鹽酸帕唑帕尼片的制備及體外溶出度評價

劉元芬，王糾

（1.江蘇衛(wèi)生健康職業(yè)學院，江蘇南京 211800；2.廣東省藥物新劑型重點實驗室，廣東廣州 510006；3.廣東藥科大學新藥研發(fā)中心，廣東廣州 510006；4.廣東省高校藥物緩控釋制劑工程技術研究中心，廣東廣州 510006；5.廣東省局部精準藥物遞藥制劑工程技術研究中心，廣東廣州510006）

腎癌是泌尿系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，根據(jù)相關統(tǒng)計數(shù)據(jù)，腎細胞癌是最常見的腎癌類型，約占腎癌的90%～95%，是世界上最常見的7 種癌癥之一[1]。全球每年診斷出約270 000 例腎細胞癌新病例，其中有116 000 例死亡，在晚期腎細胞癌患者中，5年生存率僅為13%[2]。

帕唑帕尼是一種可干擾頑固腫瘤存活和生長所需的新生血管生成的新型口服血管生成抑制劑，靶向作用于血管內(nèi)皮生長因子受體（VEGFR）而起作用[3-4]。鹽酸帕唑帕尼（pazopanib hydrochloride table,PZH）片為葛蘭素史克公司開發(fā)的酪氨酸激酶抑制劑，商品名為Votrient?，規(guī)格為0.2 g（以帕唑帕尼計）。2011 年歐洲藥品管理局（EMA）[5]、2012 年美國食品和藥物管理局（FDA）[6]批準上市銷售，適用于治療晚期腎細胞癌和晚期軟組織肉瘤，推薦劑量為800 mg，每天1次。目前，PZH片尚未在我國上市銷售，按《藥品注冊管理辦法》分類，屬新藥3類。

PZH 化學名為5-[[4-[（2，3-二甲基-2H-吲唑-6-基）甲氨基]-2-嘧啶基]氨基]-2-甲基-苯磺酰胺鹽酸鹽（化學結構式見圖1），分子式為C21H23N7O2S，為類白色至淡黃色結晶性粉末，微溶于甲醇，極微溶于乙醇，在pH=1的水中微溶，幾乎不溶于pH值高于4的水中[7]。

圖1 鹽酸帕唑帕尼的化學結構Figure 1 Formation of pazopanib hydrochloride

溶出度是體外評價口服固體制劑性能的重要指標。因此，本研究建立了PZH 片的體外溶出度測定方法，最后采用相似因子法評價自制PZH 片與市售PZH 原研片的溶出度相似性，為PZH 的進一步開發(fā)提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

20AD 高效液相色譜儀、SPD-20A 檢測器及Labsolution色譜工作站（日本島津公司）；菲羅門C18色譜柱（5 μm,4.6 mm×250 mm，美國安捷倫公司）；電子分析天平（十萬分之一，瑞士梅特勒）；ZRS-8智能溶出儀（天津大學無線電廠）；UV-1780 紫外分光光度計（日本島津公司）；YK-160 搖擺式顆粒機（上海天祥健臺制藥機械有限公司）；GSH-10C 高效濕法混合制粒機（重慶智龍制藥設備有限公司）；ZP-8壓片機（上海天祥健臺制藥機械有限公司）；BGB-5F高效包衣機（浙江小倫制藥機械有限公司）。

1.2 試藥與試劑

PZH 原料藥（自制，質(zhì)量分數(shù)不低于99.0%，經(jīng)檢測晶型與原研藥一致）；PZH 對照品（自制，質(zhì)量分數(shù)99.8%）；PZH 原研片（Votrient，葛蘭素史克公司，批號2010）；微晶纖維素、羧甲基淀粉鈉、硬脂酸鎂（上海昌為醫(yī)藥輔料技術有限公司）；聚維酮（巴斯夫中國有限公司）；薄膜包衣預混劑“歐巴代”（上?？房蛋录夹g有限公司）；乙腈為色譜純；其他試劑均為分析純，水為娃哈哈純凈水。

