酒中還存在少量醛類物質(zhì)，醛類物質(zhì)隨著年份的增加，整體呈上升趨勢(shì)，這與江偉等[20-21]研究結(jié)果相似。其中苯甲醛為黃酒中的主要醛類物質(zhì)，具有一種令人感到愉悅的杏仁氣味。另外，本實(shí)驗(yàn)中檢出的酸類、萜類物質(zhì)、酚類化合物以及酮類化合物種類雖然較少，但其同樣是黃酒揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的重要組成成分，可以決定黃酒的風(fēng)格特征和品質(zhì)差異。

2.2 陳釀年份對(duì)黃酒中氨基酸的影響

黃酒中氨基酸主要來自于原料及微生物的代謝作用，氨基酸賦予黃酒較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，并且黃酒中很多味道來自游離氨基酸[22-24]。根據(jù)ZHAO C等[25-26]的方法可將呈味氨基酸分為鮮味氨基酸、甜味氨基酸、苦味氨基酸以及咸味氨基酸，其中鮮味氨基酸包括谷氨酸、天冬氨酸；甜味氨基酸包括丙氨酸、甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸；苦味氨基酸包括組氨酸、賴氨酸、纈氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、精氨酸；咸味氨基酸包括半胱氨酸、甲硫氨酸。該研究從6種不同年份的黃酒中共檢測(cè)出7種必需氨基酸，分別為蘇氨酸、賴氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸。不同陳釀年份對(duì)黃酒中游離氨基酸含量的影響見圖3。

由圖3可知，6種不同年份的黃酒中共檢出16種游離氨基酸，包括7種必需氨基酸和9種非必需氨基酸，其氨基酸總含量為2 802.62～3 984.85 mg/L。由圖3（a）可知，不同年份黃酒中各氨基酸含量不盡相同，14年陳黃酒樣品中丙氨酸與甘氨酸含量較高；12年陳黃酒樣品中丙氨酸、亮氨酸含量較高；10年陳黃酒樣品中丙氨酸、甘氨酸含量較高；8年陳黃酒樣品中丙氨酸、精氨酸含量較高；4年陳黃酒樣品中丙氨酸、亮氨酸含量較高；3年陳黃酒樣品中丙氨酸、亮氨酸含量較高。由此可以看出，丙氨酸為黃酒中主要游離氨基酸。必需氨基酸中，苯丙氨酸、亮氨酸的含量最高。3年陳、4年陳、8年陳黃酒中苯丙氨酸的含量高于亮氨酸，亮氨酸含量于2012年后急速增長(zhǎng)，此時(shí)亮氨酸的含量高于苯丙氨酸，后又急速下降，苯丙氨酸的含量再次高于亮氨酸。

圖3 不同陳釀年份對(duì)黃酒酒樣中氨基酸含量的影響Fig.3 Effect of different aging years on the amino acid contents in Huangjiu samples

由圖3（b）可知，6個(gè)樣品中的非必需氨基酸在陳釀3～12年間整體呈上升趨勢(shì)，其中精氨酸含量呈無規(guī)律變化。由此可發(fā)現(xiàn)隨著陳釀時(shí)間的增長(zhǎng)，在一定時(shí)間范圍內(nèi)，游離氨基酸的含量呈上升趨勢(shì)，一旦時(shí)間過長(zhǎng)，游離氨基酸的含量也會(huì)隨之下降。且無論在哪個(gè)年份中，黃酒中的甜味氨基酸和苦味氨基酸占比較大，而咸味氨基酸占比很小。

由圖3（c）可知，非必需氨基酸含量遠(yuǎn)高于必需氨基酸含量，且氨基酸總量隨著陳釀年份的增加整體呈上升趨勢(shì)，于2010年后急速下降；并且必需氨基酸含量占氨基酸總含量的35%左右，李華等[28]通過采用氨基酸自動(dòng)分析儀對(duì)黃酒糟的氨基酸組成進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，黃酒糟的必需氨基酸含量為111.7 g/kg，占氨基酸總量的36.60%，其結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似；而田翔等[9]則發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)地黃酒中必需氨基酸占總游離氨基酸含量的38.68%、51.07%、46.13%和48.39%。其原因可能是由于黃酒的產(chǎn)地、釀造原料以及發(fā)酵過程的不同或釀造過程中蛋白質(zhì)分解差異有關(guān)。

3 結(jié)論

該文研究了不同陳釀年份江浙黃酒中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)和氨基酸的變化。通過固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法對(duì)不同儲(chǔ)存年份黃酒中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)進(jìn)行分析，共鑒定出28種揮發(fā)性風(fēng)味成分，分別為酯類13種、醇類4種、醛類5種、酮類2種、其他物質(zhì)4種，主要揮發(fā)性風(fēng)味化合物由苯甲醛、苯乙醇、丁二酸二乙酯、2-甲基-1-丁醇、癸醛等；其中，醇類物質(zhì)隨著年份的增加而逐漸減少，酯類化合物隨著年份的增加而增加。通過全自動(dòng)氨基酸分析儀檢測(cè)了6個(gè)不同陳釀年份黃酒樣品中16種游離氨基酸，其氨基酸總含量為2 802.62～3 984.85 mg/L，其中包括7種必需氨基酸以及9種非必需氨基酸，并且必需氨基酸含量占氨基酸總含量的35%左右。通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，3～12年陳釀的黃酒中，隨著陳釀年份的增長(zhǎng)，游離氨基酸含量整體呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，而12年陳釀后，游離氨基酸含量急速下降。