2 方法與結果

2.1 PZH片的制備

參照原研藥品說明書[7]和文獻[8]，稱取PZH 216.7 g，微晶纖維素63 g，聚維酮K30 16 g，羧甲基淀粉鈉22 g 和硬脂酸鎂3.2 g。包衣材料為羥丙基甲基纖維素、聚乙二醇400（PEG400）、聚山梨酯80、FeO、TiO2，包衣增重2%～3%。將微晶纖維素、聚維酮K30、羧甲基淀粉鈉過80目篩備用，PZH用氣流粉碎機粉碎，粉碎后測定粒度，控制原料藥物的粒度d0.9≤50 μm。按處方量稱取粉碎的PZH、微晶纖維素、聚維酮K30、羧甲基淀粉鈉（內(nèi)加）置濕法混合顆粒機中混合，攪拌速度為100 r/min，切碎速度設為低速，混合時間為5～10 min；加入適量水溶液，混合攪拌5～10 min，前2 min 攪拌速度為100 r/min，切碎速度設為低速，后3～10 min 攪拌速度為200 r/min，切碎速度設為高速，出料。將所制軟材經(jīng)多功能整粒機（20目）制濕顆粒，60 ℃進行干燥，約1 h后翻轉(zhuǎn)顆粒1次，干燥2 h后，每隔30 min取樣檢測干燥失重，控制干燥失重≤2.0%，切斷電源，冷卻至室溫，出料。干顆粒經(jīng)整粒機（24目）進行整粒。將顆粒與處方量的羧甲基淀粉鈉（外加）和硬脂酸鎂加入總混機中，設定總混轉(zhuǎn)速20 r/min，總混時間15～20 min，出料，稱定質(zhì)量，取樣檢測。取總混后經(jīng)檢驗合格的顆粒，調(diào)整好片重及壓力后進行壓片，控制片硬度9～12 kg，每30 min檢查1次外觀及片重差異。

薄膜包衣預混劑（歐巴代13B575000）水溶液的配制：將歐巴代13B575000加入純化水中，攪拌使之分散，再用機械攪拌器攪拌60 min，使之完全溶脹，100 目篩濾過，除去粗顆粒（以防堵塞噴槍），即制備成固含量10%的歐巴代13B575000水溶液，備用。

包衣：將素片稱量后置于包衣鍋中，設置進風溫度、包衣鍋轉(zhuǎn)速、蠕動泵轉(zhuǎn)速、進風轉(zhuǎn)速和出風轉(zhuǎn)速，以及霧化壓力0.25 MPa，待片床溫度預熱至40 ℃左右，啟動空氣壓縮機，打開空氣閥及膜液閥，調(diào)節(jié)二者流量以適宜的噴霧速度進行噴霧包衣，包衣增重控制在2%～3%，停止包衣，干燥、封存。最后裝瓶。

2.2 PZH自制片中PZH質(zhì)量分數(shù)的測定

2.2.1 色譜條件[9]檢測波長：270 nm；流速：1.0 mL/min；柱溫：35 ℃；流動相：0.1%三乙胺溶液（用磷酸調(diào)節(jié)pH值至6.0）-乙腈（體積比60∶40）；溶劑：50%乙腈。

2.2.2 測定方法 取本品20 片，精密稱定，研細，細粉適量（約含PZH 25 mg）置50 mL 量瓶中，用50%乙腈溶解并稀釋至刻度，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液2 mL置10 mL量瓶中，用50%乙腈溶液稀釋至刻度，搖勻，即得樣品溶液。另取PZH 對照品適量，精密稱定，加溶劑溶解并稀釋制成每1 mL 中約含PZH 0.1 mg 的溶液，作為對照品溶液。精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，按外標法以峰面積計算供試品中PZH的質(zhì)量分數(shù)。自制3 批樣品，每份測定3 次，質(zhì)量分數(shù)測定結果為（99.76±1.03）%。

2.3 PZH原料藥的溶解度測定

PZH 的水溶性較低（美國食品和藥物管理局，2009 年[7]），但其腸道通透性被認為很高（澳大利亞治療用品管理局，2010 年[10]），因此，該藥物在生物藥劑學分類系統(tǒng)（BCS）中被歸類為Ⅱ類化合物，表明其吸收和生物利用度主要受到溶解度的限制，對PZH的溶解性進行研究非常有必要。

2.3.1 PZH原料藥在不同pH溶液中的溶解度 取過量的PZH 原料藥，分別加入以下不同pH 值的溶液中，超聲溶解30 min后，37 ℃水浴保溫24 h，濾過，制成不同pH 值條件下的飽和溶液。加PZH 對照品適量，精密稱定，加50%乙腈溶解，稀釋到相應濃度作為對照品溶液。按“2.2.2”項方法進行測定，結果見表1。可見，PZH 原料藥的溶解度受pH 值影響很大，在pH 2.0以上，最高劑量溶解體積＞胃腸液（250 mL）。

表1 PZH原料藥的溶解度與酸堿度的關系Table 1 Relationship between PZH solubility and pH of solution

2.3.2 PZH原料藥在不同SDS 濃度的乙酸鹽緩沖液（pH 4.5）中的溶解度試驗 采用“2.3.1”項下方法同樣考察PZH原料藥在不同SDS濃度的乙酸鹽緩沖液（pH 4.5）中的溶解度，結果見表2?？梢姡?.75% SDS和1.0% SDS 濃度pH 4.5 乙酸鹽緩沖液最小漏槽體積＜溶出介質(zhì)體積（900 mL），能達到漏槽條件，其他濃度均不能達到漏槽條件。

表2 PZH 原料藥在不同SDS 濃度的乙酸鹽緩沖液（pH 4.5）中的溶解度試驗結果Table 2 Solubility of PZH in pH 4.5 dissolution media with different SDS content

2.4 PZH片溶出度測定方法的建立

2.4.1 檢測波長的選擇 取PZH 對照品適量，用適量的甲醇溶解后，分別用pH 4.5 乙酸鹽緩沖液（含0.75% SDS）、pH 1.2 的鹽酸溶液、pH 4.5 的乙酸鹽緩沖液以及pH 6.8 的磷酸鹽緩沖液稀釋成約含PZH 7 μg/mL 的溶液，照紫外-可見分光光度法（2020 年版《中國藥典》）[11]進行掃描，結果顯示本品在270.8 nm 波長附近均有最大吸收。因此，選擇270 nm作為檢測波長。

2.4.2 專屬性試驗 按20片的處方量稱取除PZH外的各輔料，混合均勻，稱取混合輔料100 mg（約1片的輔料量）置1 000 mL量瓶中，加pH 4.5乙酸鹽緩沖液（含0.75% SDS）900 mL，超聲10 min。取上述溶液適量，經(jīng)0.45 μm 濾膜濾過，取續(xù)濾液3 mL 至100 mL量瓶，加pH 4.5 乙酸鹽緩沖液（含0.75% SDS）稀釋至刻度，搖勻，即得輔料溶液。取輔料溶液在200～400 nm 波長范圍進行掃描，結果顯示輔料在測定波長270 nm 處無吸收，吸光度測定結果為0.000，表明輔料對測定結果無干擾。

2.4.3 濾膜吸附試驗 取“2.4.5”項下溶出液適量，采用高速離心方法，取上清液3 mL置100 mL量瓶中，用溶出介質(zhì)稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液1；另取“2.4.5”項下溶出液適量，分別經(jīng)0.45 μm的微孔濾膜（水系和有機系）過濾，取續(xù)濾液3 mL至100 mL量瓶，用水稀釋至刻度，混勻，作為供試品溶液2和3。

分別取供試品溶液1、2、3，在270 nm 波長處分別測定吸光度，結果為（0.539±0.273）%，表明與離心處理的樣品相比，水系和有機系濾膜過濾的樣品的吸光度基本無差異，濾膜過濾對樣品溶液沒有吸附作用，采用濾膜過濾不會影響溶出度的測定。

2.4.4 標準曲線 精密稱取PZH 對照品約20 mg，置100 mL 量瓶中，加20 mL 甲醇溶解，用pH 4.5 乙酸鹽緩沖液（含0.75% SDS）稀釋至刻度，搖勻，作為標準溶液母液。分別精密量取母液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL 至100 mL 量瓶中，用p H4.5 乙酸鹽緩沖液（含0.75% SDS）稀釋至刻度，搖勻，分別制成約含PZH 為2、4、6、8、10 μg/mL 的標準溶液。取上述標準溶液，以pH 4.5 乙酸鹽緩沖液（含0.75% SDS）為空白，在270 nm 波長處分別測定其吸光度，以吸光度為縱坐標、質(zhì)量濃度為橫坐標繪制標準曲線，得回歸方程y=0.075x+0.005 7，r2=0.999 5，表明PZH在2.01～10.05 μg/mL 濃度范圍內(nèi)與吸光度線性關系良好。

2.4.5 精密度試驗 取本品3片（批號：20180122），照“2.5”項下的測定方法操作，于45 min 時取溶出液，經(jīng)0.45 μm 濾膜濾過，分別量取續(xù)濾液3 mL 至6 個100 mL量瓶，用溶出介質(zhì)稀釋至刻度，搖勻，即得供試品溶液。分別在270 nm的波長處連續(xù)測定吸光度值6次，經(jīng)計算RSD為0.220%，表明本法精密度良好。

2.4.6 穩(wěn)定性試驗 取“2.4.5”項下的供試品溶液，分別在室溫下于0、1、2、4、6、8、10 h 時，在270 nm波長處測定其吸光度值，經(jīng)計算溶液吸光度的RSD 值為0.192%，表明在室溫下放置10 h 溶液穩(wěn)定性良好。

2.4.7 回收率試驗 分別精密稱取PZH 對照品約0.54 g（50%）、0.87 g（80%）、1.19 g（110%）置①、②、③號研缽中，再取“2.4.2”項下的混合空白輔料，分別精密稱取空白輔料約0.5 g（約相當于5 片的輔料量）置3個研缽中，研勻。從①號研缽中精密稱取細粉3份（約含PZH 10.8 mg），從②號研缽中精密稱取細粉3份（約含PZH 17.3 mg），從③號研缽中精密稱取細粉3 份（約含PZH 23.8 mg），將上述9 份細粉分別置100 mL量瓶中，加溶出介質(zhì)適量，超聲15 min，用溶出介質(zhì)稀釋至刻度，搖勻；取上述樣品溶液，經(jīng)0.45 μm 的微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，分別加溶出介質(zhì)定量稀釋至含PZH約7μg/mL的樣品溶液。照紫外-可見分光光度法，在270 nm 波長處分別測定吸光度。

取PZH 對照品適量，精密稱定，加甲醇適量溶解，用溶出介質(zhì)定量稀釋制成每1 mL 約含PZH 7 μg/mL 的對照品溶液，同法測定。計算回收率與相對標準偏差，結果見表3?？梢?，PZH 的平均回收率為99.56%，RSD 為1.10%，表明測定方法準確度好，所用輔料對PZH片的溶出度檢測無影響。

表3 PZH回收率試驗結果Table 3 Recovery results of PZH（n=3）

2.5 PZH片溶出度的測定

按照《中國藥典》2020 年版第四部通則的溶出度與釋放度測定法中的槳法進行測定。

2.5.1 溶出介質(zhì)的考察 分別對原研PZH 片和自制PZH 片（批號：20180210）在水、0.1 mol/L 鹽酸溶液、pH 6.8 磷酸鹽緩沖液、pH 4.5 乙酸鹽緩沖液（含0.75%SDS）4 種介質(zhì)中溶出曲線進行了考察，結果見圖2?？梢姡衅妥匝衅?.1 mol/L 鹽酸溶液中溶出較快，15 min 內(nèi)均基本完全溶出。原研片與自研片溶出曲線相似度過高，該介質(zhì)對不同產(chǎn)品的區(qū)分性不強。原研片和自研片在pH 4.5 乙酸鹽緩沖液（含0.75% SDS）中45 min 基本釋放完全，釋放速度適中。

圖2 不同溶出介質(zhì)中自制PZH片與原研片的溶出度曲線Figure 2 Dissolution curves of generic PZH tablets and Votrient?in different dissolution media（n=6）

2.5.2 溶出介質(zhì)SDS 濃度的考察 在“2.3.2”項溶解度試驗中已證明在溶出介質(zhì)中加入一定量的SDS，有助于PZH 的溶出。FDA 相關資料中公開的溶出介質(zhì)為含有0.75% SDS 的pH 4.5 乙酸緩沖液。為了進一步驗證不同SDS 濃度對自制PZH 片溶出曲線的影響，考察原研片和自制PZH 片在不同SDS 濃度的pH 4.5 乙酸鹽緩沖液的溶出曲線，結果見圖3?？梢姡衅c自制PZH 片在不加SDS、0.2%和0.5% SDS 濃度的pH 4.5 乙酸鹽緩沖液中45 min 溶出量均在80%以下，不能保證主藥的完全溶出，分析原因是主藥在上述介質(zhì)中的溶解度未達到漏槽條件。因此，0.75% SDS 濃度的pH 4.5 乙酸鹽緩沖液中作為本品溶出介質(zhì)較為適合。

圖3 自制PZH 片與原研片在不同SDS 濃度的乙酸鹽緩沖液下的溶出度Figure 3 Dissolution curves of generic PZH tablets and Votrient?in acetate buffer with different SDS content（n=3）

2.5.3 轉(zhuǎn)速的考察 根據(jù)《仿制藥質(zhì)量一致性評價普通口服固體制劑溶出曲線測定與比較指導原則（草案）》中槳法推薦的轉(zhuǎn)速為50～75 r/min。因此選擇50 r/min 和75 r/min 2 個轉(zhuǎn)速進行比較，結果見圖4?？梢姡衅妥匝蠵ZH 片在50 r/min 的條件下，45 min時溶出量均低于80%，主藥不能完全溶出，該轉(zhuǎn)速不適宜本品溶出度的測定，因此，確定75 r/min作為溶出度測定的轉(zhuǎn)速。

圖4 自制PZH片與原研片在不同轉(zhuǎn)速下的溶出度Figure 4 Dissolution curves of generic PZH tablets and Votrient?at different rpm（n=3）

2.5.4 3 批自制PZH 片的溶出度測定 為了考察產(chǎn)品溶出釋放的均一性，對3 批樣品的批間溶出均一性進行測定，以pH 4.5 乙酸鹽緩沖液（含0.75% SDS）900 mL 為溶出介質(zhì)，轉(zhuǎn)速為75 r/min，依法操作，分別于5、10、15、30、45、60 min，取溶液經(jīng)0.45 μm 濾膜濾過，取續(xù)濾液3 mL 置100 mL 量瓶中，用溶出介質(zhì)稀釋并定容，搖勻，即得供試品溶液；照紫外-可見分光光度法，在270 nm 的波長處分別測定吸光度。

另取PZH 對照品適量，精密稱定，加甲醇適量溶解，用溶出介質(zhì)定量稀釋制成每1 mL 約含PZH 7 μg/mL 的對照品溶液，同法測定，計算每片的溶出量。限度為標示量的80%，應符合規(guī)定。結果見圖5。結果顯示3批樣品重現(xiàn)性好。

圖5 3批自制PZH片與原研片的溶出度測定Figure 5 Dissolution curves of generic PZH tablets and Votrient?（n=6）

2.6 自制PZH片與原研片溶出曲線相似性比較

根據(jù)圖5自制PZH片和原研片的溶出度數(shù)據(jù)進行分析，自制PZH片與原研片（Votrient）的體外溶出行為基本一致。按照計算相似因子（f2）方法，溶出達到85%以上的時間點只能選取1個，且時間點不少于3 個，所以，選擇5、10、15、45 min 這4 個時間點進行f2值的計算：

式中：T和R分別為仿制藥和原研藥的各取樣點的平均溶出度，n為取樣點個數(shù)。當f2因子數(shù)值介于50～100 時，認為兩條曲線相似[12]。結果顯示：自制PZH 片與原研片（Votrient）在溶出介質(zhì)中溶出曲線的f2值為68，相似因子大于50，表明自制PZH 片與原研片溶出曲線具有相似性。

3 討論

在體外溶出度考察中，原研片和自研PZH 片在水中的溶出度，在15～30 min 取樣檢測點達到最高值（60%左右），后續(xù)取樣點的溶出度開始降低。分析原因為PZH 在水中溶解度較?。◣缀醪蝗埽?，未達到漏槽條件，導致PZH 不能完全溶出；后續(xù)取樣點樣品檢測的溶出度降低，可能是樣品達到過飽和濃度后，PZH 開始析出，導致溶出液中藥物濃度降低。原研片和自研片在pH 6.8 磷酸鹽緩沖液溶出量在3%以下，后續(xù)取樣點的溶出度開始降低，與在水介質(zhì)的原因基本一致。因為PZH 在pH 6.8 磷酸鹽緩沖液的溶解度小于水中的溶解度，所以溶出量更少。

原研制劑和自研PZH 片在0.1 mol/L 鹽酸溶液中溶出較快，15 min內(nèi)均基本完全溶出，所以導致原研片與自研片溶出曲線相似度過高，該介質(zhì)對不同產(chǎn)品的區(qū)分性不強。原研片和自研片在pH 4.5乙酸鹽緩沖液（含0.75% SDS）中45 min 基本釋放完全，釋放速度適中。因此，作為本品溶出介質(zhì)，PZH 能完全溶出，且釋放速度適中，區(qū)分性較強。

綜上所述，本研究根據(jù)原研片處方制備了PZH片，并建立了制劑中PZH 的體外溶出度的紫外分光光度法，所建立的方法簡便、準確，適合PZH 片的體外溶出度測定。同時，比較了原研片和自制PZH 片在不同溶出介質(zhì)中的溶出行為，得出最適合的溶出介質(zhì)為pH 4.5 乙酸鹽緩沖液（含0.75% SDS）。最后，比較了自制PZH 片與原研片的溶出度，顯示二者溶出具有相似性。本研究對自制PZH 片體外溶出度行為的考察，為PZH 的進一步開發(fā)提供了基礎性數(shù)據(jù)。